Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

O objetivo deste procedimento é isolar e identificar linhagens celulares nocaute clonais geradas por dois tipos de edição de genoma mediada por CRIPSR / Cas9. Um método detecta o nocaute de proteínas causado pela junção de extremidades não homólogas, enquanto o outro detecta perturbações genômicas geradas pelo reparo direcionado por homologia. Este método é particularmente útil no campo da biologia molecular, onde a geração de linhagens celulares com perturbações genéticas é uma ferramenta importante na dissecação da função gênica.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método rápido e de alto rendimento que pode ser facilmente executado usando técnicas básicas de biologia molecular. A junção de extremidade não homóloga introduz pequenas deleções ou inserções e é avaliada por um ponto imunoblot, enquanto o reparo direcionado por homologia permite perturbações maiores e mais precisas e é avaliado por PCR de colônia. Este experimento usa células T-REx-293 cultivadas em meio DMEM, suplementadas com 10% de FBS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Antes da transvecção, coloque as células em placas de seis poços e inclua um poço para um controle não transvecto. Aumente as células para aproximadamente 70% de confluência. Transvect as células com 2,5 microgramas de plasmídeo total usando um protocolo de transvecção comercial.

Para transvecção de células sem seleção, use 2,5 microgramas de plasmídeo Cas9-sgRNA. Para transvecção de células com seleção, use 0,75 microgramas de Cas9-sgRNA1, 0,75 microgramas de Cas9-sgRNA2 e um micrograma de modelo de recombinação homóloga. Incube as células transvectadas e o controle não transvectado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.

Para células transvectivas com seleção, comece a seleção do medicamento tratando as células com o medicamento apropriado, que é a neomicina neste caso. Retorne a placa de seis poços para a incubadora. Observe as células tratadas uma vez por dia para verificar as taxas de morte celular, até que todas as células do controle não transvectado morram.

Para isolar populações clonais, primeiro cresça as células até 100% de confluência no poço original após a seleção. Em seguida, faça diluições em série das células e conte as células. Uma vez que a geração adequada de colônias monoclonais é a chave para obter um nocaute completo, deve-se tomar cuidado para determinar a diluição correta para acomodar as células na densidade desejada.

Uma vez determinada a diluição correta, assente as células em placas de 96 poços a uma densidade de 0,33 células por poço. Colocar três placas de 96 = poços é um bom ponto de partida para garantir o isolamento de mais de um clone correto. Durante um período de duas a quatro semanas, observe as colônias até que as colônias sejam visíveis a olho nu.

Essas imagens representativas mostram colônias em diferentes estágios de crescimento. Uma única célula sentada, células no quinto dia e uma colônia bem estabelecida no dia 10. Usando uma ponta de pipeta estéril, escolha as colônias visíveis com cuidado e precisão e recoloque em novos poços para estimular o crescimento em monocamada.

Continue cultivando as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Candidatos a nocaute sem seleção são selecionados por dot immunoblot para avaliar o produto proteico de maneira de alto rendimento. Depois de cultivar clones individuais para 50 a 100% de confluência, desaloje a monocamada de células pipetando dentro do poço.

Alíquota de 90 microlitros do volume total de 100 microlitros de cada poço para um tubo de microcentrífuga limpo. Para os fins deste vídeo, apenas duas amostras serão processadas. Gire para baixo a 6.000 RPM por cinco minutos, remova a mídia e lise o palete de células em 10 microlitros de buffer de carregamento 1X SDS.

Adicione 90 microlitros de novos meios ao restante das células do poço e retorne a placa à incubadora para continuar propagando as células. Pipetar um microlitro de lisado celular sobre uma membrana de nitrocelulose seca para formar um ponto. Seque cada amostra duas vezes em duas membranas separadas, criando dois padrões idênticos de amostras.

Bloqueie as membranas em 5% de leite em TBST à temperatura ambiente, com balanço, por uma hora. Após uma hora, seque as membranas com anticorpos primários na diluição recomendada de anticorpos primários e TBST mais 5% de leite. Em uma membrana, use o anticorpo primário contra a proteína alvo, ELAVL1 neste experimento.

Na outra membrana, use o anticorpo primário para uma proteína de controle que não deve mudar, PUM2 é usado aqui. Incube em temperatura ambiente por uma hora. Remova a solução primária de anticorpos de cada borrão, adicione TBST e incube por cinco minutos.

Desta forma, lave os borrões três vezes com TBST. Em seguida, adicione a cada membrana o anticorpo secundário conjugado HRP apropriado e seque à temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, lave as membranas três vezes com TBST por cinco minutos de cada vez.

Aplique uma solução de substrato quimioluminescente nas manchas, seguindo as instruções do fabricante, e obtenha imagens das membranas manchadas em um gerador de imagens de quimioluminescência digital. Por fim, quantifique as intensidades dos pontos para as proteínas-alvo e de controle usando o software apropriado e analise os resultados conforme descrito no protocolo de texto. Os candidatos com o marcador de resistência selecionável são rastreados por PCR de colônia.

Comece este procedimento duplicando colônias individuais em uma nova placa de 96 poços e cultivando-as até 100% de confluência para a preparação de lisados celulares. Remova o meio de um conjunto de clones, ressuspenda as células de cada poço em 30 microlitros de tampão de extração de um kit comercial de preparação de DNA e transfira para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro. Aqueça a solução a 96 graus Celsius por 15 minutos e deixe esfriar até a temperatura ambiente.

Adicione 30 microlitros de tampão de estabilização a cada tubo de microcentrífuga e misture bem. Para identificar linhagens mutantes de tipo selvagem e monoalélico ou bialélico por PCR de colônia, projete dois conjuntos separados de primers de PCR para amplificar regiões ao redor dos braços de homologia com base na integração bem-sucedida ou malsucedida do de resistência. Em cada lado, use um primer comum que recoze fora do braço de homologia.

Para testar o alelo do tipo selvagem, use o primer comum com o primer emparelhado correspondente que é complementar à sequência endógena que abrange a região de homologia. Para testar a mutação desejada, use o primer comum com outro primer emparelhado, complementar ao de resistência inserido. Para cada amostra a ser testada, prepare uma mistura de reação contendo o seguinte, 0,5 microlitros de lisado celular, 1,25 microlitros de tampão KOD 10X, 0,75 microlitros de sulfato de magnésio 25 milimolares, 1,25 microlitros de dois dNTPs milimolares, 0,375 microlitros de primer direto, 0,375 microlitros de primer reverso, 0,25 microlitros de KOD polimerase e 7,75 microlitros de água.

Realize a PCR usando as seguintes condições, 95 graus Celsius por dois minutos, seguida por 25 ciclos de 95 graus Celsius por 20 segundos, temperatura de fusão do primer por 10 segundos e 70 graus Celsius por 20 segundos por KB. Posteriormente, visualize os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose. A edição do genoma usando junção de extremidade não homóloga foi realizada para gerar linhas de nocaute ELAVL1 seguidas de dot immunoblot, sondando ELAVL1 e PUM2. Os clones que exibiram pouco sinal de controle foram marcados com um X e excluídos de análises posteriores.

Clones com baixos sinais de ELAVL1 foram testados por western blot. Os candidatos confirmados são indicados em verde e os candidatos invalidados são indicados em cinza. Este gráfico mostra as proporções de ELAVL1 para controlar o sinal da proteína em ordem crescente.

Na maioria dos casos, as populações clonais com o menor sinal ELAVL1 relativo foram corretamente identificadas como nocautes. Os candidatos gerados pelo método de reparo dirigido por homologia foram selecionados por PCR de colônia e os produtos de PCR visualizados por eletroforese em gel de agarose. São mostrados exemplos de resultados usando primers abrangendo a junção de integração a montante usando primers internos endógenos e primers internos knockout.

Os primers foram validados pela primeira vez em células parentais e células selecionadas em massa. Os resultados de 24 clones candidatos individuais são mostrados junto com os padrões de banda esperados para clones de deleção do tipo selvagem, nocaute e monoalélico. As setas pretas indicam os produtos de amplificação corretos, as estrelas indicam clones de nocaute bialélico.

As linhagens mutantes bialélicas foram posteriormente validadas por western blot. A junção de extremidade não homóloga usa um único corte Cas9 e triagem independente de seleção, exigindo pouca preparação inicial, e a triagem de clones knockout por dot blots pode determinar rapidamente se uma geração de knockout foi bem-sucedida. A triagem baseada em PCR detecta com precisão os candidatos corretos com grandes perturbações genômicas geradas pelo reparo direcionado por homologia.

Essas técnicas permitem que pesquisadores em biologia molecular identifiquem nocautes de maneira fácil e eficiente, permitindo que explorem processos celulares normais ou disfuncionais usando linhagens celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e identificar linhagens celulares nocaute clonais geradas pela edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9