Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)
18 de agosto de 2017
Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.
O objetivo geral deste ensaio imuno-MALDI automatizado é quantificar peptídeos e proteínas intactas em fluidos biológicos complexos de maneira precisa e sensível. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da proteômica quantitativa, como quantificar os níveis de proteína para diagnóstico ou para monitorar a resposta de um paciente ao tratamento. A principal vantagem desse método é que ele pode quantificar os níveis de proteína com muita sensibilidade e precisão a partir de amostras complexas.
Essa técnica permite o diagnóstico de doenças em um estágio inicial, pois a etapa de imunoenriquecimento do ensaio permite a quantificação de biomarcadores proteicos e peptídicos pouco abundantes. Embora esse método possa fornecer informações sobre a atividade da renina plasmática, ele também pode ser aplicado a outros estudos relacionados a doenças, como quantificação de proteínas relacionadas ao câncer para prognóstico, diagnóstico e gerenciamento de tratamento. Para iniciar este procedimento, descongele as amostras de plasma humano em banho-maria em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, coloque as amostras no gelo até que estejam completamente descongeladas. Em seguida, transfira manualmente 200 microlitros de cada amostra de plasma para poços separados de uma placa de poço de 1,1 mililitro de profundidade. Centrifugar a placa durante 10 minutos a dois graus Celsius e a 3 000 rpm.
Em seguida, use o Bravo para diluir em série uma solução padrão de 500 femtomol por microlitro Ang-1 NAT para preparar seis soluções calibradoras com albumina de clara de ovo de galinha. Após a centrifugação, pipete 200 microlitros de cada calibrador para um poço e 125 microlitros de tampão de geração para a placa de amostra. Usando um sistema automatizado de manuseio de líquidos, misture 125 microlitros de sobrenadante de plasma ou 125 microlitros da solução de albumina de clara de ovo de galinha com 25 microlitros de tampão de geração de angiotensina I em uma nova placa de poço profundo de 1,1 mililitro.
Agora, transfira automaticamente as soluções para uma placa de 96 poços com três repetições por solução e 34 microlitros de solução por poço. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Para conjugação do anticorpo com grânulos de proteína G, primeiro transfira 78 microlitros de pasta de grânulos previamente preparada para um tubo de 1,5 mililitro.
Lave as contas sete vezes com um mililitro de acetonitrila a 25% em PBSC e três vezes com um mililitro de PBSC, usando um suporte magnético para peletar as contas entre cada lavagem. Após lavar as contas, ressuspenda-as em 110 microlitros de PBSC e adicione 110 microlitros de anticorpo anti-angiotensina I. Misture as esferas e a solução pipetando.
Em seguida, incube as esferas em temperatura ambiente por uma hora enquanto gira a oito rpm. Em seguida, lave as contas três vezes com um mililitro de PBSC. Em seguida, ressuspenda as esferas em 1.100 microlitros de PBSC.
Agora, transfira manualmente a solução de esferas para uma placa de 96 poços. Em seguida, faça com que a alíquota Bravo das contas na mesma placa de 96 poços. Após o período de geração de angiotensina I de três horas, coloque a placa de incubação no gelo por 10 minutos para encerrar a geração de angiotensina I. Dilua automaticamente uma solução de estoque de peptídeo padrão de isótopo estável 100 vezes com tampão PBS.
Além disso, alíquota automática da diluição do peptídeo padrão do isótopo estável para uma placa de PCR de 96 poços. Transfira 10 microlitros da solução peptídica diluída para cada poço da placa de incubação. Misture a solução peptídica diluída com as amostras de plasma ou a solução de albumina de clara de ovo de galinha.
Adicione automaticamente a amostra ou soluções padrão às soluções de grânulos à placa de incubação e misture. Após incubar uma hora, lave automaticamente os grânulos três vezes com solução de bicarbonato de amônio de cinco milimolares. Use um ímã para puxar as contas para o fundo após cada lavagem.
Após a última lavagem, adicione 10 microlitros da solução de bicarbonato de amônio a cada poço para ressuspender as contas. Transfira automaticamente sete microlitros da pasta de esferas para uma placa alvo MALDI com um tamanho de ponto de 2.600 micrômetros. Depois que os grânulos secarem, adicione automaticamente dois microlitros de solução de matriz HCCA previamente preparada do poço da matriz em cada ponto de amostra na placa alvo.
Em seguida, analise os pontos de amostra com um instrumento MALDI-TOF usando o modo refletor positivo. Execute calibração interna, suavização de dados e subtração de linha de base com o software específico do fornecedor. O procedimento iMALDI automatizado para medir a angiotensina I permite a análise de alto rendimento de um grande número de amostras com um coeficiente de variação intradiário abaixo de 10% Os espectros representativos obtidos pela medição da angiotensina I em amostras de plasma humano são exibidos aqui.
A correlação dos valores de PRA de 188 amostras de pacientes obtidas com o ensaio iMALDI automatizado com os valores de PRA obtidos usando um procedimento clínico de LC-MS/MS é mostrada aqui. Os dois métodos têm um coeficiente de correlação de 0,98, e a diferença entre as inclinações pode ser devido ao uso de diferentes padrões internos ou diferentes anticorpos. A faixa linear do ensaio e a precisão do ensaio são exibidas aqui.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas. Ao tentar este procedimento, lembre-se de ajustar corretamente a cabeça da ponta e a velocidade de manuseio de líquidos. Após esse procedimento, métodos adicionais podem ser usados para confirmar o aldosteronismo primário em pacientes, incluindo testes orais de carga de sal ou infusão de solução salina.
A técnica automatizada iMALDI permite a triagem quantitativa específica e precisa de amostras biológicas, incluindo amostras de pacientes, para proteínas ou peptídeos relacionados a doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio iMALDI automatizado para quantificação de proteínas e peptídeos baseada em espectrometria de massa. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas, como plasma humano, é extremamente perigoso, e as precauções de segurança necessárias devem sempre ser tomadas durante a execução do procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para quantificar peptídeos e proteínas intactas em fluidos biológicos complexos usando a tecnologia automatizada immuno-MALDI (iMALDI). O método é projetado para fornecer medições precisas e sensíveis, auxiliando no diagnóstico e monitoramento do tratamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Proteômica
- Ensaios Biológicos
- Diagnósticos
Contexto
- A proteômica quantitativa é essencial para entender os níveis de proteínas em várias condições.
- Biomarcadores de proteínas e peptídeos pouco abundantes podem ser desafiadores de quantificar.
- O diagnóstico precoce de doenças pode impactar significativamente os resultados do tratamento.
- Técnicas automatizadas melhoram a sensibilidade e precisão na quantificação de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método sensível e preciso para quantificação de proteínas.
- Facilitar o diagnóstico de doenças em estágio inicial.
- Fornecer insights sobre a atividade da renina plasmática e proteínas relacionadas ao câncer.
Métodos Usados
- Tecnologia automatizada immuno-MALDI (iMALDI).
- Passo de imuno-enriquecimento para proteínas pouco abundantes.
- Descongelamento de amostras de plasma humano para análise.
- Quantificação de proteínas e peptídeos em fluidos biológicos complexos.
Principais Resultados
- O método permite a quantificação sensível de proteínas a partir de amostras complexas.
- Pode ser aplicado a vários estudos relacionados a doenças.
- O diagnóstico precoce de doenças é facilitado através da medição precisa de proteínas.
- Insights sobre o monitoramento do tratamento e resposta do paciente podem ser obtidos.
Conclusões
- A tecnologia iMALDI automatizada é uma ferramenta valiosa na proteômica quantitativa.
- O método melhora a capacidade de diagnosticar doenças precocemente.
- Fornece uma estrutura para futuros estudos sobre quantificação de proteínas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
