Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

O objetivo geral deste procedimento é produzir populações puras saudáveis de neurônios granulares cerebelares e manipulá-los geneticamente e modelar diferentes mecanismos de lesão neuronal na cultura primária in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da lesão neuronal. Usamos este protocolo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes de lesões neurais após danos cerebrais agudos e doenças neurogenerativas.

A principal vantagem deste protocolo é que podemos modelar diferentes mecanismos de morte celular, como excitotoxicidade, estresse oxidativo, danos ao DNA e eventos de desenvolvimento usando o sistema de cultura. Embora esse método possa fornecer informações sobre lesões neuronais, ele também pode ser usado com neurônios cerebelares de ratos para estudar a atividade neuronal e a morfogênese em resposta a fatores de crescimento e eventos colaterais. Para extrair o cérebro de um camundongo de seis a sete dias de idade, use uma pinça para segurar a cabeça e, com uma tesoura de microdissecação, corte a pele anteriormente em direção à cabeça.

Empurre a pele para trás para revelar o crânio. Em seguida, penetre no crânio com a ponta da tesoura e corte anterior e lateralmente. Tomando cuidado para não danificar o cerebelo e facilitar a identificação e remoção das meninges, use uma pinça para descascar o crânio expondo o cérebro.

Com um par de pinças ou espátula, provoque suavemente o cérebro em uma solução de dissecação fria. Para isolar o cerebelo, coloque o cérebro na solução de dissecção suplementada com sulfato de magnésio e mantenha a solução e o cérebro no gelo. Sob o microscópio de dissecação, remova as meninges usando uma pinça fina e, em seguida, disseque o cerebelo do cérebro em solução de dissecção suplementada com sulfato de magnésio.

Isso ajuda a descascar as meninges restantes e permite que se entre as camadas para limpar as dobras cerebelares. A presença de meninges na cultura neuronal resulta em células insalubres e eventual morte celular. Como tal, é importante garantir a remoção completa das meninges antes de prosseguir com a cultura.

Depois disso, vire o cerebelo para o lado ventral e garanta a remoção do plexo coróide. Em seguida, puxe o cerebelo para um prato de 35 milímetros contendo um mililitro de solução de dissecação suplementada com sulfato de magnésio. Pique os tecidos em pedaços pequenos e transfira-os para um tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de solução de dissecação tamponada com sulfato de magnésio.

Nesta etapa, centrifugue o tubo de 15 mililitros contendo o tecido cerebral picado por cinco minutos a 644 vezes g e quatro graus Celsius. Depois disso, remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de solução de dissecção de tripsina. Em seguida, agite a mesa em alta velocidade por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Adicione dois mililitros de solução inibidora de tripsina ao tubo e balance suavemente por dois minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 644 vezes g e quatro graus Celsius. Após cinco minutos, remova o sobrenadante e adicione dois mililitros de solução de inibidores de tripsina dois antes de transferi-lo para um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, triture o tecido no tubo de 15 mililitros até que a solução fique turva. Deixe repousar por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante transparente e transfira-o para um novo tubo contendo um mililitro de solução de dissecção suplementada com cloreto de cálcio.

Adicione mais dois mililitros de solução inibidora de tripsina dois no fundo do tubo que contém o pellet. Triture novamente e deixe repousar por cinco minutos. Remova o sobrenadante e adicione-o ao tubo contendo o sobrenadante da etapa anterior.

Repita esse processo até que a maior parte do tecido esteja mecanicamente dissociada. Adicione 0,3 mililitros de solução de dissecção suplementada com cloreto de cálcio à coleção de sobrenadantes para cada mililitro de sobrenadante. Misturar o conteúdo do tubo e centrifugar durante cinco minutos a 644 vezes G à temperatura ambiente.

Depois disso, remova o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de mídia fresca ao pellet e misture. Em seguida, conte as células vivas e dilua-as até uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Coloque as células nas placas de poli D-lisina previamente preparadas. Para placas de quatro poços, coloque 0,5 millimitadores da amostra, dando 7,5 vezes 10 elevado à quinta célula por poço. Para pratos de 35 milímetros, coloque quatro mililitros da amostra, dando seis vezes 10 elevado à sexta célula por prato.

Para lamínulas, coloque 0,5 mililitros dando 7,5 vezes 10 para a quinta célula por poço. Após 24 horas, adicione AraC às placas para reduzir a contaminação glial. Se as células forem mantidas por sete a oito dias, repita este tratamento no terceiro dia e mantenha as culturas em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 graus Celsius.

Para as culturas mantidas por mais de cinco dias, alimente a cultura com glicose a cada dois dias a partir do quinto dia. Para induzir a excitotoxicidade neuronal com NMDA, após sete dias in vitro, trate os neurônios do grânulo cerebelar com 100 NMDA micromolar e 10 glicina micromolar por uma hora. Em seguida, substitua o meio por meio condicionado das culturas paralelas sem tratamento.

Esta concentração resulta em 50% de morte celular 24 horas após o tratamento. Para a morte celular induzida por ROS, trate os neurônios com peróxido de hidrogênio a 75 a 100 micromolares por cinco minutos. Após cinco minutos, mude-o para o meio condicionado de culturas paralelas.

Devido à instabilidade do peróxido de hidrogênio, a concentração deve ser otimizada para um nível que induza entre 50 e 70% de morte celular após 24 horas. Esta concentração é geralmente entre 75 e 100 micromolar. Para induzir a morte celular por danos ao DNA, trate os neurônios do grânulo cerebelar com 10 camptotecina micromolar para induzir mais de 50% da morte celular em 24 horas.

Para apoptose neuronal induzida por baixo potássio em neurônios granulares cerebelares, troque o meio contendo 25 milimolares de potássio por meio de baixo potássio por cinco milimolares de potássio após sete dias in vitro. Os neurônios foram transduzidos com lentivírus para RFP no MOI de três no momento do plaqueamento. Fixado e corado aos sete dias in vitro.

A co-localização do sinal RFP MAP2 e Hoechst demonstrou neurônios saudáveis que são totalmente transduzidos por lentivírus. As imagens mostradas aqui representam análises de ensaios de mortos-vivos de neurônios infectados com diferentes MOI de adenovírus para medir a toxicidade. Neurônios granulares cerebelares infectados com adenovírus expressando LacZ em um MOI entre 25 e 50 permitem eficiência máxima, mantendo toxicidade mínima.

Menos de 1% de diferença na sobrevivência celular em comparação com o controle é observada ao infectar neste MOI. Essas figuras mostram a coloração de Hoechst de neurônios granulares cerebelares de controle e neurônios granulares cerebelares tratados com NMDA para induzir a morte celular. Observe a formação de núcleos picnóticos com o tratamento NMDA.

Esta é uma indicação de morte celular e pode ser observada em aproximadamente 50% da cultura 24 horas após o tratamento com 100 NMDA micromolares e glicina 10 micromolares. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em duas horas e meia com seis estalos de mouse, se executada corretamente. Ao realizar esta técnica, é importante usar a técnica asséptica e os instrumentos cirúrgicos encadeados, conforme necessário, para minimizar o risco de contaminação da cultura.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência estudarem o desenvolvimento neuronal e a lesão neuronal em neurônios primários de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de cultivar neurônios granulares cerebelares, manipulá-los geneticamente usando vírus e induzir mecanismos variados de lesão neural. Após este procedimento, outros métodos, como imunofluorescência ou ensaios de viabilidade celular, podem ser realizados para responder a perguntas como se um gene de interesse aumenta a sobrevivência celular em resposta à excitotoxicidade, estresse oxidativo ou dano ao DNA.