Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

O objetivo geral desta metodologia de marcação é medir a endocitose da vesícula sináptica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a dispersão de vesículas endocíticas formadas. A principal vantagem desta técnica é a resolução durante a imagem e a visualização das alterações examinando a estrutura completa de uma célula.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem remover pequenas bolhas de ar enquanto preparam o epóxi ou secam a amostra durante as lavagens com etanol. Para iniciar este procedimento, prepare uma placa de seis poços revestida com poli-d-lisina aplicando 1,5 mililitros de solução de poli-d-lisina filtrada a 0,01% estéril em cada poço por uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, lavando-o três vezes com água esterilizada. Em seguida, prepare uma solução de estimulação com alto teor de potássio com peroxidase de rabanete e ajuste a solução para pH 7,4 com hidróxido de sódio de cinco molares.

Depois disso, estimule a cultura de neurônios do hipocampo adicionando 1,5 mililitros de solução de estimulação com alto teor de potássio a cada poço em temperatura ambiente por 90 segundos. Nesta etapa, prepare um tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar em pH 7,4. Fixe as células com 4% de glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, lave as células três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos.

Em seguida, prepare a solução DAB e filtre-a com um filtro de 0,22 micrômetro. Em seguida, aplique 1,5 mililitros de solução DAB nas células por 30 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, lave as células três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Como pós-fixação, incubar os neurônios com 1,5 mililitros de tetróxido de ósmio a 1% em tampão de cacodilato de sódio molar a 0,1 molar por uma hora a quatro graus Celsius.

Depois, lave os neurônios três vezes com 1,5 mililitros de tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Em seguida, prepare tampão de acetato de sódio 0,1 molar com acetato de sódio e ácido acético glacial. Lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato 0,1 molar de cada vez por sete minutos.

Depois disso, incube as células com 1,5 mililitros de acetato de uranila a 1% em tampão de acetato molar 0,1 por uma hora a quatro graus Celsius e, em seguida, lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato molar 0,1 por sete minutos de cada vez. Em uma capela de exaustão, desidrate a cultura neuronal com lavagens únicas de 1,5 mililitro com 50%, 70% e 90% de etanol por sete minutos a cada lavagem, seguidas de três lavagens com 1,5 mililitros de etanol a 100% por sete minutos de cada vez. Em seguida, crie a resina epóxi e misture bem e armazene-a sob vácuo para remover as bolhas de ar.

Infiltre a amostra substituindo o etanol por resina epóxi 50% em etanol em um agitador por 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, resina epóxi 70% em etanol por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador. Troque a solução de resina epóxi por resina epóxi 100% e incube por 10 minutos a 50 graus Celsius. Realize duas trocas de resina epóxi 100% fresca, cada troca é incubada por uma hora a 50 graus Celsius.

Em seguida, adicione resina epóxi 100% fresca e deixe endurecer a 50 graus Celsius durante a noite e depois a 60 graus Celsius por mais de 36 horas. Depois, remova cada amostra da placa de vários poços com um serrote de perfurador. Usando um microscópio de luz invertida, selecione as regiões de interesse que têm concentrações densas de células e, em seguida, corte os blocos de quatro por cinco por oito milímetros cúbicos para seccionar.

Em seguida, contra-core as seções por submersão com acetato de uranila a 1% por 15 minutos e, em seguida, citrato de chumbo a 3% por cinco minutos para melhorar o contraste das amostras. Neste estudo, a microscopia eletrônica foi realizada em neurônios cultivados e as vesículas revestidas de clatrina foram examinadas em comparação com as amostras controle que foram incubadas com cinco miligramas por mililitro de HRP por 90 segundos na ausência de estímulo. As fossetas revestidas por clatrina foram observadas com uma probabilidade de 0,05 por botão na ausência de estímulo.

Nessas imagens, a estimulação com alto endossomo a granel induzido por potássio e captação de vesículas sinápticas foi identificada por marcação HRP. As vesículas sinápticas foram definidas como vesículas com diâmetro inferior a 50 nanômetros e os endossomos em massa foram definidos como tendo diâmetro superior a 80 nanômetros ou com área de seção transversal superior a 80 nanômetros. A captação induzida de endossomos em massa foi diminuída pela recuperação com solução salina normal.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 8 horas e meia com três dias adicionais para endurecer o epóxi se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a marcação imunogold, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a distribuição de uma proteína-alvo em vários pontos da recuperação da estimulação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabilizar e corar amostras em preparação para imagens por microscopia eletrônica.