Name: Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar peptídeos e proteínas em fluidos biológicos complexos usando iMALDI automatizado. Este método sensível e preciso auxilia no diagnóstico precoce de doenças e no monitoramento da resposta ao tratamento.

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Agradecemos o apoio financeiro de Canadá do genoma e genoma da Colúmbia Britânica para operações (204PRO) e desenvolvimento de tecnologia (214PRO) através de rede de inovações o genoma (gim). Agradecemos a plataforma de descoberta de drogas do Instituto de pesquisa do centro de saúde de Universidade McGill para a utilização do instrumento MALDI-TOF para as filmagens. H.L. é grato pelo apoio de uma bolsa de pós-doutorado do nacional de ciência e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). C.H.B é grato pelo apoio de fundo de dotação a Leading Edge (Lopes). C.H.B. é grato pelo apoio da cadeira McGill Segal em Oncologia Molecular da McGill University (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. e C.H.B. estão gratos pelo apoio de Warren Y. Soper Charitable Trust e o Alvin Segal Family Foundation para o Hospital Geral judaico (Montreal, Quebec, Canadá).

as quantidades dos reagentes descritos abaixo são baseadas na medição de 20 amostras de plasma do paciente. O protocolo apresentado abaixo segue as orientações do Universidade de Victoria &#39; Comissão de ética de pesquisa humana s.
 1. geração de Ang I em Plasma humano <ol><li>descongelar amostras de plasma (&#8805; 200 µ l) em uma sala de temperatura água banho por 5 min e em seguida, colocar as amostras no gelo até completamente derretido.</li>
	<li>Transferência de 200 µ l de cada amostra de plasma manualmente para separar poços de uma placa de poço profundo 1,1 mL (placa da amostra) e centrifugar a placa em uma centrífuga para 10 min a 2 ° C e g. de x 1278</li>
	<li>Usar um líquido automatizado sistema de manipulação para diluir em série 500 fmol / µ l Ang I NAT solução padrão para preparar seis soluções de Calibrador com albumina de ovo de galinha (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).</li>
	<li>Pipetar 200 µ l de cada Calibrador para um bem e 125 µ l da geração buffer para a placa da amostra. 
	Nota: O CEWA no buffer de solução salina tamponada (PBS) precisa ser preparado no dia do experimento de fosfato.</li>
	<li>Usando um líquido automatizado sistema de manipulação, em um novo prato misture 125 µ l de plasma sobrenadante ou 125 µ l de CEWA em PBS com 25 µ l de Ang eu buffer de geração, que contém 1 M Tris, ácido de 0,2 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1 mM fluoreto de phenylmethylsulfonyl (PMSF). 
	Nota: Preparar o Ang eu buffer de geração através da mistura de um 1 M Tris/0.2 mM EDTA aquosa de tampão (ajustar o pH 5.5 usando ácido acético) e uma solução PMSF (100mm em metanol). Ambas as soluções podem ser armazenadas 1 mês em soluções de mistura os dois 4 ° C. no dia do experimento.</li>
	<li>Automaticamente transferir as soluções para uma placa de 96 poços, 3 repetições por solução, 34 µ l por bem. Incubar a placa a 37 ° C por 3 h.</li>
</ol> 2. Imuno-enriquecimento de Ang eu grânulos revestidos usando anticorpo <ol><li>conjugação do anticorpo em grânulos de proteína G magnéticos Nota: conjugação do anticorpo com os grânulos é executada manualmente durante a 3h Ang eu período de geração na dia do experimento. Para outros analitos, os grânulos conjugados podem ser capazes de ser armazenado no buffer PBS contendo 0.015% CHAPS (PBSC) em 4 ° C, durante três meses ou mais, dependendo das propriedades e estabilidade do anticorpo.
	<ol><li>µ L 110 de transferência de dejetos de talão (o suficiente para medir 20 amostras e fazendo uma curva padrão de 6 pontos) em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos sete vezes com 1 mL de acetonitrila/PBSC de 25% e três vezes com 1 mL de PBSC. Use um suporte magnético para granular os grânulos entre cada etapa de lavagem. Retire o tampão de lavagem após a última lavagem. 
		Nota: Lavar 7 vezes com 25% acetonitrila/PBSC é crítica para a remoção dos aditivos incompatível com a MS no chorume do grânulo, tais como Tween-20. Se não houver nenhum desses aditivos em grânulos selecionados, esta etapa de lavagem extensa pode não ser necessária.</li>
		<li>Resuspend os grânulos no 110 µ l de PBSC e adicionar 110 µ l de anti-Ang eu anticorpo (concentração do anticorpo final: 100 µ g/mL). Misture a solução e grânulos pipetando e então eles incubar à temperatura ambiente durante 1 h, girando a 8 rpm.</li>
		<li>Lave os grânulos 3 vezes com 1 mL de PBSC e Resuspenda em µ l 1100 de PBSC. 
		Nota: Se qualquer solução de grânulo fluiu na tampa do tubo durante a incubação, spin para baixo a solução usando uma centrífuga de bancada em 2680 g. x</li>
		<li>Transferir a solução de talão manualmente para uma placa de 96 poços (grânulo placa padrão). Usar o líquido automatizado sistema de alíquota de manipulação as contas para a mesma placa de 96 poços, 120 µ l por bem..</li></ol></li> <li>imuno-enriquecimento em grânulos <ol><li>após a 3h Ang período de geração, coloco a placa de incubação na gelo durante 10 minutos terminar a geração de Ang I.</li>
		<li>Automaticamente diluir a solução-mãe SIS peptídeo (10 pmol/μL) 100-fold com PBS buffer e ainda mais automaticamente alíquota a diluição do padrão de peptídeo isoptope estável para um prato PCR de 96 poços. Transferência de 1,5 µ l de uma solução de peptídeo de padrões (SIS) isótopo estável (contendo 100 fmol) em cada poço da placa de incubação e misture com as amostras de plasma ou a CEWA nos buffers de PBS.</li>
		<li>Automaticamente transferir o conteúdo da placa de incubação para a solução do grânulo, 10 mL por bem, misturar a.</li>
		<li>Rodando a 8 rpm, incubar a placa a 4 ° C, durante 1 h.</li>
		<li>Lave os grânulos três vezes automaticamente com solução de bicarbonato de amónio (AmBic) de 5 mM, 100 µ l por alvéolo por lavagem. Após a última lavagem, resuspenda os grânulos em 7 µ l de solução AmBic em cada poço de 5 mM. Use um ímã para puxar os grânulos para o fundo após a última lavagem.</li>
	</ol></li></ol> 3. Transferência de contas em um prato de alvo de MALDI e adicionando a solução de matriz <ol><li>transferência 7 µ l do chorume grânulo automaticamente em um prato de alvo MALDI com um tamanho de ponto de 2.600 µm. Deixe secarem os grânulos. 
	Nota: Um pequeno ventilador alimentado por USB pode ser usado para acelerar o processo de secagem de talão.</li>
	<li>Automaticamente adicionar 2 µ l de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (HCCA)-solução de matriz (contendo 3 mg/mL HCCA, citrato de amónio de 1,8 mg/mL, acetonitrilo 70% e 0,1% o ácido trifluoroacético) da matriz bem para cada amostra local sobre a placa-alvo .</li>
</ol> 4. Aquisição por uma MALDI-TOF-MS e análise de dados de sinal pontos <ol><li>analisar a amostra com um instrumento de MALDI-TOF usando modo positivo refletor. Executar a calibração interna, suavização de dados e subtração de base automaticamente com o software específico do fornecedor. 
	Nota: O modo (linear/positivo/negativo, refletor) selecionado para medição de MALDI-TOF depende a peptídeos alvo ou proteínas.</li>
	<li>Calcular a taxa de resposta relativa (relação de intensidade de Nat/SIS) e compará-lo com a curva padrão para determinar do Ang eu concentração em cada amostra. Calcular PRA usando a equação (1), onde Δt Ang eu geração representa o tempo usado para a geração de Ang I. 
	PRA = [Ang eu] / Δt Ang eu geração (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
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<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
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<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B detém a patente sobre a tecnologia iMALDI.

Comparado a quantificação de proteína convencional baseada em MS, iMALDI utiliza anticorpos para enriquecer os analitos e purificá-los de amostras complexas, portanto, tornando possível quantificar proteínas ou peptídeos em baixas concentrações. Um passo crítico no protocolo iMALDI é o imuno-enriquecimento dos peptides alvo. Para este efeito, devem ser selecionados anticorpos com alta especificidade e afinidade. Em SISCAPA, relatou-se que seriam necessários para atingir alta sensibilidade em baixa ng/mL...

Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos1,2,3,4. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em concentrações ng/mL ou pg/mL, na presença de proteínas de alta-abundância, e muitos biomarcadores de candidato proteína encontradas no plasma humano são dentro desta escala5. Esse problema é causado pela maior parte pelo inerentemente ampla faixa dinâmica e complexidade do proteoma humano6.
Para superar esses desafios de deteção, foram desenvolvidos métodos imuno-MS para enriquecer o alvo proteínas ou peptídeos partir das soluções de amostra em uma superfície sólida, seguido por eluição dos analitos e MS medição7,8 , 9 , 10. através de imuno-enriquecimento, os analitos são purificados de amostras complexas e, por conseguinte, os efeitos do íon-supressão de outras moléculas são minimizados. Entre vários suportes sólidos, grânulos magnéticos são atualmente mais amplamente utilizados como eles têm as vantagens da capacidade de ligação do anticorpo alta e facilidade de manuseio. Esferas magnéticas com functionalizations diferentes e tamanhos foram desenvolvidas e comercializadas para experimentos de imunoprecipitação. Até à data, imuno-enriquecimento em grânulos tem sido interfaceado com ionização electrospray (ESI) e MALDI-MS para medição de proteínas e peptídeos. Em padrões de isótopo estável e captura pela tecnologia de anticorpos antipeptídeo (SISCAPA), proteínas nas amostras são digeridas, seguido de incubação com grânulos de anticorpo-revestido para imuno-enriquecimento. No SISCAPA "clássica", os peptídeos proteotypic capturados são eluídos dos grânulos e medidos pelo líquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), ou por infusão direta ESI-múltiplas reação monitoramento-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Imuno-enriquecimento melhorou a sensibilidade do ensaio MRM, por 3-4 ordens de magnitude, atingindo os de gama baixa ng/mL13.
Em comparação com electrospray-MS, MALDI-MS é mais rápido e não envolve a limpeza e a re-equilibração de colunas LC então não há problemas reportes e contaminação, tornando-o mais adequado para estudos de alta produtividade14. Imuno-MALDI tecnologia foi desenvolvida em nosso laboratório para combinar imuno-enriquecimento com MALDI-MS para quantificação de sensível e específica de peptídeos e proteínas (com base na quantificação de peptídeos proteotypic)15,16 ,17. Depois imuno-enriquecimento, os grânulos são depositados sobre uma placa MALDI-alvo, a solução de matriz é adicionado à grânulos e o prato está pronto para análise por um MALDI-TOF-MS após a secagem. Eluição dos peptides da missanga não é executada como uma etapa separada, mas ligados a afinidade analitos são eluídos por solução de matriz a MALDI quando ele é adicionado aos pontos do grânulo, desse modo simplificando a preparação da amostra e minimizando a perda de amostra. A tecnologia de iMALDI tem sido aplicada em uma variedade de aplicações de18,19e recentemente foi automatizada e utilizada para a medição da angiotensina eu (Ang eu) para a determinação de plasma renina atividade (PRA)20. Este protocolo irá demonstrar o procedimento utilizado para realizar um ensaio iMALDI automatizado. O ensaio PRA a tomar como exemplo, inter dias CVs de menos de 10% foram obtidos por meio da automação, com a capacidade de medir 744 amostras por dia20.
O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste manuscrito não requer digestão de proteínas, como a molécula alvo (Ang eu) é um peptídeo com um peso molecular de 1295.7 Da. Em outros ensaios, onde a digestão de proteínas é necessário e um peptídeo é usado como o substituto para a proteína intacta, o peptídeo selecionado para iMALDI deve ser exclusivo e específico para a proteína do alvo, com uma massa mais de 800 Da então que ele pode ser distinguido facilmente o c hemical ruído a partir da solução de matriz MALDI. Anticorpos antipeptídeos são necessários para o imuno-enriquecimento dos peptides. O protocolo para um ensaio de iMALDI medição PRA consiste em quatro etapas: 1) geração de Ang I em plasma humano; 2) imuno-enriquecimento de Ang I usando grânulos anticorpo-revestido; 3) transferência de contas para uma placa-alvo MALDI e adicionando solução de matriz; e 4) aquisição de sinal por uma análise de dados e MALDI-TOF-MS20.

<table><tbody><tr><td>Biorrecuperação de</td> <td>plasma humano de controle saudável</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amônio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (> = 98%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de clara de ovo de galinha (>98%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>Grau LC-MS</td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Fluka</td><td>34967</td> água <td>de grau LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td> ácido acético <td>de grau LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td> Tris(hidroximetil)aminometano <td>de grau LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Esferas magnéticas de proteína G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>spananti-Ang I anticorpo policlonal de cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat e SIS Ang I</td><td>sintetizados na Universidade de Victoria-Genome BC Proteomics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizado de manuseio de líquidos</td><td>Agilent</td><td>16050-102 Estação de</td><td>trabalho robótica Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Ímã Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>Rotador de tubo</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Rotor de tubo Labquake</td></tr><tr><td>Ímã</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Ímã de saia lateral DynaMag-96</td></tr><tr><td>Ímã</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>usado para puxar as contas para o fundo do poço</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF instrumento</td></tr></tbody></table>

peptídeos e proteínas quantificação usando automated imuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno - Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).

Um procedimento iMALDI automatizado para medição de Ang é mostrado na Figura 1. Peptídeos de alvo (endógenos ou peptídeos de proteínas digeridas) são enriquecidos em grânulos magnéticos antipeptídeos, e em seguida as contas são transferidas para uma placa-alvo para a medição de MALDI. Todo o processo é simplificado em comparação com outras tecnologias de imuno-MS que exigem etapas de eluição de peptídeo adicionais. Automação do ensaio iMALDI permite a análise...

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

O objetivo geral deste ensaio imuno-MALDI automatizado é quantificar peptídeos e proteínas intactas em fluidos biológicos complexos de maneira precisa e sensível. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de proteômica quantitativa, como quantificar níveis de proteínas para fins diagnósticos ou para monitorar a resposta de um paciente ao tratamento. A principal vantagem deste método é que ele pode quantificar níveis de proteínas de forma muito sensível e precisa a partir de amostras complexas.Essa técnica permite o diagnóstico de doenças em estágio inicial porque o passo de imunoenriquecimento do ensaio permite a quantificação de proteínas e peptídeos biomarcadores pouco abundantes. Embora este método possa fornecer informações sobre a atividade da renina plasmática, ele também pode ser aplicado a outros estudos relacionados a doenças, como a quantificação de proteínas associadas ao câncer para prognóstico, diagnóstico e manejo do tratamento. Para iniciar este procedimento, descongele as amostras de plasma humano em banho-maria à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, coloque as amostras no gelo até descongelarem completamente. Depois, transfira manualmente 200 microlitros de cada amostra de plasma para poços separados de uma placa de poços profundos de 1,1 mililitro. Centrifugue a placa durante 10 minutos a dois graus Celsius e 3.000 rpm.Em seguida, utilize o Bravo para diluir em série uma solução padrão de NAT Ang-1 a 500 femtomol por microlitro, a fim de preparar seis soluções calibradoras com albumina de clara de ovo de galinha. Após a centrifugação, pipete 200 microlitros de cada calibrador em um poço e 125 microlitros de tampão de geração na placa de amostras. Utilizando um sistema automatizado de manipulação de líquidos, misture 125 microlitros de sobrenadante de plasma ou 125 microlitros da solução de albumina de clara de ovo de galinha com 25 microlitros de tampão de geração de angiotensina I em uma nova placa de poços profundos de 1,1 mililitro.Agora, transfira automaticamente as soluções para uma placa de 96 poços com três repetições por solução e 34 microlitros de solução por poço. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Para a conjugação do anticorpo com as microesferas de proteína G, transfira primeiro 78 microlitros da suspensão de microesferas previamente preparada para um tubo de 1,5 mililitro.Lave as microesferas sete vezes com um mililitro de acetonitrila 25% em PBSC e três vezes com um mililitro de PBSC, utilizando um suporte magnético para sedimentar as microesferas entre cada lavagem. Após a lavagem, ressuspenda-as em 110 microlitros de PBSC e adicione 110 microlitros de anticorpo anti-angiotensina I. Misture as microesferas e a solução por pipetagem.Em seguida, incubar as esferas à temperatura ambiente por uma hora sob rotação de oito rpm. Após isso, lavar as esferas três vezes com um mililitro de PBSC. Então, ressuspender as esferas em 1.100 microlitros de PBSC.Agora, transfira manualmente a solução de microesferas para uma placa de 96 poços. Em seguida, utilize o Bravo para aliquotar as microesferas na mesma placa de 96 poços. Após o período de três horas de geração de angiotensina I, coloque a placa de incubação sobre gelo por 10 minutos para interromper a geração de angiotensina I. Dilua automaticamente uma solução estoque do peptídeo padrão com isótopo estável 100 vezes com tampão PBS.Além disso, distribua automaticamente a diluição do peptídeo padrão com isótopo estável em uma placa PCR de 96 poços. Transfira 10 microlitros da solução de peptídeo diluída para cada poço da placa de incubação. Misture a solução de peptídeo diluída com as amostras de plasma ou com a solução de albumina de clara de ovo de galinha.Adicione automaticamente as soluções de amostra ou padrão às soluções de microesferas na placa de incubação e misture. Após uma hora de incubação, lave automaticamente as microesferas três vezes com solução de bicarbonato de amônio cinco milimolar. Use um ímã para atrair as microesferas ao fundo após cada lavagem.Após a última lavagem, adicione 10 microlitros da solução de bicarbonato de amônio em cada poço para ressuspender as esferas. Transfira automaticamente sete microlitros da suspensão de esferas para uma placa-alvo MALDI com diâmetro de ponto de 2.600 micrômetros. Assim que as esferas estiverem secas, adicione automaticamente dois microlitros da solução de matriz HCCA previamente preparada, retirada do poço de matriz, em cada ponto de amostra da placa-alvo.Em seguida, analise os pontos da amostra com um instrumento MALDI-TOF utilizando o modo refletor positivo. Realize calibração interna, suavização dos dados e subtração do baseline com o software específico do fabricante. O procedimento automatizado de iMALDI para medição de angiotensina I permite análise em alto rendimento de um grande número de amostras, com coeficiente de variação inferior a 10% dentro do mesmo dia. Espectros representativos obtidos pela medição de angiotensina I em amostras de plasma humano são exibidos aqui.É apresentada aqui a correlação entre os valores de PRA de 188 amostras de pacientes obtidos com o ensaio iMALDI automatizado e os valores de PRA obtidos utilizando um procedimento clínico de LC-MS/MS. Os dois métodos apresentam um coeficiente de correlação de 0,98, e a diferença entre as inclinações pode ser devida ao uso de padrões internos diferentes ou de anticorpos diferentes. A faixa linear do ensaio e a precisão do ensaio são exibidas aqui.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas. Ao tentar este procedimento, lembre-se de ajustar corretamente a ponta do pipetador e a velocidade de manipulação do líquido. Após este procedimento, métodos adicionais podem ser utilizados para confirmar o hiperaldosteronismo primário em pacientes, incluindo a sobrecarga oral de sal ou testes de infusão salina.A técnica automatizada iMALDI permite o rastreamento quantitativo específico e preciso de alto rendimento de amostras biológicas, incluindo amostras de pacientes, para proteínas ou peptídeos relacionados a doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio iMALDI automatizado para quantificação de proteínas e peptídeos baseado em espectrometria de massa. Não se esqueça de que o trabalho com amostras biológicas, como plasma humano, é extremamente perigoso, e as precauções de segurança necessárias devem sempre ser tomadas durante a realização do procedimento.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma estratégia de multiplexação de amostra aprimorada que é capaz de aumentar o número de amostras que podem ser analisadas simultaneamente com tags isobáricas disponíveis. A incorporação de uma plataforma robótica aumentou consideravelmente o rendimento experimental, a reprodutibilidade e a precisão quantitativa.

Multiplexação automatizada da amostra usando rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT)

Aqui, apresentamos um protocolo para a purificação dos complexos de peptídeos classe I e CLASSE II da classe I, fornecendo dados de imunopeptidomias de alta qualidade. O protocolo se concentra na preparação da amostra usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Imunopeptidomics: Isolamento de Peptídeos MHS de classe I e II associados para análise de espectrometria de massa

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Aprenda a quantificar peptídeos e proteínas em fluidos biológicos complexos usando iMALDI automatizado. Este método sensível e preciso auxilia no diagnóstico precoce de doenças e no monitoramento da resposta ao tratamento.

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

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