Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

O objetivo geral dessa configuração e protocolo de gravação de comportamento é quantificar a preferência quimiossensorial de base populacional de C Elegans por compostos solúveis usando um sistema de aquisição de vídeo multicâmera, seguido de análise de vídeo automatizada. Este método pode facilitar a pesquisa neurobiológica de C Elegans, permitindo uma análise comportamental mais rápida e padronizada de mutantes genéticos. A principal vantagem desta técnica é que várias réplicas podem ser testadas simultaneamente sob condições idênticas, enquanto monitoram a dinâmica temporal da resposta da população de nematóides a pistas solúveis.

Demonstrando o conjunto da câmara de comportamento estará Christopher Cronin, um cientista da equipe deste laboratório. Para começar, prepare as capas de tecido, barras de montagem da câmera, suportes de canto, barras de extrusão e montagem da câmera conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Começando com as barras finais presas à barra central, prenda o suporte da câmera e os coldres ao conjunto de montagem da câmera.

Em seguida, monte a estrutura da câmara de comportamento. Comece anexando quatro barras de alumínio de extrusão de um pé a uma folha quadrada de poliéster. Deslize uma barra nas duas porcas em T da omni da folha de tecido, centralizando a barra ao longo da largura do tecido.

Aperte os fechos para prender a folha de tecido a cada barra. Espalhe a folha quadrada de poliéster na superfície de trabalho com as quatro barras de alumínio anexadas na parte superior. Em seguida, deslize oito suportes de canto nas superfícies superiores das quatro barras de alumínio, um em cada extremidade de cada barra.

Posicione os suportes de canto nas barras com as pernas verticais do suporte niveladas com a extremidade das barras e prenda-os no lugar apertando os parafusos nas porcas em T. Em cada canto, coloque uma extrusão de alumínio de um pé na vertical, deslizando a extrusão sobre as porcas em T nas duas pernas do suporte de canto. Em seguida, prenda a barra vertical às barras horizontais apertando os fixadores, unindo assim as duas barras horizontais adjacentes.

Deslize as porcas em T soltas do conjunto de montagem da câmera em forma de H para baixo nas colunas verticais do quadro. Deixe o H deslizar totalmente para baixo para descansar em cima dos suportes de canto em cada canto do quadro. Prenda o conjunto de montagem da câmera no lugar, apertando os quatro parafusos do suporte de canto.

Em seguida, use as quatro barras finais de alumínio de extrusão de um pé para montar a camada inferior da câmara. Posicione os suportes de canto com as pernas dos suportes niveladas com a extremidade da barra e aperte os parafusos para prendê-la no lugar. Em seguida, deslize as barras para baixo entre as colunas verticais da estrutura com as porcas em T soltas nos canais verticais.

Posicione a barra de forma que as bordas superiores de seus suportes de canto fiquem uma polegada abaixo da extremidade aberta dos montantes e prenda no lugar apertando os parafusos do suporte de canto. Em seguida, deslize as porcas em T das quatro folhas retangulares de poliéster para baixo nos canais das barras de extrusão verticais para cobrir as laterais da câmara e aperte os fixadores para prendê-los no lugar. Selecione um lado para ser uma porta para acessar o interior da câmara e remova os dois parafusos e porcas em T na camada inferior da câmara.

Coloque uma tampa de plástico na extremidade superior de cada canto para servir como pés para a moldura completa. Vire a moldura com o lado direito para cima e insira dois suportes de painel por slide dentro da camada de espaço da moldura e gire para prendê-los no lugar. Em seguida, coloque um pedaço de acrílico transparente de 12 por 12 polegadas em cima dos suportes do painel para fornecer um palco para as placas de ensaio.

Por fim, posicione a câmera e o modelo de palco conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. No dia anterior ao experimento, coloque 28 placas vazias de 35 milímetros em pilhas de cinco ou menos em uma superfície plana. Encha cada placa de ensaio com cinco mililitros de ágar de meio de crescimento de nematóides e deixe as placas de ensaio secarem na vertical sem as tampas, durante a noite em temperatura ambiente.

No dia do experimento, ligue a luz de fundo, inicialize o computador e inicie o software de captura de vídeo da câmera do microscópio. Conecte a câmera do microscópio ao computador e clique na miniatura numerada da câmera na parte superior da janela do software para view a transmissão ao vivo da câmera. Para ajustar as configurações de gravação de vídeo, abra o menu de formato de vídeo no canto superior esquerdo do feed da câmera e selecione MJPG 1280x1024.

Em seguida, abra o menu de pasta ao lado do menu de formato de vídeo e selecione uma pasta na qual deseja salvar os arquivos de vídeo. Clique no ícone de exposição automática no canto superior direito do feed da câmera e desative a exposição automática. Em seguida, clique no ícone de LED imediatamente à direita do ícone de exposição automática para desligar os LEDs embutidos da câmera do microscópio.

Clique no ícone de configurações adjacente e selecione, monocromático. Maximize o contraste e ajuste o brilho. Alinhe um modelo de posicionamento de solução na parte superior do modelo de alinhamento da placa de estágio e clique no ícone de gravação de vídeo em timelapse no lado esquerdo do feed da câmera.

Insira cinco segundos para a duração e um segundo para o intervalo para gravar um vídeo de calibração de cinco segundos a um quadro por segundo. Use uma pipeta de vidro de cinco mililitros para adicionar 1,2 mililitros de tampão de meio de crescimento de nematóides a uma placa de minhocas sincronizadas e agite suavemente a placa para deslocar as minhocas para dentro do tampão. Pipete o tampão da placa e dispense os vermes em tampão em um tubo de microcentrífuga limpo.

Deixe os tubos repousarem por um a dois minutos para permitir que os vermes se assentem no fundo. Em seguida, use uma ponta de pipeta de plástico para remover o máximo possível de tampão de lavagem dos tubos sem perturbar o pellet de vermes agregados no fundo dos tubos. Reabasteça o tubo com um mililitro de tampão de meio de crescimento de nematóides limpo e repita o procedimento de lavagem mais duas vezes.

Em seguida, cole um modelo de colocação de solução em cima do estágio de um microscópio de dissecação. Em seguida, coloque uma tira de fita dupla-face em cada lado de um gabarito de alinhamento de placas. Alinhe o perímetro da placa de ensaio com o círculo no gabarito de alinhamento da placa e pressione para baixo até que o gabarito adira ao fundo da placa.

Em seguida, alinhe os marcadores de membro do modelo de placa de ensaio com os marcadores de membro do modelo de colocação da solução no microscópio de dissecação. Em seguida, use uma pipeta P2 para colocar um microlitro do tampão M13, cada um nos quadrantes um e quatro. Use uma nova ponta para colocar um microlitro de solução de CuCl2 a 10 milimolares nos quadrantes dois e três.

Use uma pipeta pasteur de vidro para transferir os vermes lavados para as placas de ensaio assim que a solução cair tiver sido completamente absorvida pelo ágar. Coloque uma gota de minhocas nas áreas acima e abaixo das regiões circulares tratadas. Dobre o tecido quatro vezes e use a borda romba para absorver o excesso de tampão de lavagem nas placas de ensaio.

Disponha imediatamente as placas de ensaio sob as câmeras do microscópio na câmara comportamental, alinhando os números dos cantos do modelo. Aguarde dois a três minutos para permitir que os vermes se aclimatem às placas de ensaio. Em seguida, clique no ícone de gravação de vídeo em timelapse no lado esquerdo do feed da câmera e insira 10 minutos para duração e um segundo para o intervalo para gravar um vídeo de 10 minutos de um quadro por segundo.

Por fim, clique em iniciar, para iniciar a gravação do vídeo. Para cada quadro de vídeo, a função de índice de preferência conta o número de pixels de worm em cada região de interesse e calcula a porcentagem de um pixel do número total de pixels na região de interesse. Os valores do índice de preferência obtidos para diferentes pares de genótipos e tratamentos são mostrados aqui.

Um valor de índice de preferência positivo indica uma atração pelo tratamento, enquanto um valor de índice de preferência negativo indica repulsa. Um índice de preferência de 0,02 é obtido quando a solução tampão M13 foi colocada nas regiões controle e experimental de interesse, demonstrando que não há viés espacial. Este gráfico também mostra que os vermes N2 evitaram fortemente os íons de cobre, resultando em um índice de preferência de 0,67.

Além disso, osm-3, que são defeituosos na formação de cílios sensoriais, e mutantes ocr-2 que são defeituosos em respostas nociceptivas mediadas por ASH mostraram diminuição da evitação e até mesmo alguma atração leve por íons de cobre. Ao tentar este protocolo, é importante trabalhar rápido, mas também de forma suave e consistente. A configuração de gravação e o protocolo de ensaio podem ser facilmente adaptados para caracterizar as respostas comportamentais baseadas na população que surgem das interações entre diferentes variedades sensoriais de C Elegans.