Name: Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a medir a endocitose de vesículas sinápticas em neurônios hipocampais usando microscopia eletrônica. Este método oferece alta resolução para visualizar dinâmicas vesiculares e estruturas celulares completas.

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Agradecemos o Dr. Yong-Ling Zhu por prevê construção Sinaptofisina-pHluorin2x e Dr. James E. Rothman fornecendo VAMP2-phluorin. Agradecemos o Dr. Susan Cheng e Virginia Crocker da facilidade de microscopia eletrônica de NINDS pelo apoio técnico e ajuda. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso Intramural Research Program nos EUA e uma bolsa da KRIBB iniciativa programa de pesquisa (Korean biomédica cientista Fellowship Program), Instituto de pesquisa da Coreia do Biociências e biotecnologia, República da Coreia.

Nota: O seguinte protocolo descreve os métodos de imagem pHluorin e métodos EM neurônios hippocampal culta. pHluorin monitores vesícula sináptica proteína absorção em células vivas e EM detecta a absorção da vesícula sináptica e as alterações ultra-estruturais.
 cuidados com animais e procedimento seguiu as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados do Animal NIH.
 1. pHluorin Imaging <ol><li>cultura neurônio Hippocampal <ol><li>preparar hipocampo Buffer (HB) combinando NaHCO 3 de 4 mM e 5 mM HEPES e ajustar o pH 7.3 com 5 M de NaOH. Fazer o meio de cultura misturando neurobasal médio, 2% B27, 0.5 mM L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina. Além disso, prepare uma mistura do buffer de HB com 20% de soro Fetal bovino (HB/20% FBS). 
		Nota: Este protocolo cultivo baseia-se na Serra, et al 29 e Wu et al 24</li> <li>decapitar filhotes de rato entre pós-Natal dia 0 ao dia 2 em meio de cultura e extrair o cérebro em 4 ° C HB/20% FBS. Retire o tronco cerebral e tálamo para expor o hipocampo. Dissecar para fora o hipocampo, após expor-lo pela remoção do tronco cerebral e tálamo e transferir para a 4 ° C HB/20% FBS. 
		Nota: Normalmente, o rendimento é em torno de 4 x 10 5 células/mL para um filhote de cachorro (dois hipocampo). Limpar as membranas aderente, usando uma pinça ou tesoura, então a transferência para a 4 ° C HB/20% FBS. Desenrole o giro denteado e isolar o subiculum cortando com uma tesoura e, em seguida, transferir a 4 ° C HB/20% FBS.</li>
		<li>Dividir cada hipocampo, por um corte de ponta a ponta, em cerca de 10 fatias e transfira para um tubo cónico polipropileno de 15 mL.</li>
		<li>Depois permitindo que o tecido resolver, lavar com 10 mL de HB/20% FBS e depois lavar três vezes com 10ml de HB.</li>
		<li>Preparar a solução de digestão de 137 mM de NaCl, 5 mM KCl, 7mm Na2HPO 4 e 25mm HEPES e ajustar o pH 7.2 com 5 M de NaOH. Retire o sobrenadante do hipocampo. Adicionar 2 mL de solução de digestão 10 mg de tripsina e 1 mg de DNase e filtrar através de uma membrana esterilizada 0,22 µm diretamente sobre a pelota amostra.</li>
		<li>Incubar o hipocampo por 5 min a 37 ° C, em seguida, lave duas vezes com 10 mL de HB/20% FBS e então lave uma vez com 10 mL de HB.</li>
		<li>Dissociar as células com 6 mg de MgSO 4 &#8729; 7 H 2 O e 1 mg de DNase 2ml HB e filtro estéril sobre o hipocampo de pelotas através de um filtro de 0,22 µm estéril. Delicadamente, dissocia as células por moer cuidado, enquanto tendo o cuidado de evitar a introdução de bolhas de ar. Permitir que as partículas de tecido repousar por 2 min e em seguida lentamente transfira o sobrenadante para outro tubo.</li>
		<li>, Adicionar 3 mL HB/20% FBS para a suspensão de células e centrífuga ou 10 min a 4 ° C e 1.000 rpm. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em meio de cultura.</li>
		<li>Placa de 60.000 células suspendidas em meio de cultura de 150 µ l sobre uma lamela de diâmetro de 25 mm de poli-D-lisina revestido, sem derramamento da lamela. Adicione 2 mL de meio de cultura previamente aquecido 2 h após chapeamento. As lamelas são mantidas em placas de cultivo de 6 boas ou pratos de Petri estéril.</li>
		<li>Células mantêm a 37 ° C em um 5% CO 2 humedecidas incubadora em meio de cultura por 14-21 dias antes da gravação. Durante o crescimento da cultura, mudar a metade superior do meio duas vezes por semana.</li>
	</ol></li> <li>Transfection <ol><li>6-7 dias após o chapeamento, transfect Sinaptofisina-pHluorin 2 X (SpH) ou VAMP2-pHluorin em neurônios hippocampal. Para SpH, use um promotor de citomegalovírus (CMV), inserido em um vetor de pcDNA3 30. Para VAMP2-pHluorin, use um promotor CMV inserido em um vetor de pCI 31.</li>
		<li>Transfect qualquer vector por transportadora de lipídios em células-alvo, usando 1 µ g de plasmídeo. Use o meio de cultura de passo protocolo 1.1.1, que carece de soro, para o transfeccao. Alterar o meio 2 h após a transfeccao para reduzir a toxicidade. 
		Nota: Em caso de baixa expressão da SpH nos boutons, aumente a concentração de DNA de 2 µ g ou o tempo de incubação com a transportadora de lipídios, a menos que as células são insalubres. Normalmente, as células 4-10 (0,006-0,008%) de neurônios foram transfectadas.</li>
	</ol></li> <li>Microscopia de luz <ol><li>preparar solução salina normal é composto por 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25mm HEPES (pH 7,4), glicose de 30 mM, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0.01 mM CNQX) e 0,05 mM ácido DL-2-amino-5-phosphonovaleric (AP5). Leve uma lamela da placa de meio de cultura e coloque em uma câmara de imagem que permite a estimulação do campo, usando lubrificante e selante para evitar vazamentos. Evite deixar o vidro seco durante a transferência de uma lamela da placa para a câmara, adicionando imediatamente a solução salina normal de 750 µ l. 
		Nota: CNQX AP5 utilizaram e bloquear a atividade pós-sináptica, que tem o potencial para atividade recorrente. Antes de colocar uma câmara em um microscópio de fluorescência invertido, use lenço de limpeza para confirmar que a câmara não vaza. Vazamento lento provoca alterações de foco durante a gravação, pela mistura de óleo normal saline e imersão, que resulta em mudanças no índice de refração.</li>
		<li>Estimulação e gravação de imersão de óleo <ol><li>imagem em um microscópio invertido widefield com um 60 X (1.4 abertura numérica) lente com uma lâmpada de iodetos metálicos. Visualizar pHluorin com um filtro definido para um pico de excitação de 480 nm, um espelho de passe longo 490 nm, um filtro de emissão 500-550 nm e um obturador manual de aleta. Capturar imagens cada 100 ms, com binning 2x2, usando uma câmera de elétron multiplicando carga acoplado dispositivo (EMCCD). 
			Nota: Vários recursos devem ser considerados para atingir as condições apropriadas para evitar fotobranqueamento, incluindo o intervalo de captura de imagem e filtrar e binning, que são dependentes de equipamentos. No caso da imagem latente confocal, tempo de alimentação e exposição do laser deve ser considerado para evitar fotobranqueamento. A instalação foi determinada após a gravação de pelo menos 3 min sem estímulo e a gravação foi realizada pelo menos 10 s sem estímulo para verificar se há fotobranqueamento.</li>
			<li>Escolher uma área com alta densidade de boutons para facilidade de análise em cada experimento. Identificar células transfectadas por seu sinal de fluorescência verde, com ênfase em padrões de expressão redondas ou ovais no bouton e expressão contínua entre boutons.</li>
			<li>Induzir endocitose por estimulação de campo usando um 1 pulso de ms, 20 mA ação potencial (AP) fornecida a partir de um estimulador de pulso e entregues através de um eletrodo de platina dentro da unidade de isolamento de estímulo. Atividade de fluorescência da imagem no decorrer da estimulação e durante a recuperação celular. 
			Nota: No caso de células mortas, expressão foi mais forte do que viver boutons e mostrou um padrão desigual entre boutons.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Análise de imagem <ol><li>Para analisar a intensidade de fluorescência em um único bouton, definido por uma região de interesse (ROI) como uma de 1,5 x 1,5 µm quadrados; o tamanho de um bouton é dentro traços cerca 1,5 µm. uso antes da estimulação para verificar fotobranqueamento e subtrair como pano de fundo.</li>
		<li>Normalize fluorescência muda (ΔF) com a equação: <img alt="Equation" height="11" src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" width="172" /> onde F máx e F 0 referem-se a máximo aumento após estimulação e fluorescência de base, respectivamente. Medir as endocitose taxas como a taxa de decaimento durante os primeiros 4-10 s após o ponto máximo da fluorescência de pHluorin. Obter a constante de tempo (τ) de endocitose por encaixe o decaimento de fluorescência pHluorin do pico aumento da linha de base com uma mono-exponencial função.</li>
	</ol></li></ol> 2. Microscopia eletrônica de <ol><li>Prepare uma poli-D-lisina revestido 6 placa aplicando 1,5 mL de solução de poli-D-lisina 0,01% estéril filtrada a cada poço por 1h à temperatura ambiente e, em seguida, lavar três vezes com água esterilizada. Dissecar, cultura e manter os neurônios hippocampal como em etapas 1.1.1, 1.1.2 e 1.1.3, respectivamente.</li>
	<li>Prepare uma solução de estimulação K + alta com HRP como 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25mm HEPES (pH 7,4), glicose de 30 mM, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 e 5 mg/mL HRP, então ajustam o pH 7,4 com 5 M NaOH.
	Solução de estimulação de K + <ol><li>estimular a cultura de neurônio hippocampal com 1,5 mL de alta à temperatura ambiente (referida como K +) por adição de 1,5 mL para cada poço para 90 s. Na condição de repouso (referida como R), aplicar a mesma concentração de 5mg/mL HRP para 90 s, mas com solução salina normal. Para o exemplo de recuperação, aplicar solução de estimulação alta K + como com a amostra de K +, em seguida, rapidamente lavar substituir com solução salina normal e incubar durante 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Fixação e coloração <ol><li>preparar o tampão de cacodylate at 0,1 M usando at cacodylate de 21,4 g/L pH 7,4. Consertar as células com 4% de glutaraldeído no buffer de cacodylate at 0.1 M pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Lavar três vezes com 0,1 M at cacodylate o buffer para 7 min cada.</li>
		<li>Solução de preparar diaminobenzidina (DAB), composto de 0,5 mg/mL de DAB com 0,3% H 2 O 2 em ddH 2 O e filtrar com um filtro de 0,22 µm. Aplicar 1,5 mL de solução DAB por 30 min a 37 ° C. lavar três vezes com 0,1 M at cacodylate o buffer para 7 min cada. 
		Cuidado: DAB é um carcinógeno tóxico e suspeito. Por favor, use luvas e jalecos. 
		Nota: Etiquetando com DAB ocorre devido à sua oxidação por H 2 O 2, como catalisada por HRP. Pequenos aumentos nos componentes resultam em um sinal de aumento na amostra. Aumentando a concentração de HRP acelera o efeito do catalisador. Suficientemente grandes concentrações de H 2 O 2 permitem debilitante reações colaterais com HRP, inibindo o efeito da rotulagem 32. Neste trabalho, as concentrações deste sistema de rotulagem foram escolhidas com base na pesquisa atualmente disponíveis 33 , 34.</li>
		<li>Incubar os neurônios com 1,5 mL de 1% OsO 4 no buffer de cacodylate at 0,1 M por 1 h a 4 ° C, como fixação de postar. Lavar três vezes com 1,5 mL de tampão de cacodylate de nd de 0,1 M por 7 min cada. 
		Atenção: Devido à toxicidade e reatividade de OsO 4, mantendo a amostra no gelo em uma capa de química é preferível em muitos casos usar uma geladeira para a incubação.</li>
		<li>Preparar 0,1 M de tampão de acetato de sódio com 13,61 g/L de sódio acetato e 11,43 mL/L de ácido acético glacial em pH 5,0. Lavar três vezes com tampão de acetato 1,5 mL 0,1 M em pH 5.0 para 7 min cada e incubar com acetato de uranilo 1,5 mL 1% em tampão de acetato 0,1 M em pH 5.0 para 1 h a 4 ° C. Wash três vezes com tampão de acetato 1,5 mL 0,1 M por 7 min cada.</li>
	</ol></li> <li>Epóxi incorporação <ol><li>desidratar a cultura neurônio com lavagens único 1,5 mL de etanol a 50%, 70% e 90%, para 7 min em cada um e em seguida 3 lavagens de 1,5 mL de etanol a 100% por 7 min em uma coifa.</li>
		<li>Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) epóxi resina, anidrido de 160 mL/L dodecenilo succínico (DDSA), 340 mL/L metil-5-Norborne-2,3-dicarboxílico fenol 2.4.6-tris (dimetilaminometil) anidrido (NMA) e 15 mL/L (DMP-30) para criar o epóxi resina. Mistura cuidadosamente, em seguida, armazenar sob vácuo para remover as bolhas de ar. 
		Nota: É fundamental para remover as bolhas de ar na resina, especialmente aqueles de menor do que é visível a olho nu, porque eles podem causar cáries na resina durante o corte.</li>
		<li>Infiltrar a amostra, substituindo o etanol com epóxi de 50% de resina em etanol por 30 min à temperatura ambiente em um shaker, então 70% epóxi resina em etanol por 30 min à temperatura ambiente num agitador.</li>
		<li>Interruptor o epóxi resina solução com resina epóxi de 100% e incubar durante 10 min a 50 bolsas de executar 2 ° C. de resina epóxi de 100% fresco com incubação por 1h em 50 ° C. Adicionar fresco 100% epóxi resina e permite a endurecer a 50 ° C durante a noite e depois no 60 & #17 6. o; C por mais de 36 h endurecer.</li>
	</ol></li> <li>Retire a placa de muti cada amostra com um joalheiro &#39; Serra de s. Selecione as regiões de interesse, densas concentrações de células, usando um microscópio invertido e depois cortar blocos de 70 a 80 nm para secionar pelo micrótomo. Montar a região de corte no mandril de micrótomo e carregar o micrótomo. Posicione o chuck em micrótomo e montar uma faca de diamante com a borda paralela à superfície do bloco. Recolher seções de espessura de 70 a 80 nm diretamente sobre grades individuais.</li>
	<li>Dissolver acetato de uranilo em água para uma solução de 1%, em peso e separadamente dissolver o citrato de chumbo na água para uma solução de 3% em peso. Counterstain as seções por submersão com acetato de uranilo aquosa de 1% por 15 min e, em seguida, citrato de chumbo aquoso 3% por 5 min aumentar o contraste das amostras.</li>
	<li>Imagem EM <ol><li>examinar as seções com um microscópio eletrônico de transmissão e gravar imagens com uma câmera digital CCD em uma ampliação primária de 10.000-20, 000 X 3.</li>
	</ol></li> <li>Estatísticas <ol><li>executar um t-teste para identificar diferenças significativas comparando-se a média e o desvio-padrão de medida (no MEV mostrou) entre o controle e amostras experimentais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui demonstramos dois métodos para monitorar a endocitose da vesícula sináptica. O primeiro método, temos monitorado pHluorin fundiu-se com uma proteína de vesícula sináptica nos neurônios transfectadas e posteriormente eletricamente estimulado. Em segundo lugar, usamos EM imagem latente de captação HRP como induzida por KCl. Usamos diferentes estímulos por duas razões. Primeiro, aplicação elevada de potássio induz a despolarização dos neurônios todos na cultura. Isso facilita o exame EM, dado que a nossa metodologia EM...

Os neurotransmissores são armazenados em vesículas sinápticas e liberados por exocitose. A membrana da vesícula sináptica e a proteína são então internalizadas por endocitose e reutilizadas na próxima rodada de exocitose. Endocitose das vesículas sinápticas é importante para a manutenção de piscinas de vesícula sináptica e remove salientes vesículas de membrana plasmática. O pHluorin sensíveis ao pH proteína verde fluorescente, que é saciada em circunstâncias ácidas e dequenched em pH neutro, tem sido usado para medir tempo de endocitose cursos em vivem células1,2,3. A proteína de pHluorin normalmente é unida ao lado lumenal das proteínas de vesículas sinápticas, tais como Sinaptofisina ou VAMP2/synaptobrevin da. No resto, pHluorin é extinguido no lúmen 5.5 pH das vesículas sinápticas. Fusão de vesículas para a membrana plasmática apresenta o lúmen vesicular à solução extracelular onde o pH é ~ 7.3, resultando em um aumento na fluorescência do pHluorin. Após a exocitose, decompõe-se o aumento da fluorescência, devido a endocitose das proteínas de vesículas sinápticas seguido por re-acidificação de vesículas dentro dessas vesículas recuperadas. Embora a decadência reflete tanto a endocitose e a re-acidificação vesicular, principalmente reflete endocitose, porque re-acidificação é mais rápido que endocitose na maioria das condições1,4. A constante de tempo de re-acidificação é 3-4 s ou menos5,6, que é geralmente mais rápido que o 10 s ou mais necessários para vesículas endocitose4,5. Se experimentos são necessários para distinguir a endocitose de re-acidificação, ácidos resfriamento experimentos usando a solução de (MES) ácido 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) com um pH de 5,5 podem ser usados para determinar se as proteínas de vesículas sinápticas são recuperadas da membrana plasmática através de endocitose1,3,4. Assim, o aumento de intensidade de fluorescência pHluorin reflete um equilíbrio de exo e endocitose, e a diminuição após a estimulação do nervo especificamente reflete endocitose.
pHluorin imagem pode ser usada não apenas para medir o tempo de curso de endocitose, mas também o tamanho da vesícula sináptica piscinas7,8, e9de lançamento a probabilidade de lançamento evocado e espontânea. Muitos fatores e proteínas envolvidas na regulação da endocitose, tais como cálcio, solúvel NSF-acessório da proteína do receptor (SNARE) proteínas, neurotrófico derivado do cérebro factor(BDNF) e calcineurina foram identificadas usando pHluorin de imagens1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Além disso, a liberação do neurotransmissor pode ser detectada nos neurônios não apenas primários, mas em células de neuroblastoma com TIRFM17. Recentemente, pHTomato, dsRed, mOrange e variantes de pHluorin foram desenvolvidos para o monitoramento de gravações simultâneas de vários fatores em uma única sinapse18,19. Por exemplo, pHTomato tem sido fundido com Sinaptofisina e usado com um indicador de cálcio geneticamente codificado (GCaMP5K) para monitorar fusão de vesícula pré-sináptica e Ca2 + influxo no compartimento pós-sináptica20. Portanto, pHluorin ligado a proteínas sinápticas fornece um método útil para analisar a relação entre endocitose e exocitose.
É outro método comumente usado para estudar a endocitose, devido a alta resolução espacial que mostra as alterações ultra-estruturais durante a endocitose. Duas áreas gerais são a capacidade de visualizar as alterações patológicas dentro de células neuronais21 e faixa de proteínas de vesícula22. Em particular, a observação da absorção da vesícula sináptica, curvatura de membrana revestida por Clatrina na zona de periactive, e CDDP estruturas são possíveis com EM3,23,24,25 ,26,,27,28. Enquanto EM envolve artefatos potenciais, tais como malformações induzidas pelo fixador, que pode afetar a endocitose e análise de dados é de trabalho intensivo, que a resolução prevê uma oportunidade atraente para visualizar a estrutura celular. Potenciais problemas de fixador e a limitação em resolução temporal EM podem ser superados por alta pressão, congelamento, fornecendo um método rápido e não-químicas de estabilizar as delicadas estruturas presentes durante a endocitose27.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina LTX com Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>Transfecção de DNA plasmidial incluindo sinaptofisina ou VAMP2-pHluorin</td></tr><tr><td>meio neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>Meio de crescimento para neurônio, Aqueça até 37&deg; C antes do uso</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504-044</td><td>Gradiente para diferenciação neuronal</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td>Gradiente para cultura neuronal</td></tr><tr><td>lamínula revestida com poli-D-lisina</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td><td>Substrato para crescimento neuronal e imagem de pHluorina</td></tr><tr><td>Tripsina XI do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td>Neuronal tecidos hipocampais digeridos por cultura</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025</td> Estimulador de pulso de <td>suspensão de células viscosas</td></tr><tr>com<td>inibição</td> de cultura neuronal <td>A-M modelo</td><td>2100</td><td>Aplicar estimulação elétrica</td></tr><tr><td>Banho com fenda com estimulação de campo</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td> Aplicar unidade <td></td></tr><tr><td></td><td>de isolamento de estímulo de estimulação elétricaWarner Instruments</td><td>SIU102</td><td>Aplique</td></tr><tr><td>lubrificante</td> de estimulação elétrica <td>Dow corning</td><td>111</td><td>pHluorin imaging-seal com lamínula e câmara de imagem, evite vazamento da câmara</td></tr><tr><td>AP5</td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>Gradiente para solução salina normal, antagonista seletivo do receptor NMDA, inibe a atividade pós-sináptica que tem potencial para atividade recorrente</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>Gradiente para solução salina normal, antagonista competitivo do receptor AMPA/cainato, inibe a atividade pós-sináptica que tem potencial para atividade recorrente</td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fonte de luz de iodetos metálicos para câmera pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3</td><td>imagens de pHluorin, detecção de intensidade de fluorescência pHluorin</td></tr><tr><td>Microscopia invertida</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Imagiologia para sinaptofisina ou células transfectadas com pHluorina VAMP2</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Software de pesquisa avançada</td><td>para aquisição e análise de imagens</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Software para análise de imagens e apresentação de dados</td></tr><tr><td>câmara de imagem</td><td>Warner Instruments</td><td>RC21B</td><td>pHluorin imaging, aplicar estimulação de campo em células vivas</td></tr><tr><td>poli-l-lisina</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Microscopia eletrônica, substrato para crescimento neuronal, aplicar em placa multipoços por 1 h à temperatura ambiente e depois lavar com água esterilizada 3 vezes</td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano (HRP)</td> <td>Sigma</td><td>P6782</td><td>Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas catalisando DAB na presença de peróxido de hidrogênio, concentração final é de 5 mg / mL em solução salina normal, fazer fresco antes do uso</td></tr><tr><td>Cacodilato</td> <td>de NaMicroscopia eletrônica Sciences</td><td>12300</td><td>Microscopia eletrônica, tampão para fixadores e lavagem, concentração final é 0,1 N</td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina(DAB)</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td>Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas, substrato para HRP, concentração final é de 0,5 mg/mL em DDW e filtrada, fazer fresco antes</td></tr><tr><td>do uso Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas induzindo a reação HRP-DAB, a concentração final é de 0,3% em DDW, faça fresco antes</td></tr><tr><td>de usar glutaraldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>16365</td><td>Microscopia eletrônica, fixadores, concentração final é de 4% em tampão Na-cacodilato, faça fresco antes de usar, agite bem antes de usar</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>Microscopia eletrônica, imagem de vesículas endocitadas e alterações ultraestruturais</td></tr><tr><td>Câmera digital CCD</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>Microscopia eletrônica, captura de imagens</td></tr><tr><td>Citrato de chumbo</td><td>Leica microssistemas</td><td>16707235</td><td>Microscopia eletrônica, coloração de grade</td></tr></tbody></table>

medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios hippocampal culturas

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Durante a endocitose, fundidas vesículas sinápticas são recuperadas em terminais nervosos, permitindo a reciclagem de vesículas e, portanto, a manutenção da transmissão sináptica durante o disparo repetitivo do nervo. Endocitose prejudicada em condições patológicas leva a diminuições em funções sinápticas de força e cérebro. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para medir a endocitose da vesícula sináptica na sinapse hippocampal mamífera na cultura neuronal. Temos monitorado endocitose de proteínas de vesícula sináptica pela fusão de uma proteína de membrana vesicular sináptica, incluindo Sinaptofisina e VAMP2/synaptobrevin da, o lado lumenal vesicular, com pHluorin, uma proteína fluorescente verde sensíveis ao pH que aumenta sua intensidade de fluorescência como o pH aumenta. Durante a exocitose, pH do lúmen vesicular aumenta, Considerando que durante o lúmen vesicular endocitose pH é re-acidificado. Assim, um aumento da intensidade de fluorescência pHluorin indica fusão, enquanto uma diminuição indica endocitose da proteína rotulados vesícula sináptica. Além de usar o pHluorin método de imagem para gravar endocitose, temos monitorado endocitose da membrana vesicular por microscopia de elétron (EM) medições de absorção de Horseradish peroxidase (HRP) por vesículas. Finalmente, temos monitorado a formação dos poços de membrana terminal do nervo em vários momentos após a despolarização induzida por potássio alto. O tempo de curso de formação de poço de captação e membrana HRP indica o tempo de curso de endocitose.

Usando o método de transportadora de lipídios, SpH foi expressa em neurônios hippocampal, permitindo a identificação de boutons (Figura 1a). Estimulação elétrica das células induzidas por exocitose e um correspondente aumento na intensidade de fluorescência. O aumento na fluorescência (ΔF) foi interrompido por encerrar o estímulo (Figura 1b). O aumento da fluorescência foi seguido por uma diminuição lenta, devido a endocitose. No...

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

O objetivo geral desta metodologia de marcação é medir a endocitose de vesículas sinápticas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como a dispersão de vesículas endocíticas formadas. A principal vantagem desta técnica é a resolução durante a obtenção de imagens e a visualização de alterações mediante a análise da estrutura completa de uma célula.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem remover pequenas bolhas de ar ao preparar o epóxi ou desidratam a amostra durante as lavagens com etanol. Para iniciar este procedimento, prepare uma placa de seis poços revestida com poli-d-lisina aplicando 1,5 mililitro de solução estéril filtrada de poli-d-lisina 0,01% em cada poço durante uma hora à temperatura ambiente, depois lave três vezes com água esterilizada. Em seguida, prepare uma solução de estimulação com alto teor de potássio contendo peroxidase de rábano-picante e ajuste a solução para pH 7,4 com hidróxido de sódio 5 molar.Em seguida, estimule a cultura de neurônios do hipocampo adicionando 1,5 mililitros de solução estimulante de alto potássio a cada poço, à temperatura ambiente, durante 90 segundos

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

Este vídeo demonstra o procedimento para preparar neurônios cultivados para análise óptica de vesículas sinápticas recicladas. O processo envolve marcação de fluorescência de proteínas de vesículas sinápticas e imunocoloração para rotular e visualizar as vesículas recicladas dentro dos neurônios.

Preparação de neurônios cultivados para análise óptica de vesículas sinápticas recicladas

Fonte: Villarreal, S., et. al., Medindo a endocitose da vesícula sináptica em neurônios do hipocampo cultivados. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a análise da endocitose de vesículas sinápticas em neurônios do hipocampo cultivados por meio de marcação de peroxidase de rábano e microscopia eletrônica.

Imagem Microscópica Eletrônica de Transmissão da Endocitose da Vesícula Sináptica em Neurônios do Hipocampo de Camundongos 

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido...

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Aprenda a medir a endocitose de vesículas sinápticas em neurônios hipocampais usando microscopia eletrônica. Este método oferece alta resolução para visualizar dinâmicas vesiculares e estruturas celulares completas.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

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