Name: Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a analisar automaticamente preferências quimiossensoriais em populações de Caenorhabditis elegans usando câmeras múltiplas e software de vídeo. Este método padronizado acelera pesquisas em neurobiologia e análise comportamental de mutantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Algumas cepas foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programmes (P40 OD010440). Este trabalho é apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute, com o qual a PWS é um investigador.

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+taste+bitter%3A+ASH+neurons%2C+QUI-1%2C+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHE-3%2C+a+cytosolic+dynein+heavy+chain%2C+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li>
<li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li>
<li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210(2013).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li>
<li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genetic+and+cellular+analysis+of+modulated+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%22">Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans</a>. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parallel+worm+tracker%3A+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um passo crítico no protocolo é garantir que as placas de ensaio tenham um nível consistente de secura em diferentes dias experimentais. Diferentes níveis de secura resultarão em diferentes taxas de difusão da solução no ágar e, conseqüentemente, variações nos resultados comportamentais. Assim, as placas de ensaio devem ser sempre frescas na tarde antes de experiências. O número de vermes testados por ensaio também deve ser regulado para facilitar a comparação entre os tratamentos. Para referência, um verme de tipo selvagem coloca 4-10 ovos / h em média, produzindo&gt; 360 vermes por ensaio se o protocolo de sincronização do sem-fim acima for seguido 17 . Se certas cepas mutantes estiverem defasadas com ovos, escolha mais worms adultos gravidos para a colocação de ovos para atingir o número-alvo da progênie. Outro passo importante no protocolo é lidar com worms suavemente durante o processo de lavagem e colocação de vermes. As vermes são sensíveis aos estímulos mecânicos, que provocam respostas de estresse como<html> S inversões e a inibição da deposição de ovos 18 . Além disso, deve-se ter cuidado para definir o ROI com precisão e para determinar o valor constante de limiar ótimo para condições de iluminação específicas antes de prosseguir com a análise de vídeo. Também é recomendado que os processos de calibração e limiar sejam repetidos se um longo período de tempo decorrer desde o último experimento foi executado. Uma limitação deste método é que não é adequado para ensaiar pequenas populações de vermes. No entanto, se os controles apropriados para determinar a influência da presença de alimentos no comportamento sensorial, então, a utilização de alimentos para restringir o local exploratório espacial dos vermes, como no ensaio de retenção, também é possível com esta configuração. Além disso, este método não se destina a estudar a navegação gradiente de estímulo devido à proximidade e pequenas quantidades de controle e gotas de solução experimental usadas. E_content &quot;&gt; No futuro, o software de programação que permite o rastreamento multi-worm e a extração de recursos de sem-fim pode ser integrado neste sistema 19 , 20. Gravando parâmetros de comportamento sutis do comportamento de sem-fim único, como velocidades de reversão e amplitude das curvas do corpo, fornecerão Uma imagem mais detalhada do comportamento quimiossensorial de um vermeiro individual no contexto de um ensaio baseado em população. O ensaio também pode ser modificado para estudar a habituação através de furos aborrecidos através do ROI usando agulhas de seringa com o tamanho adequado do calibre e preenchendo os orifícios com agar em infusão Com o composto experimental ou o tampão de controle. Isso assegurará uma concentração superficial mais consistente do composto durante um período de tempo de gravação mais longo, conforme necessário durante os estudos de habitação. Outra aplicação potencial deste método é realizar estudos comparativos de comportamento em diferentes espécies de nematóides. Além disso, a câmara de comportamentoPode ser modificado de várias formas para estudar as respostas comportamentais aos estímulos multimodais. Para aplicações optogenéticas, matrizes LED de alta intensidade podem ser anexadas ao lado da montagem da câmera para ativar seletivamente neurônios de interesse durante o ensaio. Elementos de aquecimento, sistemas de refrigeração e sensores de temperatura também podem ser adicionados à configuração para estudar os efeitos da temperatura nos comportamentos sensoriais. Além disso, sistemas de entrega de odor podem ser instalados dentro da câmara para investigar interações entre modalidades odontológicas e chemosensoriais.

Foraging animals deve integrar entradas de múltiplas modalidades sensoriais e selecionar estratégias comportamentais apropriadas para navegar com sucesso em seu ambiente. Compreender como as entradas sensoriais externas são recebidas e transduzidas em informações neurais para orientar a seleção de ações é um objetivo central no campo da neurobiologia. O nematóide geneticamente tratável, C. elegans , é um organismo modelo atraente no qual estudar os mecanismos neurais subjacentes à biologia sensorial e à integração multimodal. Embora C. elegans tenha apenas 302 neurônios, pode detectar e discriminar entre uma ampla variedade de estímulos ambientais, incluindo compostos solúveis, odorantes voláteis e temperatura ambiente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . oO nematóide C. elegans depende fortemente de seu aparelho quimiosensorial para localizar fontes alimentares e se alertar para ameaças potenciais. Assim, os ensaios comportamentais projetados para rastrear as respostas de C. elegans de tipo selvagem e mutante para estímulos químicos desempenham um papel crucial na dissecação dos mecanismos genéticos, celulares e neurais subjacentes às capacidades sensoriais notáveis ​​de C. elegans . Para ensaiar a resposta a compostos solúveis, três tipos de ensaios foram descritos - o teste de queda, o teste de quimiotaxia e o ensaio de retenção. No teste de queda, uma pequena gota do composto é colocada na cauda de um sem-fim móvel e a decisão do vermeiro de reverter ou avançar uma vez que o líquido atinge o aparelho sensitivo anterior é marcada 4 . O teste de queda requer pouca preparação experimental e é útil quando o tamanho da amostra de vermes é pequeno, como no caso de vermes operados a laser. No entanto, como apenas um wormPode ser ensaiado de cada vez e o experimentador deve estar presente ao longo da duração do ensaio, o teste de queda pode levar muito tempo. O teste de queda também é vulnerável às variações na entrega de queda entre cada verme dentro de uma amostra, o que pode influenciar os resultados globais do ensaio. Outra limitação do teste de queda é que ele só pode ser usado para testar a resposta do verme a compostos aversivos, pois não é possível discriminar entre um efeito atraente ou neutro do composto do movimento para a frente do sem-fim. O teste de quimiotaxia para compostos solúveis geralmente envolve dividir uma placa de ágar em quatro quadrantes, com a solução experimental misturada no agar de dois quadrantes opostos e a solução de controle misturada nos outros dois quadrantes 8 , 9 . No início do ensaio, uma gota de tampão contendo vermes é colocada no centro da placa e o número de vermes em<html> Cada quadrante é marcado em diferentes pontos de tempo. O teste de quimiotaxia fornece maior poder estatístico em comparação com o teste de queda, pois um grande número de vermes são testados em cada ensaio. No entanto, uma limitação deste método é que a preparação das placas de ensaio de quimiotaxia requer grandes quantidades do composto experimental. Isso tornará difícil a realização de telas de comportamento em larga escala se um processo de purificação complicado com rendimentos limitados for necessário para obter o composto de interesse, como no caso das moléculas de sinalização de ascarósido 10 . Além disso, a contagem manual de worms ao longo do ensaio é susceptível a erros e a perturbação das placas durante o processo de contagem pode afetar os resultados. Ao contrário dos dois métodos acima mencionados, o ensaio de retenção utiliza visão de máquina, o que minimiza o erro durante o processo de pontuação e reduz a interferência do experimentador durante o ensaio<html> &gt; 11. A análise computadorizada de gravações de vídeo do comportamento de vermes também pode potencialmente revelar dinâmicas comportamentais mais sutis que serão perdidas quando a pontuação só é realizada em alguns pontos de tempo discretos. No ensaio de retenção, duas manchas de soluções são adicionadas nos lados opostos de um pequeno parto alimentar bacteriano circular, seguido da colocação de um pequeno número de vermes no meio do remendo alimentar. O comportamento dos vermes é, então, gravado em vídeo, analisado, e um valor de índice de preferência é calculado com base no número total de pixels de sem-fim em cada região de solução. Embora a presença de um parto de comida atraente permita que pequenas populações de vermes sejam usadas em cada ensaio, os alimentos já demonstraram sensibilizar comportamentos de evitação para repelentes solúveis 12 . Além disso, os vermes exibem uma resposta fotofóbica a luz de curto comprimento de onda e o uso de fontes de luz de microscópio que emitem luz branca na configuração de gravação de comportamento pode afetar o comportamentoS = &quot;xref&quot;&gt; 13. O objetivo do método discutido neste artigo é registrar e analisar a preferência de C. elegans por compostos solúveis usando um ensaio baseado em população. Para este fim, o método atual integra e melhora aspectos de todos os três métodos discutidos anteriormente. Permite que grandes populações de vermes sejam testadas e requerem pequenas quantidades de solução experimental a serem utilizadas em cada ensaio. Além disso, o ensaio é conduzido dentro de uma câmara de comportamento fechada customizada com retroiluminação de LED infravermelho para minimizar os efeitos da luz de curto comprimento de onda no comportamento. Cada câmara também pode ser equipada com múltiplas câmeras de microscópio, o que aumenta a produção experimental sem comprometer o espaço do banco. Finalmente, o software de análise de vídeo produz o valor do índice de preferência para cada vídeo, bem como um gráfico de ocupação de vermes que acompanha para visualizar a dinâmica do comportamento da população ao longo do tempo. A configuração da câmara e umO protocolo Ssay pode ser modificado para estudar as respostas do comportamento multimodal, como o efeito de odorantes ou a temperatura nos comportamentos quimiossensivos. Este artigo descreve a construção da câmara de comportamento e do protocolo de ensaio. Também demonstra a utilidade deste método ao ensaiar a resposta de vermes de tipo selvagem e mutantes defeituosos quimiossensíveis para o repelente solúvel conhecido, íons de cobre 4 . Finalmente, o processo de análise de vídeo usando o software fornecido é detalhado.

<table><tbody><tr><td>Extrusões de estrutura de fenda em T de alumínio</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>Perfil único, tamanho de 1", sólido</td></tr><tr><td>Suportes</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1" de comprimento para extrusões de perfil único de 1" de altura</td></tr><tr><td>Fixadores de alimentação final compactos</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1" (único), pacote de 4</td></tr><tr><td>suportes de painel sólido de torção</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T251</td> Para tampas de plástico <td>de alta extrusão de 1"</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T91</td><td>Para alta extrusão de 1"</td></tr><tr><td>Folha de acrílico fundido opticamente transparente</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K211</td><td>3/16" de espessura, 12" x 12"</td></tr> <tr><td>Tecido de poliéster revestido de vinil</td><td>McMaster-Carr</td><td>88505K57</td><td>0.027" de espessura, 61" de largura, preto</td></tr><tr><td>Ilhós de</td> <td>latãoMcMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>Tamanho comercial 0, diâmetro externo de 0,545"</td></tr><tr><td>Arruelas de aço</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>Tamanho do parafuso de 1/4"</td></tr><tr><td>Parafusos de cabeça arredondada</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>Tamanho de rosca de 1/4" - 20, 1 - 1/2" de comprimento</td></tr><tr><td>Luz de fundo operacional padrão</td><td>Luzes Smart Vision</td><td>Veja o fornecedor local</td><td>8" x 8", infravermelho 850 nm</td></tr><tr><td>IVP-C1 Pote de Controle Variável</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Veja o fornecedor</td><td></td>local</tr><tr><td>Fonte de Alimentação T1</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Veja o fornecedor</td><td></td>local</tr><tr><td>Dino lite Pro AM4113T</td><td>Dino-Lite Microscópio Digital Veja</td> o <td>fornecedor</td><td></td>local</tr><tr><td>MS09B suporte para microscópio</td><td>Dino-Lite Microscópio Digital Veja</td> o <td>fornecedor local</td><td></td></tr></tbody></table>

análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

O nematóide, o sistema nervoso compacto de Caenorhabditis elegans de apenas 302 neurônios, está subjacente a um variado repertório de comportamentos. Para facilitar a dissecação dos circuitos neurais subjacentes a esses comportamentos, é necessário o desenvolvimento de ensaios comportamentais robustos e reprodutíveis. Estudos comportamentais anteriores de C. elegans usaram variações de um &quot;teste de queda&quot;, um &quot;teste de quimiotaxis&quot; e um &quot;ensaio de retenção&quot; para investigar a resposta de C. elegans a compostos solúveis. O método descrito neste artigo procura combinar os pontos fortes complementares dos três ensaios acima mencionados. Resumidamente, um pequeno círculo no meio de cada placa de ensaio é dividido em quatro quadrantes com controle e soluções experimentais colocadas alternadamente. Após a adição dos vermes, as placas de ensaio são carregadas em uma câmara de comportamento onde câmeras de microscópio gravam os encontros de vermes com as regiões tratadas. A análise de vídeo automatizada é então realizadaE um valor de índice de preferência (PI) para cada vídeo é gerado. A aquisição de vídeo e os recursos de análise automatizada deste método minimizam o envolvimento do experimentador e quaisquer erros associados. Além disso, quantidades minúsculas do composto experimental são usadas por ensaio e a configuração de câmara múltipla da câmara de comportamento aumenta o rendimento experimental. Este método é particularmente útil para a realização de telas comportamentais de mutantes genéticos e novos compostos químicos. No entanto, este método não é apropriado para estudar a navegação por gradiente de estímulo devido à proximidade das regiões de controle e solução experimental. Também não deve ser usado quando apenas uma pequena população de vermes está disponível. Embora adequado para ensaiar respostas apenas a compostos solúveis na sua forma atual, este método pode ser facilmente modificado para acomodar interação sensorial multimodal e estudos optogenéticos. Este método também pode ser adaptado para ensaiar as respostas quimiossensíveis de outras espécies de nemátodos. </P&gt;

A Figura 3A mostra os valores do índice de preferência obtidos para diferentes tipos de genotipo e parentes de tratamento. Um valor de índice de preferência de 1 indica forte atração pela solução colocada no ROI experimental, enquanto um valor de índice de preferência de -1 indica forte repulsão. Um índice de preferência de 0,02 foi obtido quando a solução tampão M13 foi colocada tanto no ROI de controle quanto experimental, demonstrando que não há viés espacial em relação ao ROI. Os vermes N2 evitaram fortemente os íons de cobre, resultando em um índice de preferência de -0,67, o que corroborou achados prévios de que os íons de cobre são um forte repelente ( filme suplementar 1 ) 4 . Os mutantes osm-3 , que não possuem formação adequada dos segmentos distal dos cílios sensoriais, mostraram uma redução significativamente diminuída dos iões de cobre (PI = -0,19) 15 . Mutantes ocr-2 , que são de<html> Eficaz em muitas respostas nociceptivas mediadas por ASH, incluindo evasão de cobre, também exibem diminuição significativamente diminuída e até mesmo alguma atração suave para íons de cobre (PI = 0,19) ( filme suplementar 2 ) 16 . A Figura 3B mostra parcelas de ocupação de vermes representativas, que indicam a densidade de vermes no controle em relação aos ROIs ao longo do tempo em cada vídeo. Quanto mais escura a cor da área de traçado, maior o número de pixels de sem-fim no ROI. O gráfico de ocupação para worms N2 tratados com o controle de buffer M13 mostra que o número de worms em ambos os ROIs permanece semelhante ao longo do ensaio. No entanto, o gráfico de ocupação para worms N2 tratados com iões de cobre indica que os vermes evitam forte e consistentemente o ROI experimental ao longo do ensaio. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Representação de foto e representação esquemática do design da câmara de comportamento. ( A ) Vista frontal da configuração da câmara de comportamento (esquerda) e representação esquemática correspondente do quadro da câmara (direita). Folhas de poliéster opacas encerram a câmara em todas as faces, exceto a face inferior, que permite a luz através do painel de luz de fundo infravermelho. Os números 1, 2 e 3 correspondem às camadas de extrusão em (B). ( B ) Esquema da vista superior das camadas de extrusão compreendendo a estrutura da câmara de comportamento. Isso inclui a camada superior (1), a camada de montagem da montagem da câmera intermediária (2) e a camada do estágio inferior (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figura 2: Modelos de colocação de solução e alinhamento de placas. ( A ) O modelo de posicionamento de solução possui quatro quadrantes e marcadores de alinhamento de números. A solução de controle é colocada nos quadrantes superior esquerdo e inferior direito enquanto a solução experimental é colocada nos quadrantes superior direito e inferior esquerdo. ( B ) O modelo de alinhamento de placas possui apenas marcadores de alinhamento de números para minimizar a oclusão dos vermes no campo de visão durante a gravação e análise de vídeo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figura 3: Dados de exemplo coletados usando este ensaio. ( A ) Valores do Índice de Preferência (PI) para N2 de tipo selvagem e C. elegans mutantes </e<html> m&gt; em resposta ao tampão M13 e CuCl 2 10 mM. Os vermes de N2 não mostraram preferência entre o controle e os ROIs experimentais quando a solução de controle M13 foi colocada em ambos os ROIs, mas evitou fortemente o ROI experimental quando os íons de cobre foram colocados nele (PI = 0,02 e -0,67, respectivamente). Os mutantes osm-3 (p802) e os mutantes ocr-2 (ak47) mostraram diminuição significativa dos íons de cobre em comparação com N2 (PI = -0,1 e 0,2, respectivamente). N = 6 ensaios para cada emparelhamento de genótipo-tratamento,&gt; 360 worms por ensaio, as barras de erro indicam ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, ANOVA unidirecional seguido do teste post-hoc de Tukey Honestly Significant Difference (HSD). ( B ) Parcelas representativas de ocupação de vermes para N2 worms com tampão M13 em ambos os ROIs (topo) e N2 worms com tampão M13 no ROI de controle e íons de cobre no ROI experimental (parte inferior). A escala de cores abaixo de cada gráfico de ocupação representa o número de pixels sem-fim.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Filme suplementar 1: Resposta comportamental de vermes N2 a 10 mM de cloreto de cobre. As pernas são atraídas para os quadrantes de controle com tampão M13 (superior esquerdo e inferior direito), mas evitam fortemente os quadrantes contendo íons de cobre dissolvidos em tampão M13 (superior direito e inferior esquerdo). O vídeo foi gravado em 1 quadro por segundo e acelerou 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Filme suplementar 2: Resposta comportamental de ocr-2 (ak47) Worms to 10 mM Copper Chloride. Worms percorre uma extensão aproximadamente igual em ambos os quadrantes de controle com tampão M13 (superior esquerdo e inferior direito) e o quadranteS contendo iões de cobre dissolvidos em tampão M13 (superior direito e inferior esquerdo) ao longo da duração da gravação. Os mutantes apresentam uma ligeira preferência pelos quadrantes que contêm iões de cobre no início da gravação. O vídeo foi gravado em 1 quadro por segundo e acelerou 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Arquivo suplementar: modelos de colocação de solução e alinhamento de placas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Apresentamos uma configuração e protocolo de gravação de comportamento que permitem análise automatizada do nematóide, preferência de Caenorhabditis elegans por compostos solúveis em um ensaio populacional. Este artigo descreve a construção de uma câmara de comportamento, o protocolo de ensaio comportamental e o uso de software de análise de vídeo.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

O objetivo geral deste conjunto de configuração e protocolo de gravação comportamental é quantificar a preferência quimiossensorial baseada em população de C. elegans por compostos solúveis, utilizando um sistema de aquisição de vídeo com múltiplas câmeras, seguido por análise automatizada de vídeo. Este método pode facilitar a pesquisa em neurobiologia de C. elegans, permitindo uma análise comportamental mais rápida e padronizada de mutantes genéticos. A principal vantagem desta técnica é que múltiplas réplicas podem ser analisadas simultaneamente sob condições idênticas, ao mesmo tempo em que se monitora a dinâmica temporal da resposta da população de nematoides a estímulos solúveis.Christopher Cronin, cientista da equipe deste laboratório, demonstrará a montagem da câmara de comportamento. Para começar, prepare as capas de tecido, as barras de suporte para câmera, os suportes de canto, as barras de extrusão e o conjunto de montagem da câmera conforme descrito no protocolo textual complementar. Começando pelas barras extremas fixadas à barra central, conecte o suporte da câmera e os coldres ao conjunto de montagem da câmera.Em seguida, monte o quadro da câmara de comportamento. Comece fixando quatro barras de alumínio extrudido de um pé a uma folha quadrada de poliéster. Deslize uma barra sobre as duas porcas em T do tecido da folha, centralizando a barra ao longo da largura do tecido.Ajuste os fixadores para prender a folha de tecido em cada barra. Espalhe a folha quadrada de poliéster sobre a superfície de trabalho com as quatro barras de alumínio fixadas por cima. Em seguida, encaixe oito suportes de canto nas superfícies superiores das quatro barras de alumínio, um em cada extremidade de cada barra.Posicione os suportes de canto nas barras com as pernas verticais do suporte alinhadas com a extremidade das barras e fixe-os apertando os parafusos nos porcas em T. Em cada canto, posicione uma extrusão de alumínio de um pé na vertical, encaixando a extrusão sobre as porcas em T nas duas pernas do suporte de canto. Em seguida, fixe a barra vertical às barras horizontais apertando os fixadores, unindo assim as duas barras horizontais adjacentes.Insira as porcas borboleta soltas do conjunto de montagem da câmera em formato H nas hastes verticais da estrutura. Deixe o H descer completamente até repousar sobre os suportes de canto em cada vértice da estrutura. Fixe o conjunto de montagem da câmera apertando os quatro parafusos dos suportes de canto.Em seguida, utilize aquelas quatro barras finais de alumínio com extrusão de um pé para montar a camada inferior da câmara. Posicione os suportes de canto com as pernas dos suportes alinhadas com a extremidade da barra e aperte os parafusos para fixá-los no lugar. Depois, encaixe as barras para baixo entre os montantes do quadro, com as porcas em T soltas nos canais dos montantes.Posicione a barra de modo que as bordas superiores dos suportes de canto fiquem a uma polegada abaixo da extremidade aberta dos montantes verticais e fixe-a apertando os parafusos dos suportes de canto. Em seguida, deslize as porcas em T das quatro folhas retangulares de poliéster para dentro dos canais das barras extrudadas verticais para cobrir os lados da câmara e aperte os fixadores para prendê-las firmemente. Escolha um dos lados para ser a porta de acesso ao interior da câmara e remova os dois parafusos e porcas em T na camada inferior da câmara.Coloque uma tampa de plástico na extremidade superior de cada canto para servir como pés para o quadro montado. Vire o quadro com o lado certo para cima e insira dois suportes de painel por lâmina dentro da camada de espaço do quadro, girando para fixá-los no lugar. Em seguida, coloque um pedaço de acrílico transparente de 30 por 30 cm sobre os suportes de painel para fornecer uma plataforma para as placas de ensaio.Por fim, posicione a câmera e o molde da platina conforme descrito no protocolo textual complementar. No dia anterior ao experimento, coloque 28 placas vazias de 35 milímetros em pilhas de cinco ou menos sobre uma superfície plana. Encha cada placa de ensaio com cinco mililitros de ágar meio de crescimento para nematoides e deixe as placas de ensaio secarem na posição vertical, com as tampas removidas, durante a noite à temperatura ambiente.No dia do experimento, ligue a luz de fundo, inicialize o computador e abra o software de captura de vídeo da câmera do microscópio. Conecte a câmera do microscópio ao computador e clique na miniatura numerada da câmera na parte superior da janela do software para visualizar a transmissão ao vivo da câmera. Para ajustar as configurações de gravação de vídeo, abra o menu de formato de vídeo no canto superior esquerdo da imagem da câmera e selecione MJPG 1280x1024.Em seguida, clique no menu de pastas ao lado do menu de formato de vídeo e selecione uma pasta na qual salvar os arquivos de vídeo. Clique no ícone de exposição automática no canto superior direito da visualização da câmera e desative a exposição automática. Depois, clique no ícone de LED imediatamente à direita do ícone de exposição automática para desligar os LEDs embutidos da câmera do microscópio.Clique no ícone de configurações adjacente e selecione modo monocromático. Maximizar o contraste e ajustar o brilho. Alinhe um modelo de posicionamento de solução sobre o modelo de alinhamento da placa da platina e clique no ícone de gravação de vídeo em lapso de tempo no lado esquerdo da transmissão da câmera.Digite cinco segundos para a duração e um segundo para o intervalo para gravar um vídeo de calibração de cinco segundos a um quadro por segundo. Use uma pipeta de vidro de cinco mililitros para adicionar 1,2 mililitros de tampão de meio de crescimento de nematoides a uma placa de vermes sincronizados e agite suavemente a placa para transferir os vermes para o tampão. Pipete o tampão da placa e transfira os vermes em tampão para um tubo microcentrífugo limpo.Deixe os tubos em repouso por um a dois minutos para permitir que os vermes sedimentem no fundo. Em seguida, utilize a ponta de uma pipeta plástica para remover o máximo possível do tampão de lavagem sem perturbar o pellet de vermes agregados no fundo dos tubos. Reponha o tubo com um mililitro de tampão de meio de crescimento para nematódeos limpo e repita o procedimento de lavagem mais duas vezes.Em seguida, fixe com fita um modelo para posicionamento de solução sobre a platina de um microscópio estereoscópico. Depois, coloque uma tira de fita adesiva dupla face em cada lado de um modelo para alinhamento de placas. Alinhe o perímetro da placa do ensaio com o círculo no modelo de alinhamento e pressione até que o modelo adira ao fundo da placa.Em seguida, alinhe os marcadores do modelo de placa de ensaio com os marcadores do modelo de posicionamento da solução no microscópio estereoscópico. Depois, utilize uma pipeta P2 para adicionar um microlitro do tampão M13, cada um nos quadrantes um e quatro. Utilize uma ponteira nova para adicionar um microlitro da solução de CuCl2 10 milimolar em cada um dos quadrantes dois e três.Use uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir os vermes lavados para as placas de ensaio assim que as gotas da solução forem completamente absorvidas pelo ágar. Coloque uma gota de vermes nas áreas acima e abaixo das regiões circulares tratadas. Dobre o papel toalha quatro vezes e use a borda romba para absorver o excesso de tampão de lavagem nas placas de ensaio.Organize imediatamente as placas do ensaio sob as câmeras do microscópio na câmara de comportamento, alinhando os números dos cantos do molde. Aguarde dois a três minutos para permitir que os vermes se aclimatizem às placas do ensaio. Em seguida, clique no ícone de gravação de vídeo em lapso de tempo no lado esquerdo da transmissão da câmera e insira 10 minutos para a duração e um segundo para o intervalo, a fim de gravar um vídeo de 10 minutos com um quadro por segundo.Por fim, clique em iniciar para começar a gravação do vídeo. Para cada quadro do vídeo, a função de índice de preferência conta o número de pixels de vermes em cada região de interesse e calcula a porcentagem de um pixel em relação ao número total de pixels na região de interesse. Os valores de índice de preferência obtidos para diferentes combinações de genótipo e tratamento são mostrados aqui.Um valor positivo do índice de preferência indica atração pelo tratamento, enquanto um valor negativo do índice de preferência indica repulsão. Um índice de preferência de 0,02 é obtido quando a solução tampão M13 é colocada nas regiões de controle e experimental de interesse, demonstrando que não há viés espacial. Este gráfico também mostra que os vermes N2 evitaram fortemente os íons de cobre, resultando em um índice de preferência de 0,67.Além disso, osm-3, que apresentam defeitos na formação de cílios sensoriais, e mutantes ocr-2, que são defeituosos nas respostas nociceptivas mediadas por ASH, demonstraram redução na evitação e até mesmo alguma leve atração por íons de cobre. Ao realizar este protocolo, é importante trabalhar rapidamente, mas também com suavidade e consistência. O conjunto de gravação e o protocolo do ensaio podem ser facilmente adaptados para caracterizar respostas comportamentais em populações que surgem das interações entre diferentes variedades sensoriais de C. elegans.

automated-analysis-nematode-population-based-chemosensory-preference

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este vídeo apresenta a quimiotaxia no nematóide C. elegans e mostra um protocolo de amostra testando a aversão quimiotática ao sulfato de cobre.

C. elegans Ensaio de quimiotaxia: um método para testar a quimiossensação em vermes

Os pesquisadores podem desencadear o movimento sob demanda em C. elegans aplicando um campo elétrico que os vermes detectam e respondem. Este vídeo apresenta o comportamento eletrotático e mostra um protocolo de amostra que é feito em um dispositivo microfluídico.

Ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em C. elegans

Este vídeo descreve um ensaio de evitação osmótica para examinar o comportamento de quimioevitação em um modelo de verme transgênico. O comportamento de evitação é testado em uma placa na presença de uma barreira osmótica alta e quimioatraente. Os vermes com perda funcional de neurônios são atraídos pelo quimioatraente, atravessam a barreira osmótica alta e ficam paralisados na zona de armadilha por causa da solução anestésica.

Examine o comportamento de prevenção de quimioterapia em vermes transgênicos usando o ensaio de prevenção osmótica

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica...

C. elegans Chemotaxis Assay

Os ensaios comportamentais fornecem ferramentas poderosas para a compreensão da função neuronal. Aqui apresentamos vários protocolos para quantificar o comportamento alimentar predatório encontrado no nematóide modelo Pristionchus pacificus e seus parentes. Além disso, fornecemos métodos para analisar adaptações alimentares predatórias, incluindo estruturas bucais e dentes.

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em&gt; Pristionchus</em&gt; E outros nematóides

Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

Descrevemos os protocolos para a utilização da plataforma de controle de nematoides amplo campo de visão (WF-NTP), que permite alta produtividade Caracterização fenotípica de grandes populações de Caenorhabditis elegans. Estes protocolos podem ser usados para caracterizar mudanças comportamentais sutis em cepas mutantes ou em resposta ao tratamento farmacológico de forma altamente escalável.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as atividades neuroprotetoras de compostos de teste em Caenorhabditis elegans, incluindo agregação de poliglutamina, morte neuronal e comportamento de quimioavoidance, bem como uma integração exemplar de fenômenos múltiplos.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Aqui, apresentamos um protocolo para testar o aprendizado associativo realizando o condicionamento clássico no organismo modelo C. elegans. O paradigma baseia-se no emparelhamento da concentração de sal no ambiente com a presença ou ausência de alimentos, o que altera sua quimiotaxia para perto ou para longe do sal.

Medindo a aprendizagem associativa em quimiotaxia do nematóide Caenorhabditis elegans

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Aprenda a analisar automaticamente preferências quimiossensoriais em populações de Caenorhabditis elegans usando câmeras múltiplas e software de vídeo. Este método padronizado acelera pesquisas em neurobiologia e análise comportamental de mutantes.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Explorar mais vídeos