Name: Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a caracterizar rapidamente o dobramento e a ligação de interações biomoleculares usando calorimetria diferencial de varredura (DSC) com ligantes termolábeis. Este método permite extrair parâmetros termodinâmicos de forma eficiente.

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R. W. H. V foi apoiado pelo programa de treinamento engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) em Bionanomachines e ciências naturais de McGill. A. K. M. e P. E. J. foram apoiados por subsídios NSERC 327028-09 (r. K. M) e 238562 (P. E. J.).

1. preparação da amostra
<ol><li>Purifica o desejado biomolécula13. Nota: Este protocolo usa comprada cocaína-ligação DNA aptamer MN4 após a troca contra 2 M NaCl três vezes seguido por três rodadas de água desionizada, utilizando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizar e purificar ou comprar o desejado ligante termolábil13. Nota: MN4 vincula a cocaína de ligante termolábil. MN4 também vincula o quinino, que é usado como um controle negativo para thermolability de ligante a estas temperaturas experimentais.</li>
	<li>Prepare amortecedores para diálise da biomolécula purificada e dissolução de ligantes (buffer de NaCl de fosfato de sódio e 140 mM de 20 mM, pH 7,4, para MN4 e ligantes usados aqui).</li>
	<li>Dialize a biomolécula contra pelo menos 2 L de buffer usando a tubulação da diálise com 0,5 - 1,0 kDa Cut-off.</li>
	<li>Filtre o buffer final (referido como trabalho buffer) através de um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer.</li>
	<li>Pesar a massa desejada de ligantes e dissolvê-los no buffer de trabalho filtrados. Se as concentrações de ligante desejado requerem massas que são demasiado pequenas para pesar, fazer uma solução concentrada de ligante (10 x por exemplo). Nota: É fundamental que todos os experimentos de DSC utilizam a mesma reserva de trabalho para a amostra e ligante, ou seja, nunca realizar um experimento onde o ligante é dissolvido em um lote diferente de reserva de trabalho que a biomolécula porque isso poderá provocar o tampão artefatos de incompatibilidade nos dados.</li>
	<li>Filtre a solução estoque biomolécula com um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer de trabalho.</li>
	<li>Determinar a concentração de biomolécula por medidas de absorvância (260 nm para ácidos nucleicos como MN4 e 280 nm para proteínas).</li>
	<li>Armazenar a biomolécula preparada e ligante em um frigorífico de 4 ° C (apropriado para MN4 e ligantes usados aqui) ou no -20 ou -80 ° C se a biomolécula e ligantes toleram o congelamento e a longo prazo de armazenamento é necessário. As soluções tampão, biomolécula e ligante em cima duma mesa desgaseificador (ver Tabela de materiais), previamente ao seu embarque para o DSC de Degas. Nota: Desgaseificação ajuda a prevenir a formação de bolhas no DSC em temperaturas mais altas. Bolhas de causam artefatos de sinal que obscurecem DSC pico formas e linhas de base.</li>
</ol>2. DSC preparação
<ol><li>Desenrosque a pega pressão desde o DSC (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Executar o tubo de silicone de reserva de trabalho e anexá-lo para o flange dianteira (abertura de metal) do capilar referência.</li>
	<li>Crie uma ponte entre os capilares de referência e exemplo conectando o flange posterior de referência para o flange dianteira amostra.</li>
	<li>Anexe um pedaço de tubo de silicone para o flange de amostra traseiro que corre para um balão de resíduos com uma linha de vácuo anexado.</li>
	<li>Liga a linha de vácuo para liberar o DSC com 200 mL de tampão de trabalho.</li>
	<li>Carrega o capilar de referência do DSC com buffer de trabalho. Anexe aproximadamente seções 3 a 5 cm de tubo de silicone para os flanges de referência capilar.</li>
	<li>Inserir a ponta da pipeta de 1 mL para tubo de silicone do flange traseiro. 0,8 mL de tampão de trabalho com uma pipeta de desenhar e inserir a ponta da pipeta com tampão para tubo de silicone do flange dianteira de referência.</li>
	<li>Pressione suavemente o êmbolo de pipeta até o buffer de trabalho através da tubulação de silicone frontal de passagem para o capilar de referência e até do flange traseiro anexado a ponta da pipeta. Pressione o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação de silicone da frente e, em seguida, solte o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação traseira de silício.<ol>
<li>Repita passando o buffer de trabalho e para trás para purgar o volume no capilar referência de bolhas. Nota: Normalmente, 10 passes da solução e para trás são suficientes para limpar quaisquer bolhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampe a ponta da pipeta traseira com o polegar e gentilmente puxe para cima com a ponta da pipeta traseira e dianteira pipeta para removê-los de flanges a referência com o tubo de silicone anexado.</li>
	<li>Carrega o capilar de amostra com buffer de trabalho como em passos 2.6-2.9. Coloque uma tampa de plástico preta na traseira referência e flanges, deixando os flanges frontais descobertos da amostra.</li>
	<li>Anexe o identificador de pressão.</li>
	<li>Abra o software DSC (ver Tabela de materiais) e pressurizar o instrumento clicando o vermelho cima seta na parte superior da interface, uma vez que a leitura de energia está estabilizado; o poder do DSC é indicado em uma caixa na parte superior direita da interface juntamente com a temperatura do instrumento e a leitura da pressão. Nota: Monitor o poder ler como o DSC pressuriza. Mudanças no poder de mais de ~ 10 µW indicam a formação de bolhas nos capilares, que podem causar artefatos nos dados. As soluções devem ser removidas e desgaseificadas mais antes de continuar.</li>
	<li>Equilibrar o DSC com buffer de trabalho através da realização de uma verificação direta e inversa. Na aba "Método Experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção de "Varredura" é seleccionada para executar o DSC no modo de verificação de temperatura. Nota: Parâmetros experimentais são a temperatura de varredura gama, taxa de varredura, tempo da equilibração de baixa e alta temperatura e número de varreduras.<ol>
<li>Na inserção de "Parâmetros de temperatura" sob a aba "Método Experimental", clique no botão para "Aquecimento". Digite 1 e 100 ° C para as temperaturas experimentais superiores e inferiores, 1 ° C/min para a taxa de varredura e 60 s para o período de equilíbrio.</li>
		<li>Clique no botão "Adicionar séries" sob o campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up (para um aquecimento e uma varredura de refrigeração) e marque a caixa "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "Okey"; os scans adicionados aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros para cada verificação são como desejado.</li>
		<li>Inicie o experimento, clicando no botão "jogar" verde na parte superior da interface. Navegue até a pasta desejada e um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up de entrada. Ver o progresso do experimento, clicando na guia "Dados" à direita da guia "Experimentar o método".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coletando ligante termolábil DSC Datasets
Nota: O procedimento mínimo consiste de cinco experimentos: experimentos de referência com e sem ligante de buffer (usado para subtração da linha de base, ver discussão), experiências com a enciclopédia biomolécula, a ligante-limite biomolécula, da amostra e o ligante-limite biomolécula com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura.
<ol><li>Execute experiências de referência para a subtração de linha de base de dados de exemplo. Recarregar o DSC com buffer de trabalho em ambos os capilares e coletar várias digitalizações de frente e verso em uma faixa de temperatura adequada no 1 ° C min-1 com uma parte superior (alta temperatura) tempo da equilibração de 120 s.<ol>
<li>Exclua os scans de equilibração tampão anterior da parte inferior da interface destacando cada um individualmente e clicando no X vermelho no meio certo da interface. Adicione os novos exames, clicando no botão "Adicionar séries", 20 a entrar no campo para "Passos para adicionar" e marcando a caixa de "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique Okey e execute o experimento clicando no botão de play verde como acima.</li>
		<li>Repita os passos 3.1 - 3.1.1 com buffer de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter a referência experiências para o ligante (recolher dois experimentos separados usando 120 s e s 600 alta temperatura equilibração vezes respectivamente, para ser usado em adquirir a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis). Nota: A taxa de varredura utilizada aqui garante que o biomolécula em experimentos subsequentes em equilíbrio térmico nos scans de frente e verso (ver discussão). Varredura de taxas < 0,1-0,2 ° C min-1 conduzir a termogramas barulhentas e não são aplicáveis em experimentos de DSC. As temperaturas devem estender do bem abaixo da temperatura de fusão da biomolécula gratuito para bem acima da temperatura de fusão da biomolécula ligand-saturado (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar a reprodutibilidade das varreduras (por exemplo, 10 para a frente e 10 scans reversos para 20 total é suficiente).</li>
		<li>Se usando vários ligantes (como cocaína e quinino), irrigue o DSC com 200 mL de tampão de trabalho (repetição da etapa 2.5) entre execuções a fim de remover o ligante de capilares e evitar a contaminação cruzada. Nota: É útil executar um experimento de replicar sobre a biomolécula livre depois de uma série de ligante-limite a fim de verificar se o ligante anterior absorve fortemente às paredes do capilares e não é adequadamente removido com tampão de lavagem. Se os termogramas para a enciclopédia biomolécula parecem ser deslocado para uma magnitude maior e a mais alta temperatura de desnaturação, depois de experimentar o ligand-limite, é provável que o ligante anterior ainda está presente no calorímetro após o enxaguamento. Remover o ligante adsorvido incubando os capilares com 20% Contrad-70 para 1 h a 60 ° C, com os tampões plásticos e pega pressão fora. No software DSC, altere o modo experimental para "Isothermal" sob o método Experimental Tab escolher 3.600 s para a duração e a 60 ° C para a temperatura isotérmica, com zero entrada para o tempo da equilibração. Clique em "Adicionar ao método Experimental". O experimento isotérmico aparece na parte inferior da tela. Após a conclusão, liberar o instrumento com água 2 L de água deionizada e repetir da etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute experimentos de amostra usando a mesma DSC carregando o procedimento e parâmetros experimentais como a referência de varreduras. Para o conjunto de dados livre biomolécula, certifique-se de que o capilar de referência contém a reserva de trabalho enquanto o capilar amostra contém a biomolécula grátis na concentração desejada no buffer de trabalho.<ol>
<li>Para os experimentos de ligante-ligado, certifique-se que o ligante é no buffer no capilar referência de trabalho, e a biomolécula plus ligante é no trabalho buffer no capilar amostra. Limpe o sistema entre adições de ligantes diferentes como na etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar um experimento adicional com a biomolécula vinculado para o ligante termolábil onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 s e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos que passo 3.2.1. Nota: A duração do período de equilíbrio de alta temperatura para o experimento segundo ligante-limite é simplesmente escolhida para garantir que o ligante é esgotado mais rapidamente do que a experiência de tempo curto de equilibração. Se os picos de ligante-limite do primeiro experimento deterioração lentamente em função do número de verificação (por exemplo, as diferenças no maxima pico sucessivas são ≤ 0,5 ° C), estimar aumentos de 10 a 20 vezes no período de equilíbrio de alta temperatura para adequadamente, empobrecem o ligante durante o segundo experimento. O cálculo exacto da constante taxa para conversão de ligante requer que a segunda experiência tem mais rápido esgotamento do ligante em relação a primeira. As concentrações de ligante extraídas da análise global dos dois experimentos serão semelhantes e, portanto, inutilizável se a prostração de ligante não é suficientemente acelerada no segundo experimento.</li>
</ol>4. processamento de dados
<ol><li>Aberto o DSC experimentar arquivos no software de análise de dados do DSC (ver Tabela de materiais) e exportar os dados de força bruta como planilhas.</li>
	<li>Importe as planilhas contendo os dados de força bruta no software para montagem de dados.</li>
	<li>Linha de base subtrair os dados de exemplo, subtraindo-se os dados de energia de reserva de liberdade e as experiências de ligante-limite biomolécula. Nota: Para o experimento de ligante termolábil, está diminuindo a concentração de ligante inicial com cada varredura. Portanto, é ideal para subtrair o scan de tampão 1 de varredura da amostra 1 e assim por diante. Nós achamos que os scans de tampão com cocaína não altera sensivelmente como procede a conversão de ligante e, portanto, uma varredura de amortecedor único ligante termolábil pode ser usada para subtrair todos os dados ligados a ligante termolábil.</li>
	<li>Converta os dados de poder de amostra de base-subtraída a capacidade térmica. Nota: A conversão requer volume parcial a biomolécula específico, que pode ser estimado de14,15,16. A equação para a conversão de energia a capacidade de calor tem sido descrito anteriormente17.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>Globalmente se encaixam dataset equilibração curto tempo termolábil ligand-limite a capacidade de calor com um único conjunto de linha de base, concentração de ligante, dobramento e ligante vinculando parâmetros conforme descrito anteriormente,4.</li>
	<li>Repita que o global apto para o equilíbrio de longo tempo dataset para calcular a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábil conforme descrito anteriormente,4.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Modificações e solução de problemas
Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente4. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula dataset, efetivament...

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares4. O instrumento scans na temperatura, medir a quantidade de calor necessária para desnaturar a biomolécula na presença e na ausência de ligante. As termogramas resultantes são usadas para extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o ligante de ligação e de processos de dobramento. As informações fornecidas pelo DSC ou outras técnicas termodinâmicas são fundamentais para guiar o projeto das drogas segmentação biomoléculas1,5,6,7,8. No entanto, a digitalização repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) pode ser problemático. Por exemplo, muitos compostos farmaceuticamente importantes sofrem rearranjo ou decomposição após a exposição prolongada a altas temperaturas9,10,11, ou seja,eles são termolábeis. Análise de ligação interações por DSC normalmente exige várias digitalizações de frente e verso a fim de verificar a reprodutibilidade da termograma para análises termodinâmicas12. Conversão térmica de um ligante inicial em uma forma secundária com características alteradas vinculação conduz a pronuncia-se diferenças na forma e posição de termogramas sucessivas, desde que a concentração do ligante inicial diminui com cada verificação enquanto o produtos de conversão térmica se acumulam. Esses conjuntos de dados não são passíveis de análises tradicionais.
Recentemente desenvolvemos um método de montagem global para datasets termolábil ligante DSC que produz o conjunto completo de parâmetros termodinâmicos que regem a dobradura biomolecular e vinculação de interações a partir de uma única experiência de ligante-limite referenciado para o termograma necessária para a biomolécula livre4. A análise reduz o tempo experimental e amostra exigido por ~ 10-fold em relação ao padrão de DSC de abordagens. Nós temos contabilizados para ligante conversão térmica por supondo que isto acontece durante a parte de alta temperatura de cada verificação onde a termograma não depende de concentração do ligante. Portanto, a concentração de ligante é uma constante dentro da parte da termograma que é usada para extrair os parâmetros termodinâmicos. Demonstrámos, além disso, como a constante de velocidade de conversão térmica de ligante pode ser obtido através da realização de um experimento de complementar com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura. Para sistemas onde a conversão térmica de ligante é menos dependente da temperatura (ou seja, sensivelmente ocorrendo em todas as temperaturas), a análise pode ser modificada para incluir a concentrações variáveis de ligante. Aqui vamos demonstrar este procedimento para o aptamer de DNA MN4 na presença da cocaína ligante termolábeis, que rapidamente se converte em benzoilecgonina em altas temperaturas (> 60 ° C). Quinino é usado como um controle negativo para thermolability de ligante não sofre conversão a estas temperaturas experimentais e também vincula a MN4. Descrevemos a aquisição de ligante termolábil DSC conjuntos de dados e sua análise rendendo parâmetros termodinâmicos e cinéticos da dobradura, ligação e ligante processos de conversão.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Água desioinizada para biologia molecular</td> Filtros de seringa estéril <td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mícron</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos de 3 kDa</td> Tubo <td>de</td> diálise UFC900324 <td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Corte de 0,5-1,0 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silício</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de flange DSC de plástico</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>Aptâmero de DNA MN4</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorímetro</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Software NanoAnalyze</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

medição de perfis biomolecular dsc com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.

Dados representativos para o DSC ligante termolábeis são mostrados na Figura 1. A posição e a altura do pico do ligand-limite termolábil sucessivamente se desloca para baixo no sentido da biomolécula desacoplada como o ligante termolábil está esgotado com cada verificação (Figura 1a). O perfil de desnaturação livre é usado como uma referência para o ponto de extremidade de conversão termolábil ligante (Figura...

Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

O objetivo geral desta metodologia é extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o dobramento biomolecular e as interações de ligação por meio da calorimetria de varredura diferencial, ou DSC, utilizando um ligante termolábil com apenas duas experimentações. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de biocalorimetria e design de fármacos, como, por exemplo, quais são as magnitudes relativas dos parâmetros termodinâmicos que regem as interações entre biomoléculas e inibidores de ligação forte? A principal vantagem desta técnica é que uma titulação completa do ligante é realizada em um único experimento, permitindo a extração rápida dos parâmetros termodinâmicos por meio da análise de ajuste global.Para começar, prepare os tampões para a diálise da biomolécula purificada em solução de ligantes. Realize a diálise da biomolécula contra pelo menos um litro de tampão utilizando tubos de diálise com corte de 0,5 a 1,7 quilodalton. O passo mais importante para obter dados de DSC de alta qualidade é a diálise do ligante da biomolécula contra o tampão desejado.Isso garante que não haja artefatos de incompatibilidade de tampão presentes nos dados de DSC. Filtre o tampão final, denominado tampão de trabalho, através de um filtro de 0,2 mícron que tenha sido completamente equilibrado com o tampão. Pese as massas desejadas dos ligantes e dissolva-os no tampão de trabalho filtrado.Se as concentrações desejadas de ligante exigirem massas muito pequenas para serem pesadas com precisão, prepare uma solução estoque concentrada do ligante. Filtre a solução estoque do biomolécula através de um filtro de 0,2 mícron que tenha sido previamente equilibrado com o tampão de trabalho. Em seguida, determine a concentração do biomolécula por meio de medidas de absorbância.Armazene o biomolécula e ligante preparados em uma geladeira a quatro graus Celsius ou a menos 20 ou menos 80 graus Celsius, se a biomolécula e os ligantes tolerarem o congelamento e for necessária armazenagem de longo prazo. Desgaseifique o tampão e as soluções de biomolécula e ligando em um desgaseificador de bancada antes de carregar no calorímetro de varredura diferencial, ou DSC. Desparafuse a alavanca de pressão do DSC.Em seguida, conecte uma tubulação de silicone ao tampão de trabalho e fixe-a à braçadeira frontal do capilar de referência. Crie uma ponte entre os capilares de referência e de amostra conectando a braçadeira traseira de referência à braçadeira frontal simples. A seguir, fixe um trecho de tubulação de silicone à braçadeira traseira da amostra, que conduz a um frasco de resíduos com uma linha de vácuo acoplada.Ligue a linha de vácuo para lavar o DSC com 200 mililitros de tampão de trabalho. Comece conectando seções de tubo de silicone de aproximadamente três a cinco centímetros às braçadeiras do capilar de referência. Em seguida, insira uma ponteira de pipeta de um mililitro no tubo de silicone da braçadeira traseira.Pipete 0,8 mililitros do tampão de trabalho e insira a ponteira da pipeta com o tampão no tubo de silicone da braçadeira de referência frontal. Pressione suavemente o êmbolo da pipeta para fazer o tampão de trabalho passar pelo tubo de silicone frontal, atravessar a cápsula de referência e subir até a ponteira da pipeta acoplada na braçadeira traseira. Pressione o êmbolo da pipeta até que o nível do tampão de trabalho atinja um ponto logo acima do tubo de silicone frontal, depois solte o êmbolo da pipeta até que o nível do tampão de trabalho alcance um ponto logo acima do tubo de silicone traseiro.Continue passando o tamp&atilde;o de trabalho de um lado para o outro no capilar de refer&ecirc;ncia para eliminar bolhas do volume. Em seguida, tampe a ponta traseira da pipeta com o indicador e puxe suavemente para cima a ponta traseira da pipeta e a pipeta frontal para remov&ecirc;-las das abas de refer&ecirc;ncia com o tubo de silicone acoplado. Carregue o capilar da amostra com tamp&atilde;o de trabalho como anteriormente.Coloque uma tampa plástica preta nas abas traseiras da amostra de referência, deixando as abas frontais descobertas. Conecte o manípulo de pressão ao DSC e, em seguida, abra o software do DSC e pressurize o instrumento clicando na seta vermelha para cima no topo da interface, assim que a leitura de potência se estabilizar. A potência do DSC é indicada em uma caixa no canto superior direito da interface, juntamente com a temperatura do instrumento e a leitura de pressão.Equilibre o DSC com o tampão de trabalho realizando uma varredura direta e reversa na guia de método experimental localizada no lado esquerdo da tela. Certifique-se de que a opção de varredura esteja selecionada para executar o DSC e o modo de varredura de temperatura. No painel de parâmetros de temperatura sob a guia de método experimental, clique no botão para aquecimento.Digite um e 100 graus Celsius para as temperaturas experimentais inferior e superior, um grau Celsius por minuto para a taxa de varredura e 60 segundos para o período de equilíbrio. Clique no botão AddSeries abaixo do campo de entrada para o período de equilíbrio. Insira dois no campo número de etapas a adicionar na janela pop-up e marque a caixa Alternar Aquecimento/Resfriamento.Clique em OK. Os scans adicionados aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros de cada scan estão conforme desejado. Inicie o experimento clicando no botão verde de reprodução no topo da interface.Navegue até a janela desejada e insira um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up. Visualize o andamento do experimento clicando na guia de dados à direita da guia do método do experimento. Execute experimentos de referência para subtração da linha de base dos dados da amostra recarregando o DSC com tampão de trabalho em ambas as cápsulas.Colete múltiplos varreduras diretas e reversas em uma faixa de temperatura adequada a um grau Celsius por minuto, com um tempo de equilíbrio ascendente de 120 segundos. Exclua as varreduras anteriores de equilíbrio com tampão da parte inferior da interface, destacando cada uma individualmente e clicando no X vermelho na parte central direita da interface. Adicione as novas varreduras clicando no botão AddSeries, inserindo 20 no campo para etapas a adicionar e marcando a caixa Alternate Heating/Cooling.Em seguida, clique em OK e execute o experimento clicando no botão verde de reprodução, como antes. Repita esses passos com o tampão de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambas as capilares para obter os experimentos de referência para o ligante. Realize dois experimentos separados para serem utilizados na obtenção da constante de taxa para a conversão termolábil.Para o conjunto de dados da biomolécula livre, certifique-se de que a cápsula de referência contenha o tampão de trabalho, enquanto a cápsula de amostra contém a biomolécula livre na concentração desejada em tampão de trabalho. Em seguida, realize os experimentos da amostra utilizando o mesmo procedimento de carregamento DSC e os mesmos parâmetros experimentais usados nos espectros de referência. Para os experimentos com ligante ligado, certifique-se de que o ligante esteja no tampão de trabalho na cápsula de referência e de que a biomolécula mais o ligante estejam no tampão de trabalho na cápsula de amostra.Enxágue o sistema entre a adição de diferentes ligantes como antes. Realize um experimento adicional com a biomolécula ligada ao ligante termolábil no qual o período de equilíbrio em alta temperatura é aumentado para 600 segundos e todos os demais parâmetros experimentais são mantidos iguais aos anteriores. Prossiga para o processamento e análise dos dados conforme descrito no protocolo textual.A posição e a altura do pico do ligante termolábil ligado deslocam-se sucessivamente em direção àquelas da molécula não ligada à medida que o ligante termolábil é esgotado a cada varredura. O perfil de maturação 3D é utilizado como referência para o ponto final da conversão do ligante termolábil. O aumento do período de equilibração em alta temperatura resulta em reduções mais acentuadas da concentração do ligante termolábil em cada varredura em comparação com o conjunto de dados com período curto de equilibração.Utilizando os parâmetros de concentração do ajuste global otimizado a partir dos dois conjuntos de dados, pode-se calcular a constante de velocidade da conversão do ligante na alta temperatura de equilíbrio. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em 72 horas se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de desgaseificar também o ligante da biomolécula e eliminar bolhas das capilares de DSC usando a pipeta de carregamento para prevenir artefatos nos dados.Após assistir a este vídeo e ler o artigo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de DSC em biomoléculas, bem como da aplicação de análises de ajuste global para extrair rapidamente os parâmetros termodinâmicos que regem as interações de dobramento e ligação. Embora este método possa fornecer informações sobre interações de ligação e dobramento em equilíbrio, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como biomoléculas que exibem cinética lenta de dobramento e/ou ligação de ligantes.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

Este vídeo demonstra a calorimetria exploratória diferencial — uma técnica para estudar a interação entre uma biomolécula e um ligante. A ligação de um aptâmero de DNA e um ligante termolábil é estudada aplicando ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento à amostra e obtendo varreduras para análise termodinâmica.

Calorimetria Exploratória Diferencial para Estudo da Interação DNA Aptamer-Ligante Termolábil

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

A fluorimetria de varredura diferencial é um método amplamente utilizado para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas para interações com proteínas. Aqui, apresentamos um método simples para estender essas análises para fornecer uma estimativa da constante de dissociação entre uma pequena molécula e seu parceiro proteico.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Calorimetria de varrimento diferencial mede a temperatura de transição térmica (S) e energia de calor total necessário para desnaturar uma proteína. Os resultados obtidos são usados ​​para avaliar a estabilidade térmica dos antigénios de proteínas em formulações de vacinas.

Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Este protocolo descreve um método exclusivo para detectar a ligação entre compostos e moléculas de proteína, oferecendo as vantagens de perda mínima de amostra de proteína e alta precisão de dados.

Detecção da interação proteína-umbeliferona CD40 por fluorescência de varredura diferencial

Aqui, apresentamos o ensaio de deslocamento térmico, uma técnica baseada em fluorescência de alto rendimento usada para investigar a ligação de pequenas moléculas a proteínas de interesse.

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Aprenda a caracterizar rapidamente o dobramento e a ligação de interações biomoleculares usando calorimetria diferencial de varredura (DSC) com ligantes termolábeis. Este método permite extrair parâmetros termodinâmicos de forma eficiente.

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Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

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