Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

O objetivo geral deste procedimento é observar e quantificar o fator de von Willebrand ou a formação de cordas plaquetárias VWF em resposta a secretagogos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do fator de Von Willebrand e na fisiopatologia do corpo wavo-paliativo. Também nos ajuda a responder a perguntas sobre mutações que prejudicam a liberação do fator de von Willebrand e a função de ligação plaquetária.

A principal vantagem desta técnica é que ela recapitula as interações in vivo entre colágeno subendotelial, células endoetolianas, FVW e plaquetas em um sistema visual e quantificável in vitro. Sinto que a demonstração visual desse método é vital. As etapas de microscopia necessárias para capturar a formação de cadeias de plaquetas do FVW sob várias condições simultâneas em tempo real podem ser difíceis de dominar apenas pelo texto.

Comece carregando 0,5 mililitros de tampão de revestimento de colágeno em uma seringa luer lock de 1 mililitro. Gire a extremidade da seringa no reservatório de uma corrediça da câmara de fluxo e pressione o êmbolo lentamente até que toda a pista esteja revestida e cada reservatório esteja cheio. Encha os reservatórios para garantir que cada um esteja cheio.

Quando todas as pistas estiverem carregadas, incube a câmara a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, use uma pipeta de 200 microlitros para remover o tampão de revestimento de colágeno. Em seguida, enxágue cada pista com HBSS, aspirando o soro fisiológico com uma pipeta de 200 microlitros.

Após a terceira rodada de HBSS ter sido descartada, adicione aproximadamente três vezes 10 às 6ª Células Endoteliais de Crescimento Sanguíneo por mililitro em 100 microlitros de meio de crescimento, suplementado com 10% de FBS a cada pista da câmara de fluxo. Em seguida, retorne a câmara para a incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas, trocando o meio a cada oito a 12 horas. Para montar o aparelho de fluxo, primeiro conecte um conector luer de cotovelo macho a uma extremidade de cada um dos três pedaços de 70 centímetros de tubo de silicone estéril.

E conecte um adaptador de trava luer fêmea na outra extremidade de cada tubo. Conecte os adaptadores luer lock fêmea a seringas individuais de 20 mililitros e programe a bomba da seringa. Coloque as seringas na bomba e prenda firmemente os suportes ao redor das seringas e êmbolos.

Em seguida, prenda luers de cotovelo macho individuais em ambas as extremidades de três pedaços diferentes de tubos de silicone estéreis de 20 centímetros e conecte uma agulha de calibre 18 embotada a um de cada um dos três luers de cotovelo. Em seguida, em um microscópio de disco giratório equipado com uma platina totalmente automatizada, selecione a objetiva 20x e defina as configurações de canal apropriadas. Para obter a faixa de dados dinâmicos completa, defina o dispositivo acoplado de carga de multiplicação de elétrons para um ganho de multiplicação de elétrons de 150 com um tempo de exposição de 200 milissegundos.

Ajuste a potência do laser de 491 nanômetros para 20% e use o software do microscópio para marcar o centro de todas as três pistas. Defina a faixa Z para 1,0 micrômetros e o tamanho da etapa para 0,5 micrômetros. Por fim, selecione a duração e o intervalo para capturar uma imagem a cada 10 segundos em 60 pontos de tempo por slide.

Para induzir a formação de cadeias de plaquetas do FVW, substitua o meio de cultura de três pistas da câmara de fluxo, apenas com meio livre de soro como controle, e depois o estimulante de interesse diluído em 100 microlitros de meio livre de soro para as pistas adicionais. Em seguida, incube a câmara por 15 minutos em temperatura ambiente. No final do período de estimulação, lave todas as três pistas com 100 a 200 microlitros de PBS e use clipes vasculares para mapear a câmara de fluxo em um suporte deslizante.

Conecte um conector luer macho da extremidade de um pedaço de tubo de 70 centímetros a cada reservatório da câmara de fluxo. E ligue a bomba de seringa para remover a lavagem PBS. Pipete PBS adicional no reservatório da câmara de fluxo oposta para garantir que as pistas não sequem.

Assim que o fluxo equivalente for confirmado, pause a bomba de seringa. Conecte uma seringa de 5 mililitros com um acoplador luer lock fêmea ao primeiro conector luer macho livre. E mergulhe a agulha embotada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo solução de plaquetas lavada com marcação fluorescente.

Lentamente, passe a solução plaquetária através do tubo para garantir que não haja bolhas de ar dentro do sistema. Conecte o luer macho ao reservatório aberto da câmara de fluxo e carregue as outras duas pistas com solução de plaquetas, como acabamos de demonstrar. Verifique a configuração do sistema de fluxo para garantir que todas as conexões estejam seguras.

Reinicie a bomba de seringa e obtenha imagens do fluxo de plaquetas por 10 minutos no escuro. Em seguida, desconecte o luer da tubulação de admissão no reservatório da câmara de fluxo. E encha o reservatório com PBS para manter um fluxo salino suave sobre a monocamada de células endoteliais.

Para quantificar a formação de cordas de plaquetas VWF, capture 10 imagens por slide de cada pista sem sobreposição do meio do slide. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, abra o software de processamento de imagem e clique em imagem, ajuste e contraste de brilho. Para ajustar o brilho da primeira imagem, arraste a barra de rolagem até que as plaquetas aderidas possam ser visualizadas bem o suficiente para quantificação.

Em seguida, registre uma cadeia de plaquetas do FVW quando três ou mais plaquetas alinhadas forem observadas e conte todas as cadeias na imagem. Após o início das condições de fluxo, as células não tratadas demonstram muito poucas cadeias de plaquetas do FVW em comparação com as células tratadas com histamina ou PMA. Que exibem uma média de duas a três cadeias de caracteres por campo de visão.

Além disso, as histonas, que ativam as plaquetas e as células endoteliais, induzem a produção de mais cadeias de plaquetas do FVW do que os controles estimulados por histamina ou PMA não tratados. Ao tentar este procedimento, mantenha as plaquetas quiescentes até o experimento de fluxo, descartando o primeiro tubo de coleta de sangue, mantendo todos os reagentes em temperatura ambiente e usando uma técnica de pipeta suave. Modificações podem ser feitas neste procedimento para avaliar a formação de cordas plaquetárias no VWF na presença de leucócitos, agentes ativadores de plaquetas ou dissolução de cordas pelo átomo da enzima de clivagem TS13.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a formação de cordas de plaquetas induzida por VWF induzida por secretogogo e o modelo de câmara de fluxo in vitro.