Name: Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a quantificar a formação de cordões de fator von Willebrand-plaquetas em modelo de câmara de fluxo in vitro. Este método permite estudar a liberação de VWF e a adesão plaquetária sob estresse de cisalhamento.

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Alison Michels é um destinatário de um Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação bolsa de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Laura L. Swystun é o destinatário de uma comunhão CIHR. David Lillicrap é o destinatário de uma cadeira de pesquisa do Canadá na hemostase Molecular. Este estudo foi financiado em parte por um CIHR grant (MOP-97849) de funcionamento.

Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha.
1. endothelial da pilha estimulação
<ol><li>
Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco.
	<ol>
<li>24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial).</li>
		<li>Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está equilibrado sal solução (HBSS). Nota: As placas podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas em um saco de plástico hermético a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sementes em uma densidade de 1 x 106 células por poço em 2 mL de crescimento médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), as células endoteliais. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C (5% CO2). Nota: Aqui, sangue consequência células endoteliais (BOECs) entre 5 e 15 passagens foram usadas. BOECs foram isoladas de voluntários saudáveis com uma sequência VWF sua usando um método referenciado em Starke et al 22 , de uma forma semelhante a um descrito anteriormente por JoVE23.</li>
	<li>Retire o meio após 24 h e lave as células com HBSS.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de meio livre de soro (meio de crescimento essencial mínimo sem FBS) contendo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA; 100 nM), fluida histona (UH) e HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) para as células por 2 h a 37 ° C (5% CO2). Nota: Esta concentração de histona foi baseada em vitro citotoxidade relatórios anteriores de Xu et al . 24 e Abrams et al. 25 que usado 50 µ g/mL.</li>
	<li>Recolher o meio após 2h e armazená-lo a-20 ° C até análise.</li>
</ol>2. VWF quantificação por ensaio enzima-lig da imunoabsorção (ELISA)
<ol><li>Revestir uma microplaca com 100 µ l de revestimento anticorpo tampão (10mm dibásico fosfato de sódio e 145 mM de cloreto de sódio, pH 7,2) contendo policlonal anti-VWF 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem (10 mM de fosfato de sódio dibásico, cloreto de sódio 500 mM e 0,1% Tween 20, pH 7,2).</li>
	<li>Diluir as amostras médias 1:2 e 1:4 com tampão de lavagem e usar plasma de referência normal para uma curva padrão, começando em um 01:10 diluição.</li>
	<li>Placa de 100 µ l de amostras diluídas e normas durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de anti-VWF diluído, anticorpo conjugado HRP deteção (1.1 µ g / µ l de tampão de lavagem) para a placa e incubar por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a placa e incubar durante 10 minutos com O-fenilenodiamina dicloridrato (OPD) reagente, conforme as instruções do fabricante.</li>
	<li>Parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4 e leia a placa em 492 nm.</li>
</ol>3. fase sólida histona-VWF ensaio
<ol><li>Revestir uma microplaca com histonas diluídas em 0,5% de sódio deoxycholate 50mm carbonato de buffer (pH 9.6) 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20, incubando durante 10 min entre lavagens.</li>
	<li>Bloquear a placa com 200 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20 e 1% albumina de soro bovino (BSA) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita a etapa 3.2.</li>
	<li>Diluir em série derivada de plasma humano VWF/fator VIII complexo de 200 mU/mL a 25 mU/mL no tampão salino (cloreto de sódio de 500 mM de fosfato de sódio dibásico, de 10mm e 0.1% Tween 20, pH 7,2). Adicione 100 µ l para a placa para 2 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita a etapa 3.2.</li>
	<li>Detecta a ligação do VWF a histona imobilizada usando 100 µ l de uma solução contendo PBS-0.1% Tween 20 e 1:1,000 coelho policlonal anti-VWF anticorpo conjugado com HRP por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita a etapa 3.2.</li>
	<li>Incubar a placa por 30 min com 100 µ l de reagente OPD e parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4. Medir a densidade óptica em 492 nm.</li>
</ol>4. semeadura de células endoteliais em câmaras de fluxo
<ol><li>Carrega a 0,5 mL de tampão de colágeno-revestimento (descrito no passo 2.1) em uma seringa de 1 mL Luer-lock.</li>
	<li>Torça a extremidade do conector Luer-lock da seringa para o reservatório de um slide de câmara de fluxo.</li>
	<li>Pressione o êmbolo lentamente até a pista inteira é revestida e cada reservatório estiver cheio. Repita para cada raia e incubar a câmara a 37 ° C por 24 h.</li>
	<li>Aspire o buffer de colágeno-revestimento com uma pipeta de 200 μL. Carregar outra seringa com 1 mL HBSS e pressione o êmbolo lentamente para lavar cada raia da câmara de fluxo. Aspire a lavagem com uma pipeta μL 200 na extremidade oposta da câmara de fluxo. Repita duas vezes.</li>
	<li>Pipetar cerca de 100 µ l de uma solução de células endoteliais (BOEC) 3 x 106 células/mL em meio de cultura com 10% FBS para a pista de uma câmara de fluxo. Nota: A densidade de semeadura de células endoteliais excede a capacidade da câmara. Isso é para garantir a cobertura máxima do canal; as células não-aderentes são removidas na etapa de lavagem posterior.</li>
	<li>Incube a câmara a 37 ° C por 24 h. mudança de meio de cada 8-12 h usando seringas Luer-lock (como na etapa 4.4). Certifique-se de que não há nenhuma bolha visível nas pistas.</li>
</ol>5. isolar as plaquetas de sangue total humano
<ol><li>Em uma câmara de segurança biológica com uma agulha 30G, adicione 300 µ l de tampão ácido-citrato dextrose (citrato trissódico 85mm, 111 mM D-glicose e ácido cítrico de 71 mM, pH 4.5) para um vacutainer de coleta de sangue sem aditivos 3 mL.</li>
	<li>Colete sangue total de voluntários saudáveis (livres de anti-plaquetários e não-esteroides anti-inflamatórios não esteroides por sete dias) por punção venosa (três tubos de 3ml cada), seguindo um protocolo semelhante ao publicado por Bernardo et al.26.</li>
	<li>Descarte o primeiro tubo, pois o dano no tecido inicial associado com a punção venosa pode causar Ativação plaquetária espontânea.</li>
	<li>Inverta suavemente o Vacu três vezes para misturar o sangue com anticoagulante.</li>
	<li>Centrifugue o Vacu a 150 x g, durante 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).</li>
	<li>Remova lentamente o plasma rico em plaquetas (sobrenadante) com uma pipeta em uma câmara de segurança biológica e cuidadosamente, transferi-lo para um tubo cônico de 15 mL. Transferi o volume rico em plaquetas de cada vacutainer para um único tubo cônico para evitar potencial Cruz-ativação. Nota: O isolamento de plaquetas deve ser realizado em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação bacteriana e potencial plaquetas artificiais e/ou ativação endotelial.</li>
	<li>Centrifuga os tubos cónicos a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente) para as plaquetas de Pelotas.</li>
	<li>Pipetar e descartar o sobrenadante pobre em plaquetas.</li>
	<li>Lave o pellet cuidadosamente com 1 mL de tampão de citrato-glicose-sódio (CGS) (citrato de sódio de 13 mM, 30 mM D-glicose e cloreto de sódio 120 mM, pH 7,0). Nota: As plaquetas aparecerá em formações de wisp quando o buffer CGS é adicionado e o sedimento é resuspended suavemente. Amostras contaminadas por Ativação plaquetária, as plaquetas não serão facilmente Resuspenda em surgem agrupadas.</li>
	<li>Uma vez totalmente resuspended, Centrifugar as amostras a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente).</li>
	<li>Retire o tampão de lavagem CGS e resuspenda o pellet em 3 mL de tampão de Tyrode (cloreto de sódio 138 mM, 5.5 mM D-glicose, 12mm de bicarbonato de sódio, cloreto de potássio de 2,9 mM e 0,36 mM de fosfato de sódio dibásico, pH 7,4). Certifique-se de ressuspensão completa das plaquetas e, se forem observadas as agregações, descartar a amostra.</li>
	<li>Adicione 1,5 µ l de uma solução-mãe DiOC6 (dissolver 57,25 mg em 5 mL de metanol) de 20mm a cada tubo cónico de 3 mL de plaquetas lavadas para uma concentração final de 1 µM. Nota: DIOC6 é um corante de mitocondrial verde fluorescente usado neste experimento para as plaquetas de rótulo.</li>
	<li>Alíquota 1 mL da solução de plaquetas lavadas para três tubos de 1,5 mL microcentrifuge. Nota: O volume de plaquetas exigido para este experimento é calculado com base no tamanho da câmara de fluxo, a tensão de cisalhamento desejado e o comprimento do experimento (passo 6.5). Este protocolo pode ser ajustado conforme as condições mudam para garantir que não há volume suficiente para o fluxo de fluido.</li>
	<li>Use as plaquetas lavadas até 2 horas de isolamento.</li>
</ol>6. fluxo de montagem de aparelhos
<ol><li>Prenda um pedaço de 70 cm de estéril silicone tubo (diâmetro interior de 1,6 mm) para um conector Luer de cotovelo macho em uma extremidade e um adaptador de bloqueio Luer fêmea na outra.</li>
	<li>Conecte o adaptador de bloqueio Luer fêmea anexado para o tubo a uma seringa de 20 mL.</li>
	<li>Repita as etapas de 6.1 e 6.2 duas vezes para gerar três conexões de seringa-tubo idênticas.</li>
	<li>
Use uma bomba de seringa para gerar fluxo de fluido. As seguintes configurações para a bomba de seringa de entrada: diâmetro interior da taxa de fluxo e seringa. Nota: Uma seringa de 20 mL tem um diâmetro interior de 19,55 mm. A taxa de fluxo é calculada com base na tensão de taxa/cisalhamento cisalhamento desejado e as dimensões da câmara de fluxo. Câmara de fluxo usado no estudo atual, para alcançar 1 dyn/cm2 (observados em baixo cisalhamento venoso), é necessário um caudal de 9.37 µ l/min. Por causa da evidência ligando histonas para trombose venosa, é selecionado um cisalhamento moderado venoso de 4,45 dyn/cm2 . Isto também é baseado no pressuposto de que a reserva tem uma viscosidade semelhante à água. A taxa de fluxo é então igual a 41,7 equações µ l/min., usadas para calcular que a taxa de fluxo para várias dimensões de câmara de fluxo pode ser encontrada em:<ol>
<li>Conjunto da bomba para retirar o líquido, usando a opção do botão da bomba de seringa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carga três seringas anexado à tubulação da bomba de seringa e fixe firmemente colchetes em torno das seringas e êmbolos.</li>
	<li>Anexe um cotovelo macho Luer para ambas as extremidades de um segundo pedaço de 20 cm de tubo estéril do silicone.</li>
	<li>Conecte um cotovelo Luer uma agulha de calibre 18 embotada.</li>
	<li>Repita duas vezes, criando três sistemas de admissão idêntica para as três faixas da câmara de fluxo. Nota: Os tubos de silicone e Luers pode ser lavado com água sanitária 10%, seguida por água destilada antes reusar. Não é aconselhável reutilizar as câmaras de fluxo.</li>
</ol>7. microscópio configurações
<ol><li>Use um microscópio de disco girando equipado com um palco totalmente automatizado. Realize a iluminação com um lançamento do laser que fornece 405, 458, 491, 543 e linhas de laser 633 nm. Capture todas as imagens com um objetivo X 20. Ajuste todos os parâmetros com o software de análise (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).</li>
	<li>Selecione as configurações de canal (filtro de emissão: 520/35), com a excitação em 491 nm, para aquisição. Defina o elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplada a um ganho de elétron-multiplicação de 150, com um tempo de exposição de 200 ms, para obter o intervalo de dados dinâmica plena. Nota: As plaquetas são marcadas com um corante fluorescente verde, DiOC6, com maxima de comprimento de onda (excitação, 482 nm; emissão, 504 nm).</li>
	<li>Ajuste a potência de laser 491 nm a 20%.</li>
	<li>Marque o centro de todas as três faixas e selecione 1 μm para faixa z e 0,5 μm de tamanho de passo. Selecione o número de pontos de tempo (ou seja, duração) e o tempo entre as imagens (ou seja, intervalo) para capturar uma imagem a cada 10 s; Selecione "60 pontos de tempo" por slide. Defina o microscópio para capturar imagens de três pistas e salvá-los para uma pasta designada experimento. Nota: Porque a câmara de fluxo tem três faixas, o microscópio será necessário alternar entre três posições para capturar as imagens.</li>
</ol>8. VWF-plaquetas String formação
<ol><li>Remover o meio de cultura da câmara de fluxo (da etapa 4) usando a mesma técnica como na etapa 4.4.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de qualquer histamina (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) diluído em meio livre de soro (como na etapa 1.4) para estimular a monocamada BOEC por 15 min a temperatura e O ambiente2/CO2. Nota: Embora não seja necessário para a liberação do VWF, realizar esta estimulação a 37 ° C irá melhorar VWF exocitose27.</li>
	<li>Certifique-se de que um dos três corredores separados da câmara de fluxo permanecem não tratados como um controle experimental.</li>
	<li>Remover o meio utilizando uma seringa de 1 mL e substituí-lo com 100-200 µ l de PBS para lavar os secretagogues fora a monocamada endotelial.</li>
	<li>Montagem da câmara de fluxo em um stand de slide usando grampos vasculares para fixar a câmara no lugar.</li>
	<li>Conecte o conector Luer macho disponível na extremidade do tubo de 70 cm (conectada à seringa) para o reservatório da câmara de fluxo. Repita para as duas outras fluxo câmara pistas.</li>
	<li>Ligue a bomba de seringa para remover a lavagem PBS. Pipeta PBS adicionais para o reservatório de câmara de fluxo opostos para garantir que as vias não secar.</li>
	<li>Observar o sistema de fluxo para o fluxo equivalente em todas as três faixas e então pausar a bomba de seringa.</li>
	<li>Selecione uma área para capturar as imagens em meados de cada raia, aproximadamente a mesma área entre experiências. Nota: A pessoa que opera o microscópio pode ser cega às condições experimentais. Esta etapa garante que o microscópio é focado antes fluxo de plaquetas (consulte a etapa 7).</li>
	<li>Anexar um acoplador fêmea luer<a> </a>a uma seringa de 5 mL e depois para o conector luer macho livre (etapa 6,8) e mergulhe a agulha cega no tubo microcentrifuga de 1,5 mL contendo a solução de plaquetas lavadas (etapa 5.13). Tirar lentamente a solução de plaquetas através do tubo para não garantir nenhuma bolha de ar dentro do sistema.</li>
	<li>Remova a seringa de 5 mL e anexar o conector Luer macho ao reservatório aberta da câmara de fluxo. Repita para as três faixas.</li>
	<li>Reiniciar a bomba de seringa e capturar imagens durante o fluxo de plaquetas usando as configurações de microscópio e protocolo da etapa 7 para 10 min no escuro.</li>
	<li>Depois de 10 min, desconecte o tubo de entrada no reservatório de câmara do fluxo o Luer e encher o reservatório com PBS para manter o fluxo sobre a monocamada endotelial.</li>
</ol>9. VWF-plaquetas String quantificação
Nota: O fluxo contínuo de PBS é necessária para manter o alongamento de cadeia de caracteres de VWF-plaquetas para análise de imagem. Cessação do fluxo resultará no VWF tornando-se globular e prejudicará a quantificação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas. É essencial para completar cada reservatório com PBS durante a captura de imagem. HBSS pode substituir PBS se encolhendo de célula ou destacamento é observado durante esta etapa.
<ol><li>Começando com a primeira pista, capture 10 imagens por slide sem sobreposição usando uma lente de objetiva X 20 em torno do meio do slide. Repita isto para cada raia. Nota: As áreas em torno dos reservatórios devem ser evitadas devido à tensão de cisalhamento turbulenta.</li>
	<li>Usando o software de processamento de imagem, ajustar o brilho, clicando em "Imagem", "Ajustar" e "Brilho/contraste." Arraste a barra de rolagem até que as plaquetas aderidas podem ser visualizadas bem o suficiente para quantificação.</li>
	<li>Grave uma sequência de caracteres de VWF-plaquetas quando três ou mais alinhadas plaquetas são observadas na imagem. Conte todas as cordas de VWF-plaquetas em uma imagem. Repita para todas as 10 imagens e média para o experimento. Nota: A pessoa que realizar a quantificação pode ser cego para as condições experimentais. Não é necessário ficar manchado co para VWF, como isto foi confirmado por estudos independentes de28,8,29.</li>
	<li>Repeti o experimento um mínimo de três vezes para avaliar cada secretagogue.</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona5. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) - ou no microambiente inflamatório - onde ...

Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo1 e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença2 e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa3 e trombose arterial4 .
VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais e armazenado em plaquetas α-grânulos e WPBs, respectivamente. Desafio hemostático, VWF pode ser liberado da endoteliais WPBs para amarrar as plaquetas circulantes de células endoteliais ativadas5 ou colágeno exposto no vaso parede6. Ancoragem de VWF para células endoteliais foi mostrado para ser mediado pelo P-selectina7 e integrinas αvβ38. A subsequente liberação de plaquetas α-grânulo lojas pode aumentar ainda mais as concentrações de VWF localizadas para estabilizar as interações de plaquetas-plaquetas para a formação de plaquetas plug, o andaime necessário para a propagação da cascata de coagulação e fibrina deposição. A atividade de plaquetas-ligação do VWF é regulada pela sua estrutura multiméricas, com oriundas de alto peso molecular, possuindo maior atividade hemostática9,10. Em circulação, VWF também atua como um portador para o factor VIII de coagulação.
Tensão de cisalhamento de fluido é um regulador essencial da fisiologia do VWF. Na ausência de tensão de cisalhamento, VWF existe sob uma forma globular, ocultando os domínios de ligação para a glicoproteína plaquetária Ib adesão11. Quando a tensão de cisalhamento está presente, o local de clivagem para uma metalloprotease, uma Desintegrina e metalloprotease com motivo thrombospondin (ADAMTS13), é exposto. ADAMTS13 cliva nuas e plaquetas-decorado VWF sequências de caracteres para regular o tamanho do multimer, reduzindo sua atividade hemostática12.
VWF é uma proteína de fase aguda, e inúmeros estímulos, incluindo hipoxia13, infecção14e cytokines proinflammatory, foram mostrados para mediar a liberação VWF de células endoteliais. Semelhante a outros agentes inflamatórios, histonas extracelulares também foram mostrados para induzir liberação sistêmica de VWF ratos15,16 e a ativação de plaquetas em vitro17,18, 19. isto foi mostrado para ser dependente de subtipo de histona, como diferenças de lisina e conteúdo de arginina pode influenciar a função15. Nossa estudo visa estabelecer uma câmara de fluxo modelo para investigar a influência do rico em lisina (HK) e ricos em arginina subtipos de histona (HR) e secretagogues na liberação VWF endotelial e plaquetária em tempo real de captura, potenciais eventos precoce em trombose induzida por inflamação.
Esta metodologia de câmara de fluxo recapitula em vivo de interações entre as plaquetas, células endoteliais, VWF e colágeno subendotelial em um sistema em vitro que é visual, reprodutível e quantificáveis. Permite a avaliação em tempo real de todos os aspectos do percurso que regula as interações VWF-plaquetas, incluindo secreção WPB, Ativação plaquetária e proteólise VWF. Estudos de VWF sob condições controladas de tensão de cisalhamento têm sido utilizados para avaliar as mutações do VWD que prejudicam a liberação do VWF e plaqueta-ligação função20, WPB fisiologia21e clivagem VWF por ADAMTS135. Nós usamos esta metodologia para quantificar a formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas como consequência de um estímulo inflamatório: histonas extracelulares.

<table><tbody><tr><td>Histonas não fracionadas do timo de bezerro (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histonas ricas em lisina de timo de bezerro (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histonas ricas em arginina de timo de bezerro (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Reconstituído em DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Reconstituído em água (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3' Dihexiloxacarbocianina Iodeto (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Reconstituído em metanol (20 mM)</td></tr><tr><td>Anticorpo de revestimento anti-VWF de coelho</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>para VWF ELISA</td></tr><tr><td>Anticorpo de detecção anti-VWF de coelho, conjugado com HRP</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>Para VWF ELISA e ensaio de ligação de histona-VWF</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp microplacas de fundo plano de 96 poços</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>Para ensaio de ligação de histona-VWF</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Placas Thermo</td><td>Scientific</td><td>3855</td><td>Para VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N / A</td><td>Fator de von Willebrand humano derivado de plasma/complexo de fator VIII</td></tr><tr><td>Plasma de referência normal</td><td>Precision BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>Para VWF Curva padrão ELISA</td></tr><tr><td>Reagente de dicloridrato de O-fenilenodiamina (OPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Produto equivalente disponível através da ThermoFisher Scientific (Número de catálogo: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Para cultura e inicial semeadura de BOEC</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rat-tail Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Para estimulação de células endoteliais</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopia Software de Automação e Análise de Imagem</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Coleta de Sangue BD Vacutainer, Sem Aditivo</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (câmaras de fluxo)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>Este produto foi descontinuado. Sugerimos usar &micro;-Slide VI 0.1 (#80661) ou 0.4 (# 80601) e recalcular a taxa de fluxo e o volume de plaquetas necessários para manter uma tensão de cisalhamento de 4.45 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Tubo de silicone 1.6 mm ID: 5 m, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Connector Fêmea: polipropileno natural, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Cotovelo Luer Connector Macho: polipropileno branco, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 18G sem corte</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 20 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- Microscópio de disco giratório 4X1</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando a von willebrand factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von willebrand factor-plaquetas string formação

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.

Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não tratada. For...

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

O objetivo geral deste procedimento é observar e quantificar a formação de cordões de fator de von Willebrand ou VWF-plaquetas em resposta a secretagogos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do fator de von Willebrand e na fisiopatologia do corpo wavo-paliativo. Também nos ajuda a responder perguntas sobre mutações que prejudicam a liberação do fator de von Willebrand e a função de ligação às plaquetas.A principal vantagem desta técnica é que ela recapitula as interações in vivo entre colágeno subendotelial, células endoteliais, FVW e plaquetas em um sistema in vitro visual e quantificável. Acho que a demonstração visual deste método é essencial. As etapas necessárias de microscopia para capturar a formação de filamentos de FVW-plaquetas sob múltiplas condições simultâneas em tempo real podem ser difíceis de dominar apenas com texto.Inicie carregando 0,5 mililitros de tampão de revestimento com colágeno em uma seringa luer lock de 1 mililitro. Gire a extremidade da seringa para acoplá-la ao reservatório de uma lâmina de câmara de fluxo e pressione lentamente o êmbolo até que toda a via esteja revestida e cada reservatório esteja cheio. Complete os reservatórios para garantir que cada um deles esteja totalmente cheio.Após carregar todas as canaletas, incubar a câmara a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, utilizar uma pipeta de 200 microlitros para remover o tampão de revestimento com colágeno. Em seguida, lavar cada canaleta com HBSS, aspirando o salino com uma pipeta de 200 microlitros.Após o descarte da terceira rodada de HBSS, adicione aproximadamente três vezes 10 à 6ª células endoteliais de crescimento sanguíneo por mililitro em 100 microlitros de meio de crescimento, suplementado com 10% de FBS, a cada canal da câmara de fluxo. Em seguida, retorne a câmara ao incubador a 37 graus Celsius por 24 horas, trocando o meio a cada oito a 12 horas. Para montar o aparelho de fluxo, conecte primeiro um conector luva macho a uma extremidade de cada uma das três peças de tubo de silicone estéril de 70 centímetros.E conecte um adaptador luer lock feminino à outra extremidade de cada tubo. Conecte os adaptadores luer lock femininos a seringas individuais de 20 mililitros e programe a bomba de infusão. Carregue as seringas na bomba e fixe firmemente os suportes ao redor das seringas e dos êmbolos.Em seguida, conecte conectores machos em ângulo a ambas as extremidades de três peças diferentes de tubo de silicone estéril de 20 centímetros de comprimento e fixe uma agulha rombuda de calibre 18 a um dos conectores em ângulo de cada um dos três tubos. Depois, em um microscópio de disco giratório equipado com estágio totalmente automatizado, selecione a objetiva de 20x e configure os parâmetros de canal apropriados. Para obter a faixa dinâmica completa de dados, ajuste o dispositivo acoplado à carga com multiplicação eletrônica para um ganho de multiplicação eletrônica de 150 com um tempo de exposição de 200 milissegundos.Ajuste a potência do laser de 491 nanômetros para 20% e use o software do microscópio para marcar o centro das três faixas. Defina a faixa Z como 1,0 micrômetro e o tamanho do passo como 0,5 micrômetro. Por fim, selecione a duração e o intervalo para capturar uma imagem a cada 10 segundos em 60 pontos de tempo por lâmina.Para induzir a formação de agregados de VWF-plaquetas, substitua o meio de cultura de três canais da câmara de fluxo por meio sem soro como controle, em seguida, adicione o estimulante de interesse diluído em 100 microlitros de meio sem soro aos canais adicionais. Incube então a câmara por 15 minutos à temperatura ambiente. Ao final do período de estimulação, lave os três canais com 100 a 200 microlitros de PBS e use clipes vasculares para fixar a câmara de fluxo sobre um suporte para lâminas.Conecte um conector luer macho da extremidade de um tubo de 70 centímetros a cada reservatório da câmara de fluxo. E inicie a bomba de seringa para remover a lavagem com PBS. Pipete PBS adicional no reservatório oposto da câmara de fluxo para garantir que os canais não sequem.Uma vez confirmado o fluxo equivalente, pause a bomba de seringa. Conecte uma seringa de 5 mililitros com acoplador luer lock feminino ao primeiro conector luer macho livre. E submerja a agulha rombuda em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo solução de plaquetas lavadas marcadas com fluoróforo.Retire lentamente a solução de plaquetas através do tubo para garantir que não haja bolhas de ar no sistema. Conecte a extremidade luer macho ao reservatório aberto da câmara de fluxo e carregue as outras duas vias com a solução de plaquetas, conforme acabou de ser demonstrado. Verifique a configuração do sistema de fluxo para garantir que todas as conexões estejam seguras.Reinicie a bomba de seringa e visualize o fluxo de plaquetas por 10 minutos no escuro. Em seguida, desconecte o conector luer da tubulação de entrada no reservatório da câmara de fluxo. E preencha o reservatório com PBS para manter um fluxo suave de solução salina sobre a monocamada de células endoteliais.Para quantificar a formação de filamentos de VWF-plaquetas, capture 10 imagens por lâmina de cada canal sem sobreposição a partir do centro da lâmina. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, abra o software de processamento de imagens e clique em imagem, ajuste e brilho/contraste. Para ajustar o brilho da primeira imagem, arraste a barra de rolagem até que as plaquetas aderidas possam ser visualizadas com clareza suficiente para quantificação.Em seguida, registre uma cadeia de VWF-plaquetas quando três ou mais plaquetas alinhadas forem observadas e conte todas as cadeias na imagem. Após a iniciação das condições de fluxo, as células não tratadas demonstram pouquíssimas cadeias de VWF-plaquetas em comparação com as células tratadas com histamina ou PMA, que exibem uma média de duas a três cadeias por campo de visão.Além disso, as histonas, que ativam plaquetas bem como células endoteliais, induzem a produção de mais cordões de VWF-plaquetas do que os controles não tratados, ou estimulados com histamina ou PMA. Ao realizar este procedimento, mantenha as plaquetas quiescentes até o experimento de fluxo descartando o primeiro tubo de coleta de sangue, mantendo todos os reagentes à temperatura ambiente e utilizando uma técnica suave de pipetagem. Podem ser feitas modificações neste procedimento para avaliar a formação de cordões de VWF-plaquetas na presença de leucócitos, agentes ativadores de plaquetas ou a dissolução dos cordões pela enzima clivadora ADAMTS13.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a formação de filamentos de VWF-plaquetas induzida por secretagogos e o modelo in vitro com câmara de fluxo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

Este artigo descreve o protocolo para quantificar a porcentagem de plaquetas positivas para o Fator Tissular (TF) usando citometria de fluxo sanguíneo total, avaliando a proteína: (1) intracelularmente em condições de repouso, e (2) na superfície celular, tanto em repouso quanto em condições ativadas. Também é fornecida orientação para avaliar plaquetas TF-positivas em plasma rico em plaquetas.

Análise por Citometria de Fluxo da Expressão de Fatores Tecidusuais em Plaquetas Humanas

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Aprenda a quantificar a formação de cordões de fator von Willebrand-plaquetas em modelo de câmara de fluxo in vitro. Este método permite estudar a liberação de VWF e a adesão plaquetária sob estresse de cisalhamento.

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação (Vídeo) | JoVE Journal

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

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