Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

O objetivo geral deste procedimento é mapear os sítios de integração de vetores retrovirais derivados do vírus da leucemia murina para definir regiões reguladoras específicas de células. Este método pode ajudar a responder questões-chave em estudos de terapia gênica e regulação gênica, como onde o vetor se integra no genoma humano e quais elementos reguladores podem ser ativamente utilizados por meio de um subtipo particular. Tivemos inicialmente a ideia para este método ao observar que, em estudos de terapia gênica, os vetores MLV se integram em promotores e enhancers ativos e específicos de subtipo.

Inicie transduzindo as células-alvo com um vetor retroviral derivado do MLV que contenha o gene repórter EGFP e pseudotipado com VSV-G ou com a glicoproteína envelope anfrotrópica. Células mock transduzidas são utilizadas como controle negativo. 48 horas após a transdução, centrifugue as amostras e, em seguida, re-suspenda 100.000 células em 300 microlitros de PBS contendo dois por cento de soro bovino fetal.

Em seguida, meça a expressão de EGFP por análise de citometria de fluxo. Recolha outras 0,5 a cinco milhões de células transduzidas para preparação de DNA genômico e subsequente digestão com enzima de restrição. Prepare quatro digestões com enzima de restrição por amostra em tubos de 1,5 mililitro.

Digira de 0,1 a um micrograma de G-DNA em cada tubo. Adicionando 10 unidades de TRU91 e um microlitro do tampão M por amostra em um volume final de 10 microlitros. Distribua dois microlitros da mistura nos tubos de digestão.

Em seguida, incubar as reações a 65 graus Celsius por seis horas ou durante a noite. Após a incubação, adicionar 40 microlitros de água a um tubo de 1,5 mililitro. No mesmo tubo, adicionar 10 unidades de PST1 e um microlitro do tampão H por amostra.

Dispense 10 microlitros da mistura de reação de digestão nos tubos de digestão. Incube as reações a 37 graus celsius por seis horas ou durante a noite. No dia seguinte, prepare oito reações de ligação de conectores em tubos de 1,5 mililitro.

Para cada reação, adicione a mistura de reação da ligase a 10 microlitros do DNA genômico digerido. Incube a 16 graus Celsius por três a seis horas. Para a PCR de primeira rodada, prepare 48 reações de PCR em tubos de 0,2 mililitro.

Para cada PCR, adicione a mistura de reação contendo o iniciador ligante e o iniciador MLV3 prime LTR a dois microlitros da reação de ligação. Coloque as amostras em um ciclador térmico com tampa aquecida. Configure os parâmetros de ciclagem e realize a primeira rodada da reação de PCR.

Para a PCR da segunda rodada, prepare a mistura de reação contendo o iniciador aninhado do ligador e o iniciador aninhado do LTR 3' do MLV. Em seguida, adicione dois microlitros do produto da PCR da primeira rodada como molde. Então, realize a reação de PCR da segunda rodada para gerar os produtos finais de PCR LN.

Após a PCR de segundo ciclo, reunir as 48 reações de PCR LM aninhadas em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicionar 20 microlitros de tampão de carregamento a 100 microlitros do produto de PCR LM agrupado e precipitado. E aplicar a amostra em um gel de agarose a um por cento junto com a escada de DNA de 100 pares de base.

Execute o gel a cinco volts por centímetro durante 30 a 60 minutos, uma vez que as bandas estejam definidas, e recorte a porção do gel contendo amplicons de 500 a 150 pares de bases. Após purificar o produto da PCR de ligação mediada (LM PCR) com um kit de extração de gel baseado em coluna, meça a concentração utilizando um espectrofotômetro UV antes de prosseguir para a preparação da biblioteca. Além disso, avalie o comprimento dos produtos da LM PCR utilizando um equipamento bioanalisador, conforme as instruções do fabricante.

Prepare a biblioteca realizando uma PCR de indexação. Para cada PCR, utilize de 150 a 170 nanogramas do produto de PCR de LM purificado, com combinações de index diferentes para cada amostra. Realize a PCR em um termociclador com tampa aquecida, conforme indicado.

Após a PCR, dilua a biblioteca purificada para 10 nanomolar com tris HCL 10 milimolar. Em seguida, misture cinco microlitros do pool diluído com cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,2 normais em um novo tubo de 1,5 mililitro. Vortex brevemente, centrifugue e depois incube por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas.

Coloque os tubos do pool desnaturado em gelo e 990 microlitros de tampão de hibridização HT1 pré-resfriado. Em seguida, alíquota 300 microlitros do pool desnaturado em um novo tubo de 1,5 mililitro. E adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de dez picomolar.

Em paralelo, misture 10 nanomolares da biblioteca controle fixada em um volume de dois microlitros com 3 microlitros de tris HCl 10 milimolares em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,2 newtons e vortex brevemente. Após centrifugar, incube por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar a fixação diluída.

Após a incubação, coloque o tubo em gelo e adicione 990 microlitros de HT1 pré-resfriado. Agora, alíquota 100 microlitros do fixador desnaturado em um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter uma concentração final de 10 picomolar de fixador. Finalmente, em um novo tubo de 1,5 mililitro, misture 510 microlitros do pool de biblioteca desnaturado com 90 microlitros da biblioteca fixadora desnaturada, obtendo assim um pool final de 10 picomolar com 15% de controle de fixador para sequenciamento.

Esta imagem mostra a análise de 3498, 2989 e 4103 agrupamentos de sítios recorrentes de integração de MLV em células-tronco progenitoras hematopoéticas, progenitores eritroides e progenitores mieloides, respectivamente. Em cada população celular, mais de 95% dos agrupamentos de MLV sobrepuseram-se a enhancers e promotores definidos epigeneticamente. As regiões-alvo de MLV específicas a cada célula apresentavam alta acetilação e estavam associadas à expressão específica da célula do gene direcionado.

Exemplos são o promotor do gene SPINK2 específico para HSP. A região de controle do locus contendo potentes enhancers dos genes da globina beta-like específicos para eritróide. Enhancers localizados a montante do gene LYZ específico para NPP.

Ensaios de repórter luciferase validaram o subconjunto de potenciadores específicos de célula direcionados pelo MLV em EPP e MPP. Regiões direcionadas pelo MLV específicas de eritróides apresentaram maior atividade em EPP do que em MPP, e vice-versa, confirmando que o MLV identifica potenciadores específicos de célula que possivelmente controlam a expressão de genes próximos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma semana se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de maximizar a frequência de células transduzidas para obter a melhor recuperação possível dos sítios de integração. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como mapear os sítios de integração viral, primeiro ajustando o DNA genômico, em seguida ligando os fragmentos genômicos a um ligante de DNA, amplificando posteriormente a junção entre o genoma do hospedeiro e o vírus por meio de PCR com ligação mediada (LM-PCR) e, por fim, realizando sequenciamento profundo da biblioteca de amplicons.