Name: Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a mapear sites de integração de vetores retrovirais derivados de MLV em células humanas para identificar regiões reguladoras específicas. Este método auxilia na otimização de estratégias de terapia gênica.

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Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho Europeu de Investigação (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), do Ministério italiano da Educação, Universidades e Investigação (FIRB-Futuro em Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro em Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), o Ministério Italiano da Saúde (Jovens Pesquisadores Chamam 2011 GR-2011-02352026) ea Imagine Institute Foundation (Paris, França).

1. Transdução MLV de Células Humanas <ol><li> Isolar as cï¿½ulas alvo e transduzi-las com um vector retroviral derivado de mLV contendo o gene repï¿½ter eGFP e pseudotipado com o VSV-G de estomatite vesicular ou a glicoproteï¿½a de envelope anfotrï¿½ico 16 . <ol><li> Manter as células simuladas transduzidas como um controlo negativo para as seguintes análises. Uma vez que os vectores retrovirais baseados em mLV podem transduzir células de divisão eficiente, cultivar a população de células alvo em condições que estimulam a divisão celular. As condições de transdução precisam ser especificamente optimizadas para cada tipo de célula em estudo. As condições de crescimento celular e transdução para progenitores hematopoiéticos humanos, células T e células epidérmicas estão descritas nas Referências 7, 14, 15 e 17. </li></ol></li><li> 48 h após a transdução, ressuspender 100 000 células em 300 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo 2% de soro bovino fetal e medir a expressão de eGFP por fBaixa citometria (laser de excitação de 488 nm). Utilizar células transduzidas de forma simulada como controlo negativo. Para a recuperação ideal do local de integração, purifique as células GFP + por Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS). </li><li> Recolher 0,5 a 5 milhões de células para a preparação de DNA genômico. É preferido um período de cultura mais longo (&gt; 7 dias) para diluir o provírus não integrado e necessário quando se analisa a progénie a longo prazo de células estaminais de boa fé (ver Secção de Discussão e referência 15 ). Os grânulos de células podem ser congelados instantaneamente e armazenados a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Amplificação dos locais de integração de mLV por PCR ligada a ligante (LM-PCR) <ol><li> Preparação de ADN genómico (gDNA) <ol><li> Extrair gDNA usando um kit de extração de DNA baseado em coluna e seguir o protocolo para células cultivadas, de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Enzima de restrição digestiem <ol><li> Preparar 4 digestões de enzimas de restrição por amostra em tubos de 1,5 mL. Digerir 0,1 a 1 μg de gDNA em cada tubo adicionando 1 μL de Tru9I (10 U) e 1 μL de Tampão M num volume final de 10 μL. Incubar as reacções a 65 ° C durante 6 h ou durante a noite. </li><li> Adicionar a cada reacção 1 μL de PstI (10 U), 1 μL de Tampão H e 8 μL de água. Incubar as reacções a 37 ° C durante 6 h ou durante a noite. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li></ol></li><li> Ligação ligante <ol><li> Preparar uma solução de reserva de ligante Tru9I 100 μM num tubo de 1,5 mL misturando os oligonucleótidos de cadeia mais ligante e ligante menos cadeia a uma concentração de 100 μM. Colocar o tubo em água a 100 ° C e deixar arrefecer à temperatura ambiente. A solução stock do ligante Tru9I pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Estabelecer 8 reações ligadura linker em tubos de 1,5 mL. Para cada reacção, adicione o seguinte componenteS a 10 μL de digestão com enzima de restrição: 1,4 μL de tampão de reacção de 10X T4 ADN Ligase, 1 μL de ligante Tru9I 10 μM, 1 μL (2 000 U) de T4 DNA ligase e 0,6 μL de água. Incubar a 16 ° C durante 3 a 6 h. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li></ol></li><li> Primeiro PCR <ol><li> Estabelecer 48 reações de PCR (6 reações de cada tubo de ligação) em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 2 μL de reacção de ligação: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de desoxinucleótido 10 mM (dNTP), 1 μL de iniciador ligante 10 μM, 1 ΜL de iniciador LTR mLV-3 &#39;10 μM, 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polimerase e 37,7 μL de água. As sequências de iniciadores são fornecidas na Tabela 1. </li><li> Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 °; C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li></ol></li><li> Segunda PCR <ol><li> Configure 48 reações de PCR (1 de cada &quot;primeiro tubo de PCR&quot;) em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicione os seguintes componentes a 2 μL da primeira reacção de PCR: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de dNTP 10 mM, 1 μL de iniciador aninhado 10 μM, 1 Μl de iniciador aninhado mLV-3 &#39;LTR 10 μM, 0,3 μL de Taq DNA Polimerase (1,5 U) e 37,7 μL de água. Use iniciadores aninhados projetados para a estratégia de seqüenciamento maciça específica escolhida: (i) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 &#39;LTR compatível com a plataforma Illumina; (Ii) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 &#39;LTR compatível com a plataforma Roche. As sequências de iniciadores estão listadas na Tabela 1 . </li><li> Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25Ciclos de 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li><li> Juntar as 48 reacções de PCR aninhadas num tubo de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li></ol></li><li> Determinar a presença e o tamanho dos produtos LM-PCR por electroforese em gel de agarose. <ol><li> Adicionar 4 μL de tampão de carga a 20 μL de produtos de LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de DNA de 100 pb. Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e visualizar os produtos de PCR por coloração com brometo de etídio. </li><li> Executar uma reacção de LM-PCR a partir da amostra transduzida de forma simulada como controlo negativo. </li></ol></li><li> Precipitar os amplicões adicionando 0,1 volumes de solução de acetato de sódio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misturar e congelar a -80 ° C durante 20 min. <ol><li> Girar em fuLl em uma microcentrífuga padrão a 4 ° C por 20 min. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol a 70%. Girar à velocidade máxima numa microcentrífuga padrão a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e secar ao ar a pastilha. Adicionar 200 μL de água de grau PCR e ressuspender o DNA. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas. </li></ol></li><li> Adicionar 20 μL de tampão de carga a 100 μL dos produtos LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de ADN de 100 pb. <ol><li> Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e cortar a porção do gel contendo 150 a 500 pb de comprimento amplicons. </li><li> Purificar os produtos LM-PCR com um kit de extração de gel à base de coluna e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV. </li></ol></li><li> Utilizar 1 μL de biblioteca para avaliar o comprimento dos produtos LM-PCR utilizando um instrumento bioanalisador, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li><sTrong&gt; Clonagem de espingardas de amplicons <ol><li> Utilizar 20 ng dos produtos LM-PCR purificados e cloná-los no vector pCR2.1-TOPO, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Efectuar reacções de sequenciação utilizando o iniciador M13 Universal, seguido de mapeamento genómico das sequências resultantes, para revelar a presença das junções do genoma viral (incluindo o iniciador aninhado LTR mLV-3 &#39;) em&gt; 50% dos clones para identificar amostras adequadas Para sequenciamento maciço. Exemplo de uma junção viral-genoma: <img alt="Junção" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> O iniciador aninhado MLV-3 &#39;LTR 454 e o iniciador aninhador ligador 454 ( Tabela 1 ) estão indicados em negrito e a extremidade 3&#39; da LTR viral em itálico. A sequência genómica humana é realçada em texto vermelho (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Seqüenciamento maciço de sites de integração mLV NOTA: Produtor LM-PCRPodem ser sequenciados usando plataformas comerciais (escolhendo o par de iniciadores aninhados apropriado na segunda reação de PCR, veja a subseção 2.5.1). Para seqüenciamento pela plataforma de pirosequenciação Roche GS-FLX, consultar os artigos anteriores 7 , 14 , 15 . Nesta seção, um protocolo recém-otimizado para a plataforma de sequenciamento Illumina é descrito. <ol><li> Preparação da biblioteca <ol><li> Estabelecer 1 reação de PCR de indexação por amostra em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 5 μL (150-170 ng) de produto de LM-PCR purificado: 5 μL de Index Primer 1, 5 μL de Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix e 10 μL de PCR- Grau água. Use uma combinação de índice diferente para cada amostra. </li><li> Realizar as reacções de PCR num termociclador com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 3 min; 8 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 5 mdentro; Mantenha a 4 ° C. </li><li> Purificar os produtos de PCR utilizando um protocolo de isolamento de grânulos de imobilização reversível em fase sólida (SPRI): em tubos novos de 1,5 mL, adicionar 56μL de esferas a cada amostra e seguir as instruções do fabricante. Eluir em 25 μL de Tris-HCl 10 mM. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Verificação de biblioteca <ol><li> Utilizar 1 μL de amostra para avaliar o tamanho da biblioteca utilizando um instrumento de bioanálise. </li><li> Utilizar 1 μL de amostra para quantificar a molaridade da biblioteca utilizando um ensaio de PCR em tempo real baseado em fluorescência, de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Diluição e sequenciação da biblioteca <ol><li> Diluir as bibliotecas até 10 nM utilizando Tris-HCl 10 mM. Para pooling bibliotecas, transferir 5 μL de cada biblioteca diluída para um novo tubo de 1,5 mL e, em seguida, diluir o pool para 4 nM em Tris-HCl 10 mM. </li><li> Misture 5 μL de solução diluída com 5 μL de NaOH 0,2 N em uma nova solução de 1,5 mL tubo, vórtice brevemente, spin-down e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas. </li><li> Coloque os tubos em gelo e adicione 990 μL de tampão de hibridização pré-refrigerado (HT1). Alíquota 300 μL de pool desnaturado em um novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de 10 pM. </li><li> Em paralelo, misturar 2 μL de biblioteca de controlo PhiX (10 nM) com 3 μL de Tris-HCl 10 mM num tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de NaOH 0,2 N, agitar vortex brevemente, centrifugar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar a PhiX diluída. Coloque o tubo em gelo e adicione 990 μL de HT1 pré-resfriado. </li><li> Alíquota de 300 μL de PhiX desnaturado num novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-arrefecido para obter uma PhiX final de 10 μM. </li><li> Num novo tubo de 1,5 mL, misturar 510 μL de pool de biblioteca desnaturado com 90 μL de biblioteca PhiX desnaturada, obtendo-se assim um pool final de 10 μM com 15% de controlo PhiX. </li><li> Pipetar estes 600 μL de amostraVolume no reservatório de amostra de carga do cartucho de reagente de sequenciaï¿½o descongelado e prosseguir imediatamente para executar um ciclo de 150 ciclos. NOTA: Os reagentes críticos e sequências de iniciadores necessários para este protocolo estão listados na Tabela 1 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos um protocolo para genoma de todo o mapeamento dos locais de integração de mLV, um retrovírus que metas regiões cromatina, epigenicamente marcado como promotores ativos e potenciadores. As etapas críticas e / ou limitações do protocolo incluem: (i) a transdução mLV da população de células alvo; (Ii) amplificação de junções vírus-hospedeiro por LM-PCR; (Iii) recuperação de uma fração elevada de locais de integração. Os vectores retrovirais baseados em mLV transduzem eficientemente células em divisão. A b...

A identidade celular é determinada pela expressão de conjuntos específicos de genes. O papel dos elementos reguladores cis, tais como promotores e intensificadores, é crucial para a activação de programas de transcrição específicos do tipo celular. Estas regiões reguladoras são caracterizadas por características específicas da cromatina, tais como modificações peculiares das histonas, factores de transcrição e ligação dos co-factores e acessibilidade à cromatina, que têm sido amplamente utilizados para a sua identificação genómica em vários tipos de células 1 , 2 , 3 . Em particular, o perfil genï¿½ico de acetilaï¿½o da histona H3 lisina 27 (H3K27ac) ï¿½ comummente utilizado para definir promotores activos, potenciadores e super-potenciadores 4 , 5 , 6 . O vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) é um gamma-retrovírus que é amplamente utilizado para o geneTransferência em células de mamíferos. Depois de infectar uma célula alvo, o genoma retroviral de ARN é retrotraducido numa molécula de ADN de cadeia dupla que se liga a proteínas virais e celulares para montar o complexo de pré-integração (PIC). O PIC entra no núcleo e liga a cromatina da célula hospedeira. Aqui, a integrase viral, um componente PIC chave, medeia a integração do ADN proviral no genoma da célula hospedeira. A integração de mLV no DNA genómico não é aleatória, mas ocorre em elementos reguladores cis-activos, tais como promotores e intensificadores, numa forma específica de célula 7 , 8 , 9 , 10 . Este perfil de integração peculiar é mediado por uma interacção directa entre a integrase de mLV e as proteínas do domínio do bromodominio celular e do domínio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . As proteínas BET (BRD2, BRD3 eBRD4) atuam como uma ponte entre a cromatina do hospedeiro e o PIC mLV: através de seus bromodominios eles reconhecem regiões reguladoras cis altamente acetiladas, enquanto que o domínio extraterminal interage com a integrase mLV 11 , 12 , 13 . Aqui, descrevemos a varredura retroviral, uma nova ferramenta para mapear regiões cis-reguladoras ativas com base nas propriedades de integração de mLV. Resumidamente, as células são transduzidas com o vector retroviral derivado de mLV que expressa o gene repórter de proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Após a extracção do ADN genómico, as junções entre a repetição terminal longa (LTR) 3 &#39;do vector mlV e o ADN genómico são amplificadas por PCR (LM-PCR) mediada por ligantes e sequenciadas maciçamente. Os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano e as regiões genómicas altamente direccionadas por mLV são definidas como agrupamentos de locais de integração de mLV. Varredura retroviralNing foi usado para definir elementos específicos reguladores de células específicas em várias células primárias humanas 14,15. MLV co-mapeados com promotores epigenicamente definidos e potenciadores, a maioria dos quais abrigou marcas de histonas activas, tais como H3K27ac, e foram específicos de células. A varredura retroviral permite a identificação genômica de elementos reguladores do DNA em populações de células purificadas prospectivamente 7,14 , bem como em populações celulares retrospectivamente definidas, como as células-tronco de queratinócitos, que carecem de marcadores efetivos para o isolamento prospectivo 15 .

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tubos de 0,2 ml</td><td>fornecedor</td><td></td><td></td>de laboratório geral</tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>fornecedor</td><td></td><td></td>de laboratório geral</tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente T4 DNA ligase&nbsp;</td>Tampão de reação de DNA ligase New <td>England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4</td><td>Ligante New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr>Plus <td>Fornecedor</td><td></td> de laboratório geral<td>de oligonucleotídeos de fita</td><td>5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (Grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr><tr>Ligante <td></td> menos fornecedor <td>de laboratório geral</td> <td>de oligonucleotídeos de fio 5</td><td>'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase Alta Fidelidade&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>PCR grau de água</td> fornecedor <td>de laboratório</td><td></td><td></td>geral</tr><tr><td>Termociclador de 96 poços (com tampa aquecida)</td> <td>fornecedor</td><td></td><td></td>geral de laboratório</tr><tr><td>linker primer</td><td>fornecedor geral de laboratório</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grau de purificação: grau PCR)</td></tr><tr><td>MLV-3' Fornecedor</td><td></td><td></td> geral de laboratório de primer LTR <td>5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grau de purificação: grau PCR)</td></tr><tr><td>linker aninhado primer 454</td> fornecedor <td></td><td>de laboratório geral</td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG [AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr> <tr><td>MLV-3 ' LTR aninhado primer 454</td> fornecedor <td></td><td>de laboratório geral</td><td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC [GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC] (Grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr> <tr><td>linker aninhado primer Illumina</td><td>fornecedor de laboratório</td><td></td> geral <td>5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC] (Grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr> <tr><td>MLV-3 ' Primer aninhado LTR Illumina</td> fornecedor <td></td><td>de laboratório geral</td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grau de purificação: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Solução de acetato de sódio (3M) pH 5.2</td><td>fornecedor</td><td></td><td></td>de laboratório geral</tr><tr><td>Etanol (absoluto) para biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Topo TA Kit de clonagem (com vetor pCR2.1-TOPO)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>ou</td></tr><tr><td>brometo de etídio equivalente&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>6x Loading Buffer</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 ou FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético Dynal para tubos de 2 ml</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Kit Agencourt AMPure XP 60 ml</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>fornecedor</td><td></td><td></td>de laboratório geral</tr><tr><td>Agilent 2200 Sistema TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>D1000 Reagentes</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit para plataformas Illumina (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Sistema de PCR em Tempo Real Rápido</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, molecular </td> fornecedor <td></td><td></td><td>de laboratório geral</td> de grau biológico</tr><tr><td>HT1 (Tampão de Hibridização)</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>Fornecido no Kit</td><td></td>de Reagentes</tr><tr><td>MiSeq Kit de Reagentes MiSeq v3 (150 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

varredura retroviral: mapeamento de sites de integração mlv para definir regiões reguladoras específicas de células

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Os vectores retrovirais baseados em vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) integram-se predominantemente em intensificadores e promotores acetilados. Por esta razão, os locais de integração mLV podem ser utilizados como marcadores funcionais de elementos reguladores activos. Aqui, apresentamos uma ferramenta de varredura retroviral, que permite a identificação genoma-wide de potenciadores e promotores específicos de células. Resumidamente, a população de células alvo é transduzida com um vector derivado de mLV e o ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição de corte frequente. Após ligação dos fragmentos genómicos com um ligador de ADN compatível, a reacção em cadeia da polimerase mediada por ligante (LM-PCR) permite a amplificação das junções do genoma do vírus-hospedeiro. A sequenciação maciça dos amplicões é utilizada para definir o perfil de integração de mLV em todo o genoma. Finalmente, agrupamentos de integrações recorrentes são definidos para identificar as regiões reguladoras específicas de células, responsáveis ​​pela ativação de programas de transcrição específicos de células. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; A ferramenta de varredura retroviral permite a identificação genômica de promotores e intensificadores específicos de células em populações de células alvo prospectivamente isoladas. Notavelmente, a varredura retroviral representa uma técnica instrumental para a identificação retrospectiva de populações raras ( por exemplo , células estaminais somáticas) que não possuem marcadores robustos para isolamento prospectivo.

Fluxo de trabalho do procedimento de varredura retroviral O fluxo de trabalho do procedimento de varrimento retroviral é esquematizado na Figura 1 . A população de células alvo é purificada e transduzida com um vector retroviral derivado de mLV que expressa um gene repórter eGFP. O transgene é flanqueado pelas duas repetições terminais longas idênticas (5 &#39;e 3&#39; LTR), assegurando a síntese, a ...

Descrevemos aqui um protocolo para o mapeamento genï¿½ico dos sï¿½ios de integraï¿½o de vectores retrovirais baseados em vï¿½us de leucemia murina de Moloney em cï¿½ulas humanas.

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear os sítios de integração de vetores retrovirais derivados do vírus da leucemia murina para definir regiões reguladoras específicas de células. Este método pode ajudar a responder questões-chave em estudos de terapia gênica e regulação gênica, como onde o vetor se integra no genoma humano e quais elementos reguladores podem ser ativamente utilizados por meio de um subtipo particular. Tivemos inicialmente a ideia para este método ao observar que, em estudos de terapia gênica, os vetores MLV se integram em promotores e enhancers ativos e específicos de subtipo.Inicie transduzindo as células-alvo com um vetor retroviral derivado do MLV que contenha o gene repórter EGFP e pseudotipado com VSV-G ou com a glicoproteína envelope anfrotrópica. Células mock transduzidas são utilizadas como controle negativo. 48 horas após a transdução, centrifugue as amostras e, em seguida, re-suspenda 100.000 células em 300 microlitros de PBS contendo dois por cento de soro bovino fetal.Em seguida, meça a expressão de EGFP por análise de citometria de fluxo. Recolha outras 0,5 a cinco milhões de células transduzidas para preparação de DNA genômico e subsequente digestão com enzima de restrição. Prepare quatro digestões com enzima de restrição por amostra em tubos de 1,5 mililitro.Digira de 0,1 a um micrograma de G-DNA em cada tubo. Adicionando 10 unidades de TRU91 e um microlitro do tampão M por amostra em um volume final de 10 microlitros. Distribua dois microlitros da mistura nos tubos de digestão.Em seguida, incubar as reações a 65 graus Celsius por seis horas ou durante a noite. Após a incubação, adicionar 40 microlitros de água a um tubo de 1,5 mililitro. No mesmo tubo, adicionar 10 unidades de PST1 e um microlitro do tampão H por amostra.Dispense 10 microlitros da mistura de reação de digestão nos tubos de digestão. Incube as reações a 37 graus celsius por seis horas ou durante a noite. No dia seguinte, prepare oito reações de ligação de conectores em tubos de 1,5 mililitro.Para cada reação, adicione a mistura de reação da ligase a 10 microlitros do DNA genômico digerido. Incube a 16 graus Celsius por três a seis horas. Para a PCR de primeira rodada, prepare 48 reações de PCR em tubos de 0,2 mililitro.Para cada PCR, adicione a mistura de reação contendo o iniciador ligante e o iniciador MLV3 prime LTR a dois microlitros da reação de ligação. Coloque as amostras em um ciclador térmico com tampa aquecida. Configure os parâmetros de ciclagem e realize a primeira rodada da reação de PCR.Para a PCR da segunda rodada, prepare a mistura de reação contendo o iniciador aninhado do ligador e o iniciador aninhado do LTR 3' do MLV. Em seguida, adicione dois microlitros do produto da PCR da primeira rodada como molde. Então, realize a reação de PCR da segunda rodada para gerar os produtos finais de PCR LN.Após a PCR de segundo ciclo, reunir as 48 reações de PCR LM aninhadas em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicionar 20 microlitros de tampão de carregamento a 100 microlitros do produto de PCR LM agrupado e precipitado. E aplicar a amostra em um gel de agarose a um por cento junto com a escada de DNA de 100 pares de base.Execute o gel a cinco volts por centímetro durante 30 a 60 minutos, uma vez que as bandas estejam definidas, e recorte a porção do gel contendo amplicons de 500 a 150 pares de bases. Após purificar o produto da PCR de ligação mediada (LM PCR) com um kit de extração de gel baseado em coluna, meça a concentração utilizando um espectrofotômetro UV antes de prosseguir para a preparação da biblioteca. Além disso, avalie o comprimento dos produtos da LM PCR utilizando um equipamento bioanalisador, conforme as instruções do fabricante.Prepare a biblioteca realizando uma PCR de indexação. Para cada PCR, utilize de 150 a 170 nanogramas do produto de PCR de LM purificado, com combinações de index diferentes para cada amostra. Realize a PCR em um termociclador com tampa aquecida, conforme indicado.Após a PCR, dilua a biblioteca purificada para 10 nanomolar com tris HCL 10 milimolar. Em seguida, misture cinco microlitros do pool diluído com cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,2 normais em um novo tubo de 1,5 mililitro. Vortex brevemente, centrifugue e depois incube por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas.Coloque os tubos do pool desnaturado em gelo e 990 microlitros de tampão de hibridização HT1 pré-resfriado. Em seguida, alíquota 300 microlitros do pool desnaturado em um novo tubo de 1,5 mililitro. E adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de dez picomolar.Em paralelo, misture 10 nanomolares da biblioteca controle fixada em um volume de dois microlitros com 3 microlitros de tris HCl 10 milimolares em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,2 newtons e vortex brevemente. Após centrifugar, incube por cinco minutos à temperatura ambiente para desnaturar a fixação diluída.Após a incubação, coloque o tubo em gelo e adicione 990 microlitros de HT1 pré-resfriado. Agora, alíquota 100 microlitros do fixador desnaturado em um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter uma concentração final de 10 picomolar de fixador. Finalmente, em um novo tubo de 1,5 mililitro, misture 510 microlitros do pool de biblioteca desnaturado com 90 microlitros da biblioteca fixadora desnaturada, obtendo assim um pool final de 10 picomolar com 15% de controle de fixador para sequenciamento.Esta imagem mostra a análise de 3498, 2989 e 4103 agrupamentos de sítios recorrentes de integração de MLV em células-tronco progenitoras hematopoéticas, progenitores eritroides e progenitores mieloides, respectivamente. Em cada população celular, mais de 95% dos agrupamentos de MLV sobrepuseram-se a enhancers e promotores definidos epigeneticamente. As regiões-alvo de MLV específicas a cada célula apresentavam alta acetilação e estavam associadas à expressão específica da célula do gene direcionado.Exemplos são o promotor do gene SPINK2 específico para HSP. A região de controle do locus contendo potentes enhancers dos genes da globina beta-like específicos para eritróide. Enhancers localizados a montante do gene LYZ específico para NPP.Ensaios de repórter luciferase validaram o subconjunto de potenciadores específicos de célula direcionados pelo MLV em EPP e MPP. Regiões direcionadas pelo MLV específicas de eritróides apresentaram maior atividade em EPP do que em MPP, e vice-versa, confirmando que o MLV identifica potenciadores específicos de célula que possivelmente controlam a expressão de genes próximos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma semana se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de maximizar a frequência de células transduzidas para obter a melhor recuperação possível dos sítios de integração. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como mapear os sítios de integração viral, primeiro ajustando o DNA genômico, em seguida ligando os fragmentos genômicos a um ligante de DNA, amplificando posteriormente a junção entre o genoma do hospedeiro e o vírus por meio de PCR com ligação mediada (LM-PCR) e, por fim, realizando sequenciamento profundo da biblioteca de amplicons.

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Retrovírus humanos endógenos (HERV), que ocupam a 8% do genoma humano, manter reduzidas capacidades de codificação, mas a centenas de milhares de repetições terminais longas (LTRs). Um costume microarray Affymetrix foi desenhado para identificar indivíduo expressão HERV lugar e foi usado em tecidos de câncer de próstata como uma prova de conceito para futuros estudos clínicos.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Linear-amplificação mediada (LAM)-PCR é um método desenvolvido para identificar as posições exactas dos vectores de integração no genoma viral. A técnica evoluiu para ser o método superior para estudar a dinâmica clonais em pacientes de terapia genética, biossegurança de tecnologias inovadoras de vetores, a diversidade de células T, modelos de células-tronco do câncer, etc...

Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

Aprenda a mapear sites de integração de vetores retrovirais derivados de MLV em células humanas para identificar regiões reguladoras específicas. Este método auxilia na otimização de estratégias de terapia gênica.

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

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