Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

O objetivo geral deste procedimento é mapear locais de integração de vetores retrovirais derivados do vírus da leucemia murina para definir regiões regulatórias específicas da célula. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em estudos de terapia gênica e regulação gênica, como onde o vetor se integra ao genoma humano e qual elemento regulador pode usar ativamente por meio de um subtipo específico. Tivemos a ideia para este método observando que, em estudos de terapia gênica, os vetores MLV se integram a promotores e intensificadores subespecíficos ativos.

Comece transduzindo as células-alvo com um vetor retroviral derivado de MLV que abriga o gene repórter EGFP e pseudotipado com VSV-G ou a glicoproteína do envelope anfrotópico. Células transduzidas simuladas são usadas como controle negativo. 48 horas após a transdução, centrifugue as amostras e ressuspenda 100.000 células em 300 microlitros de PBS contendo dois por cento de soro bovino fetal.

Em seguida, meça a expressão do EGFP por análise métrica do local de fluxo. Colha outros 0,5 a cinco milhões de células transduzidas para preparação de DNA genômico e subsequente digestão de enzimas de restrição. Configure quatro digestões de enzimas de restrição por amostra em tubos de 1,5 mililitro.

Digerir 0,1 a um micrograma de G-DNA em cada tubo. Adicionando 10 unidades de TRU91 e um microlitro de tampão M por amostra em um volume final de 10 microlitros. Dispense dois microlitros da mistura em tubos de digestão.

E então incube as reações a 65 graus Celsius por seis horas ou durante a noite. Após a incubação, adicione 40 microlitros de água a um tubo de 1,5 mililitro. No mesmo tubo, adicione 10 unidades de PST1 e um microlitro de tampão H por amostra.

Dispense 10 microlitros da mistura de reação de digestão nos tubos de digestão. Incube as reações a 37 graus Celsius por seis horas ou durante a noite. No dia seguinte, configure oito reações de ligação ligante em tubos de 1,5 mililitro.

Para cada reação, adicione a mistura de reação de ligase a 10 microlitros do DNA genômico da digestão. Incube a 16 graus Celsius por três a seis horas. Para PCR de primeira rodada, configure 48 reações de PCR em tubos de 0,2 mililitro.

Para cada PCR, adicione a mistura de reação contendo o primer ligante e o primer MLV3 prime LTR a dois microlitros da reação de ligação. Coloque as amostras em um termociclador com tampa do aquecedor. Defina os parâmetros de ciclagem e execute a reação de PCR da primeira rodada.

Para a segunda rodada de PCR, configure a mistura de reação, incluindo primer aninhado de ligante e primer aninhado MLV3 prime LTR. Em seguida, adicione dois microlitros do produto de PCR da primeira rodada de PCR como modelo. Em seguida, execute a reação de PCR de segunda rodada para gerar os produtos finais de PCR do LN.

Após a segunda ronda de PCR, retirar as 48 reações de PCR LM aninhadas num tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione 20 microlitros de buffer de carregamento a 100 microlitros do produto LM PCR agrupado e precipitado. E carregue a amostra em um gel de agarose a um por cento junto com a escada de DNA de 100 pares de bases.

Execute o gel a cinco volts por centímetro por 30 a 60 minutos assim que as bandas forem resolvidas, corte a proporção do gel contendo 500 a 150 amplicons de pares de bases longos. Depois de purificar o produto LM PCR com um kit de extração de gel baseado em coluna, meça a concentração usando um espectrofotômetro UV antes de prosseguir com a preparação da biblioteca. Além disso, avalie o comprimento dos produtos LM PCR usando um instrumento bioanalisador de acordo com as instruções do fabricante.

Prepare a biblioteca configurando um PCR de indexação. Para cada PCR, utilizar 150 a 170 nanogramas de produto LM PCR purificado, em diferentes combinações de índices para cada amostra. Realize a PCR em um termociclador com tampa aquecida, conforme indicado.

Após a PCR, diluir a biblioteca purificada a 10 nanomolares com 10 tris HCL milimolar. Em seguida, misture cinco microlitros de piscina diluída com cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,2 newtons em um novo tubo de 1,5 mililitro. Vortex brevemente, gire para baixo e incube por cinco minutos em temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas.

Coloque os tubos da piscina desnaturada no gelo e 990 microlitros de tampão de hibridização HT1 pré-resfriado. Em seguida, alíquota de 300 microlitros de piscina desnaturada em um novo tubo de 1,5 mililitro. E adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de dez picomolares.

Paralelamente, misture 10 nanomolares de biblioteca de controle fixa em um volume de dois microlitros com 3 microlitros de 10 milimolares tris HCl em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco microlitros de hidróxido de sódio de 0,2 newtons e vórtice brevemente. Depois de girar, incube por cinco minutos em temperatura ambiente para desnaturar a correção diluída.

Após a incubação, coloque o tubo no gelo e adicione 990 microlitros de HT1 pré-resfriado. Agora, alíquota de 100 microlitros de correção desnaturada em um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 300 microlitros de HT1 pré-resfriado para obter uma concentração final de correção de 10 picomolares. Finalmente, em um novo tubo de 1,5 mililitro, misture 510 microlitros de pool de biblioteca desnaturada com 90 microlitros de biblioteca fixa desnaturada, obtendo assim um pool final de 10 picomolares com 15% de controle de fixação a ser sequenciado.

Esta imagem mostra a análise de 3498, 2989 e 4103 clusters de locais de integração recorrente de MLV em células-tronco progenitoras hematopoiéticas, progenitores eritróides e progenitores mieloides, respectivamente. Em cada população de células, mais de 95% dos clusters de MLV se sobrepuseram a intensificadores e promotores epigeneticamente definidos. As regiões específicas do MLV foram altamente acetiladas e associadas à expressão específica da célula do gene alvo.

Exemplos são o promotor do gene SPINK2 específico da HSP. A região de controle do locus contendo potenciadores potentes dos genes da globina beta específica do eritróide. Intensificadores localizados a montante do gene LYZ específico da NPP.

Os ensaios repórter de luciferase validaram o subconjunto de intensificadores direcionados a MLV específicos de células em EPP e MPP. As regiões específicas do MLV eritróide tiveram maior atividade no EPP do que no MPP e vice-versa, confirmando que o MLV identifica intensificadores específicos da célula possivelmente controlando a expressão de genes próximos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de maximizar a frequência das células transduzidas para uma recuperação ideal do local de integração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como mapear os locais de integração viral, primeiro ajustando o DNA genômico e, em seguida, ligando os fragmentos genômicos com um ligante de DNA, seguido pela amplificação da junção viral do genoma do hospedeiro via LM PCR e, por último, sequenciamento profundo da biblioteca amplicon.