Name: A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a cultivar plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma microfluídica de duas camadas para imagem de alta resolução da morfologia radicular em tempo real. Este método permite estudar respostas do crescimento radicular a estímulos físicos e químicos.

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Este manuscrito foi criado pela UT-Battelle, LLC sob contrato n º DE-AC05-00OR22725 com o departamento de energia dos EUA. O governo dos Estados Unidos mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos Estados Unidos mantém uma licença não-exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado de Este manuscrito, ou permitir que outros o façam, para fins de governo dos Estados Unidos. O departamento de energia irá fornecer o acesso do público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Este trabalho foi financiado em parte pelo programa de ciência genômica, departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, biológico e investigação ambiental, como parte da planta micróbio Interfaces foco área científica (http://pmi.ornl.gov). A fabricação das plataformas microfluidic foi realizada no laboratório de pesquisa de nanofabricação no centro para Nanophase Ciências dos materiais, que é uma facilidade do DOE escritório de ciência usuário. JAA é apoiada por uma bolsa de pós-graduação pesquisa de NSF DGE-1452154

1. dois-camada fabricação de plataforma
<ol>
	<li>Fabricação dos mestres multicamadas
	<ol>
		<li>Rotação casaco fotorresiste negativa baseada em epóxi (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) de acordo com as especificações do fabricante (2.000 rpm para 45 s) em uma bolacha de silicone de diâmetro de 4 polegadas para obter a altura desejada de 20 µm para a primeira camada de desenho.</li>
		<li>Macio-cozer as bolachas resist revestido por 4 min a 95 ° C. Permitir a bolacha esfriar por 5 min. expor o wafer de UV, luz para 15 s (~ 150 mJ/cm2 a 365 nm) através de uma Fotomáscara em um UV contatar alinhador para definir a geometria da camada inferior.</li>
		<li>Pós-exposição asse a hóstia durante 5 min à 95 ° C. Sem desenvolver, retornar a bolacha para o aplicador girar e girar em uma segunda camada de fotorresiste negativa baseada em epóxi (~76.75% sólidos, 80.000 cSt) a 3.000 rpm para atingir uma segunda altura de camada de 150-200 µm.</li>
		<li>Permita o wafer de descansar por 5 min antes de transferir para uma placa de 95 ° C por 45 min. Após o cozimento na placa de aquecimento, retirar a bolacha e deixar a resistir esfriar e endurecer em temperatura ambiente por mais 5 minutos em uma superfície plana e nivelada. Alinhar e expor a hóstia para a segunda camada Fotomáscara para 30 s em um alinhador de contato UV (dose de aproximadamente 300 mJ/cm2).</li>
		<li>Executar um Asse pós-exposição ao colocar a bolacha sobre uma placa quente por 15 min a 95 ° C e em seguida, permitir que a bolacha esfriar sobre uma superfície plana e nivelada por 5 min antes de desenvolver.</li>
		<li>Desenvolver as duas camadas de resistir simultaneamente colocando a bolacha em um prato de plástico e submergindo a bolacha no desenvolvedor apropriado (consulte a Tabela de materiais). Agitar suavemente o prato ocasionalmente para lavar desenvolvedor fresco sobre a bolacha.</li>
		<li>Depois de 17 min, enxague a bolacha com isopropanol (IPA). Se aparece um filme branco, continue a iterar entre enxaguar a bolacha com o desenvolvedor e IPA até o filme desaparece. Seque o wafer de silício estampados com nitrogênio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polydimethylsiloxane Soft-litografia
	<ol>
		<li>Expor o wafer de silício de um plasma de ar por 30 s em um plasma líquido de limpeza definido em alta (veja a tabela de materiais) para limpar. Silanize a bolacha com silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octil) em uma capa de química em uma placa de aquecimento abaixo do ponto de inflamação do silano (85 ° C) por 2 h.</li>
		<li>Despeje uma proporção de 10:1 do polydimethylsiloxane (PDMS) para agente de cura para o wafer de silício mestre. Desgaseificar o PDMS misturadas em uma câmara de vácuo e depois curar o polímero em um forno de 70 ° C por 1 h ou até o PDMS é totalmente curado.</li>
		<li>Usando um bisturi, corte os dispositivos PDMS e descascá-los a partir da pastilha de silício mestre. Use um soco de biópsia de 1,5 mm para criar entradas de semente e tratamento, a entrada da semente em um ângulo de 45° para incentivar o crescimento de raiz para o canal principal de perfuração.</li>
		<li>Use fita adesiva transparente para remover restos do dispositivo PDMS e coloque o dispositivo do projeto para baixo sobre uma lamela de vidro. Autoclave os dispositivos montados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. dispositivos de plantação
<ol>
	<li>Preparação de semente de Arabidopsis thaliana
	<ol>
		<li>Superfície de esterilizar a. thaliana sementes em um tubo de microcentrífuga com uma solução de 30% disponível comercialmente lixívia diluída em detergente de Triton X água e 0,1% desionisado para sementes de lavagem de 7 min. 4 vezes com água estéril.</li>
		<li>Estratificar sementes por tubo de microcentrífuga de refrigeração durante a noite ou até uma semana a 4 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação do dispositivo
	<ol>
		<li>Coloque dispositivos esterilizados em um vácuo de desgaseificação câmara para remover o ar do gás permeável PDMS e fluídico canais para melhorar a facilidade de enchimento.</li>
		<li>Remover os dispositivos da câmara de vácuo e mergulhe imediatamente os dispositivos em uma placa de Petri preenchida com media baseada em vegetais líquidos força ¼ em pH 5,7.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta, puxe o líquido através das entradas de para preencher o dispositivo. Certifique-se que não há bolhas de ar permanecem dentro de canais por inspeção visual.</li>
		<li>Transferência de dispositivos individuais para novos pratos de Petri seco. Despeje ou pipeta ágar quente em torno do dispositivo até que o nível de ágar-ágar é quase alinhado com a parte superior do dispositivo PDMS. Permitir que agar para solidificar. Nota: Os dispositivos agora estão prontos para o plantio de sementes ou podem ser armazenados a 4 ° C, até que seja necessário.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plantar sementes dentro de dispositivos
	<ol>
		<li>Em um ambiente estéril, transferi uma semente esterilizada para a entrada de cada dispositivo usando uma pipeta pequena.</li>
		<li>Tampa da placa de Petri com cera filme (veja a Tabela de materiais) e coloque em uma câmara de crescimento ciclismo claro/escuro ou parapeito à temperatura ambiente. Oriente o prato de Petri de modo que os dispositivos são verticais e gravidade incentivará as raízes a crescer através do canal.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. tratamento
<ol>
	<li>Tratamentos experimentais
	<ol>
		<li>Ao tempo desejado no desenvolvimento do seedling, adicione o tratamento experimental para o seedling, adicionando uma quantidade prescrita do tratamento para cada uma das portas 8 lado através de uma pipeta.</li>
		<li>Reseal o prato de Petri e retornar para a câmara de crescimento ou peitoril da janela.</li>
		<li>Prossiga com as amostras de imagem no momento desejado para capturar pontos de tempo individuais ou começar a imagem latente de lapso de tempo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. optical Imaging
<ol>
	<li>Baixa resolução (4-20 X)
	<ol>
		<li>Coloque o prato de Petri inteiro que contém o dispositivo e mudas sob um microscópio de campo claro invertido para campo claro de baixa resolução (4-20 X) ou imagens de interferência diferencial (DIC) de contraste. Otimize as condições de iluminação para elucidar características morfológicas de interesse, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada da raiz e foco na raiz ou root hair(s) de interesse.</li>
		<li>Adquira um ponto de tempo único ou uma série temporal de imagens. Para visualizar o crescimento de pelos radiculares, imagem crescentes cabelos de raiz uma vez por min. Para visualizar o crescimento da raiz principal, adquira uma imagem cada 30 min. retorno de Petri e as mudas para câmara de crescimento ou janela na posição vertical após a conclusão da imagem latente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imagens de maior resolução (20-63 X)
	<ol>
		<li>Uma vez que o seedling cresceu para um momento desejado, use pinça para remover lamela e dispositivo de agar. Limpa o fundo da lamela usando um tecido de laboratório de etanol humedecido.</li>
		<li>Aplica os meios de comunicação de imersão recomendado para o objectivo, tal como sugerido pelo fabricante de lente do microscópio. Colocar a lamela para baixo no palco microscópio e levantar o estágio para entrar em contato com a mídia de imersão no objectivo. Otimize as condições de iluminação, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada e foco na root hair(s) de interesse. Nota: O DIC é necessário para visualizar a ciclose e marcadores de fluorescência são necessários para visualizar o movimento das organelas.</li>
		<li>Para quantificar o crescimento da raiz do cabelo ao longo do tempo, adquira uma imagem por min. Para visualizar o movimento das organelas, minimize o tempo de exposição de fluorescência, mantendo ainda um sinal de fluorescência identificáveis das organelas. Adquira imagens das organelas mais rápido que permite que o tempo de exposição. Para mais imagens de lapso de tempo, use uma incubadora de palco viver-pilha de imagem para manter a umidade e a temperatura ambiente. Nota: Um objectivo de óleo X 63 é recomendado para imagiologia organelas da raiz do cabelo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. não-ópticos Imaging
<ol>
	<li>Preparação do dispositivo
	<ol>
		<li>Uma vez que mudas tem crescido para o tempo desejado,</li></ol></li></ol>Remova o dispositivo e a lamela de Petri.
		<li>Dispositivo de virar de cabeça para baixo e gentilmente descascar a lamela para que a raiz permanece dentro do canal PDMS.</li>
		<li>Continue a usar o dispositivo PDMS como substrato para a raiz em maior força atômica de resolução ou microscopia eletrônica.</li>
	
	
	<li>Microscópio eletrônico de varredura
	<ol>
		<li>Depositar uma fina (~ 20 nm) camada de cromo para a raiz e em torno de PDMS utilizando uma câmara de evaporação feixe de elétron Dual arma.</li>
		<li>Transferi a raiz e o dispositivo PDMS para uma câmara de microscópio eletrônico de varredura. Nota: Imagem condições, ou seja, tensão, distância atual e trabalho precisará ser otimizados para atingir a resolução desejada para um determinado aplicativo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Microscopia de força atômica (AFM)
	<ol>
		<li>Monte o lado de raiz do dispositivo PDMS em um suporte de amostra AFM. Para aumentar o contraste na câmera e mais facilmente distinguir a raiz o PDMS, coloque o dispositivo PDMS em um substrato plano reflexivo (tais como a mica revestida em ouro) antes de montar o dispositivo no suporte de amostra AFM.</li>
		<li>Fixar um acessório bem líquido sobre o dispositivo do PDMS e preenchê-lo com água para manter as raízes hidratadas durante a imagem latente.</li>
		<li>Carrega o suporte de amostra para o AFM. Ajustar o controle de z para a espessura do dispositivo PDMS e dirigir o cantilever para a região de interesse na raiz usando uma câmera para orientação.</li>
		<li>Ajustar o laser com a ponta do cantilever. Para obter melhores resultados com imagens de modo de contato, use cantilevers com constantes de mola de 0,03 ou 0,01 N/m para exercer força mínima na raiz durante a verificação.</li>
		<li>Abaixe lentamente o mecanismo de varredura até o cantilever só faz contato com a amostra. Ajustar o tamanho de varredura para a região desejada e escolha uma velocidade de varredura de 1 linha/s com 256 pontos de tensão por linha. Adquira o scan.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Seth_Pritchard/publication/229773581_Soil_organisms_and_global_climate_change/links/53ee8d000cf26b9b7dccbff1.pdf">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li>
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<li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li>
<li>Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-540-79405-9_8">Root Hairs</a>. , 211-232 (2009).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
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<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li>
<li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li>
<li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7051054/">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li>
<li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytolol%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li>
<li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+elongation%2C+water+stress%2C+and+mechanical+impedance%3A+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophor%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li>
<li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método descrito neste artigo para a criação de uma plataforma de planta-em-um-microplaqueta é o único que da dois-camada design limites os cabelos de raiz para um único plano de imagem e a plataforma pode ser desconstruídos e usados como um substrato para a imagem latente não-ópticos de alta resolução . Usando a imagem latente não-ópticos de alta resolução pode fornecer informações valiosas sobre o tecido de planta que não pode ser obtido da optical imaging em paz. Por exemplo, imagens de AFM podem fornecer medidas de ...

Características de bem de raiz aumentar água e aquisição de nutrientes para a planta, explorando novos espaços do solo e aumentar a área da superfície total da raiz. O volume de negócios desses recursos raiz bem desempenha um papel importante em estimular o metro cadeia alimentar1 e o número de raizes finas em determinadas espécies de plantas é esperado dobrar sob elevado de dióxido de carbono atmosférico2. Raizes finas são geralmente definidos como aqueles menores que 2 mm de diâmetro, embora novas definições defendem caracterizando raizes finas por sua função3. Como muitas raizes finas, cabelos de raiz fornecem a função de captação e absorção, mas ocupam um espaço muito menor com diâmetros da ordem de micra. Por causa de seu tamanho pequeno, pelos radiculares são difíceis de imagem em situ e são negligenciados frequentemente como parte da arquitetura geral da raiz em experimentos de campo escala e modelos.
Ex terra raiz cabelo estuda, tal a partir de mudas cultivadas em placas de ágar, forneceram a comunidade científica com informações valiosas sobre o crescimento celular e transporte4,5. Enquanto as placas de ágar permitem sistemas de raiz ser fotografada não-destrutiva e em tempo real, eles não oferecem alta controle ambiental para a adição de tratamentos experimentais como nutrientes, hormonas vegetais ou bactérias. Uma emergente solução para facilitar a alta resolução de imagem, enquanto também proporcionar controle ambiental dinâmico foi o advento das plataformas microfluidic para estudos de planta. Essas plataformas permitiram o crescimento não-destrutivos e visualização de várias espécies de plantas para alto throughput fenotipagem6,7,8,9, tratamentos químicos isolados 10, medições de força11,12e a adição de microorganismos13. Projetos de plataforma microfluidic centraram-se na utilização de camadas fluídico único espaço aberto, no qual as raízes podem propagar, permitindo que os cabelos de raiz à deriva dentro e fora de foco óptico durante o crescimento ou tratamento.
Aqui nós apresentamos um procedimento para o desenvolvimento de uma plataforma de dois-camada microfluidic usando métodos de macio-litografia e foto que baseia-se projetos de planta-em-um-microplaqueta anteriores por confinar os cabelos de raiz de mudas para o mesmo plano de imagem como a raiz principal. Isso nos permite acompanhar o desenvolvimento da raiz do cabelo em tempo real, em alta resolução e durante todo o processo de tratamento experimental. Nossos métodos de cultivo permitem Arabidopsis thaliana mudas a ser germinadas da semente dentro da plataforma e cultivadas por até uma semana em um ambiente estéril e hidratada que não requer o uso de equipamento de bomba de seringa. Uma vez que o lapso de tempo de imagem experimento concluiu, a plataforma apresentada aqui pode ser aberta sem perturbar a posição dos recursos raiz mais finas. Isto permite o uso de outros métodos de imagem de alta resolução. Aqui nós fornecemos resultados representativos para a quantificação e a visualização da morfologia da raiz do cabelo nesta plataforma por microscopia óptica, varredura (SEM) e de força atômica (AFM) de técnicas de microscopia.

<table><tbody><tr><td>Wafer de silício</td><td>WRS Materiais</td><td>100mm de diâmetro, 500-550um de espessura, Prime, resistividade 10-20, N/Phos< 100></td><td></td></tr><tr><td>Quintel Alinhador de Contato</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Máscara Alinhador</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>tecido de laboratório</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Marca, 34155</td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistente Negativo Epóxi</td><td>Microchem</td><td>SU-8 série</td><td></td>2000s</tr><tr><td>Fotorresistente desenvolvedor</td><td>Microchem</td><td>Su-8 revelador</td><td></td></tr><tr><td>tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octil)</td><td>silano Sigma Aldrich</td><td></td><td>uso em capa química</td></tr><tr><td>Purificador de plasma de ar</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Base</td><td></td>de elastômero</tr><tr><td>de silicone Agente de cura PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Agente</td><td></td></tr> <tr><td>de cura de elastômero de siliconeDessecador</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-000</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>X-acto faca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punção de Biópsia</td><td>Ted Pella</td><td>15110-15</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>Grampos</td><td>Fita</td><td></td>Invisível</tr><tr><td>Tubo de microfuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>J.T.Baker XI98-07</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Chlorox</td><td>Mídia Concentrada</td><td></td></tr><tr><td>à Base de</td><td>Plantas Phyto Technology Laboratories</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agar Teknova</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Filme de cera</td><td>Microscópio de parafilme</td><td></td><td></td></tr> Microscópio de força atômica <tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr> Placa de Petri <tr><td></td><td>Keysight Technologies</td><td>5500 PicoPlus AFM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>JEOL</td><td>7400</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador de feixe de elétrons de pistola dupla</td><td>Thermionics</td><td>Sistema de evaporação de pistola de elétrons duplo personalizado</td><td></td></tr></tbody></table>

a raiz do cabelo morfologia de plântulas de arabidopsis em uma plataforma microfluidic de duas camadas de imagem

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Pelos radiculares aumentam a área de superfície de raiz para melhor absorção de água e absorção de nutrientes pela planta. Porque eles são pequenos em tamanho e muitas vezes obscurecido pelo seu ambiente natural, função e morfologia da raiz do cabelo são difíceis de estudar e muitas vezes excluídos da pesquisa da planta. Nos últimos anos, plataformas microfluidic tem oferecido uma maneira de visualizar os sistemas de raiz em alta resolução sem perturbar as raízes durante a transferência de um sistema de imagem. A plataforma microfluidic aqui apresentados compilações em pesquisas anteriores de planta-em-um-microplaqueta ao incorporar um dispositivo de duas camadas para confinar a raiz principal de Arabidopsis thaliana ao mesmo plano óptico como os pelos da raiz. Este projeto permite a quantificação dos cabelos de raiz em um celular e organela nível e também impede o eixo z à deriva durante a adição de tratamentos experimentais. Descrevemos como armazenar os dispositivos em um ambiente contido e hidratado, sem a necessidade de bombas fluídico, mantendo um ambiente de gnotobiotic para o seedling. Após a experiência de imagem óptica, o dispositivo pode ser desmontado e usado como um substrato para a força atômica ou microscópio eletrônico de varredura, mantendo estruturas bem raiz intacta.

Os dispositivos de microfluidic PDMS da dois-camada aqui descritos têm um canal de alta de 200 µm para a raiz principal de Arabidopsis e uma câmara alta de 20 µm para confinar lateralmente crescentes pelos radiculares (figura 1A). Este projeto pode ser utilizado para espécies de plantas com diâmetros de raiz semelhante como Arabidopsis thaliana e pode ser facilmente modificado para acomodar a espécie de diferentes tamanhos. O design...

Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

O objetivo geral deste método de cultivo espaçado em microfluídica é cultivar plantas diretamente a partir de sementes em um ambiente estruturado que também possa ser usado para tratamentos controlados e para a obtenção de imagens de alta resolução das raízes das plântulas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia vegetal, como, por exemplo, como o crescimento da raiz da planta responde a estímulos físicos e químicos em múltiplas escalas de comprimento. A principal vantagem desta plataforma é que as raízes são confinadas a um único plano, tornando possível tratá-las e observá-las sem perda de foco óptico.Ajuda-me hoje a Dra. Sahar Hasim, ela é professora associada de pesquisa na Universidade do Tennessee. Para começar, despeje uma proporção de 10:1 de PDMS em relação ao agente de cura sobre uma pastilha-mestre pré-fabricada e silanizada. Desgaseifique o PDMS em uma câmara de vácuo e, em seguida, cure o polímero em uma estufa a 70 graus Celsius por uma hora.Em seguida, utilize um bisturi para cortar os dispositivos de PDMS e removê-los do molde. Depois, use uma biópsia de 1,5 mililitro para furar a entrada de sementes em um ângulo de 45 graus, para favorecer o crescimento da raiz para dentro do canal principal. Além disso, use o mesmo furador para limpar as entradas de tratamento.Use fita adesiva para remover qualquer detrito do dispositivo e coloque-o com o lado de design voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro de cobertura. Após a montagem, esterilize os dispositivos em autoclave. Coloque as sementes de Arabidopsis thaliana em um tubo microcêntrifuga e adicione uma mistura de água sanitária e detergente para esterilizar as sementes.Em seguida, lave as sementes quatro vezes com água estéril. Depois, estratifique as sementes refrigerando-as no tubo microcêntrifuga durante a noite ou armazene-as por até uma semana a quatro graus Celsius. Antes de usar os dispositivos estéreis, coloque-os em uma câmara de desgaseificação a vácuo para remover o ar dos canais fluídicos e do PDMS permeável a gases.Isso melhorará o preenchimento subsequente dos dispositivos. Remova os dispositivos da câmara de vácuo e imediatamente submerja-os em uma placa de Petri contendo meio líquido à base de plantas em concentração de um quarto, com pH de 5,7. Usando uma pipeta, aspire o líquido através das entradas para preencher o dispositivo.Certifique-se de que não permaneçam bolhas de ar nos canais, inspecionando-os visualmente antes de transferi-los para placas de Petri individuais, limpas e secas. Em seguida, despeje ágar quente ao redor do dispositivo até que o nível do ágar esteja quase no mesmo nível do topo do dispositivo. Em um ambiente estéril, utilize uma pipeta pequena e transfira uma semente esterilizada para a entrada de cada dispositivo.Em seguida, cubra cada placa de Petri com filme de cera e coloque-as em uma câmara de crescimento com ciclo claro-escuro à temperatura ambiente. Oriente a placa de Petri na câmara de crescimento à temperatura ambiente, na posição vertical, para que a gravidade incentive o crescimento das raízes através do canal. No momento desejado e estágio de desenvolvimento da plântula, utilize uma pipeta para adicionar uma quantidade prescrita do tratamento experimental a cada uma dos oito orifícios laterais nos dispositivos.Quando terminar, resele as placas de Petri com filme de cera. Em seguida, devolva-as à câmara de crescimento. Ajuste a ampliação de um microscópio invertido de campo claro, entre 4x e 20x de ampliação.Coloque toda a placa de Petri contendo o dispositivo e a plântula sob o microscópio para obtenção de imagens em campo claro ou contraste de interferência diferencial. Otimize as condições de iluminação ajustando os tempos de exposição, o brilho da lâmpada, a abertura e a polaridade da luz para evidenciar as características morfológicas de interesse. Em seguida, mova a platina para a área desejada da raiz e foque na raiz ou no pêlo radicular de interesse.Adquira um único ponto temporal ou uma série temporal de imagens para visualizar o crescimento dos pelos radiculares. Para a série temporal, capture imagens dos pelos radiculares em crescimento a cada minuto. Para visualizar o crescimento da raiz principal, adquira uma imagem a cada 30 minutos.Quando terminar, devolva a placa de Petri e as plântulas à câmara de crescimento, em posição vertical. Após a plântula ter crescido pelo tempo desejado, use uma pinça para remover a lamínula e o dispositivo do ágar. Em seguida, umedeça um papel toalha de laboratório com etanol e use-o para limpar a parte inferior da lamínula.Aplicar o óleo adequado em uma objetiva de imersão em óleo de 63x e posicionar a lamínula voltada para baixo na platina do microscópio. Em seguida, elevar a platina para que entre em contato com o meio de imersão na objetiva. Otimizar as condições de iluminação ajustando os tempos de exposição, o brilho da lâmpada, a abertura e a polaridade da luz.Em seguida, mova a platina para a área desejada da raiz e foque nos pelos radiculares de interesse. Para quantificar o crescimento dos pelos radiculares ao longo do tempo, configure o software para adquirir uma imagem por minuto, na localização de interesse. Para visualizar a autofluorescência da planta ou marcadores fluorescentes, minimize o tempo de exposição à fluorescência, mantendo ainda um sinal fluorescente identificável.Adquira imagens das organelas tão rapidamente quanto o tempo de exposição permitir. Assim que a plântula tiver crescido pelo tempo desejado, remova o dispositivo e a lamínula da placa de Petri. Vire o dispositivo de cabeça para baixo e retire cuidadosamente a lamínula, de modo que a raiz permaneça dentro do canal de PDMS.Coloque o dispositivo de PDMS sobre um substrato plano e reflexivo, como, por exemplo, microrevestido com ouro, e, em seguida, monte o dispositivo no suporte da amostra do MFA, com a raiz voltada para cima. Após fixar um acessório de poço líquido na parte superior do dispositivo de PDMS, preencha-o com água para manter as raízes hidratadas durante a obtenção de imagens. Uma vez que a amostra tenha sido inserida no MFA, ajuste o controle z para a espessura do dispositivo de PDMS e conduza o cantiléver até a região de interesse na raiz.Usando uma câmera como orientação, alinhe o laser com a ponta do cantiléver e utilize a imagem em modo de contato para exercer força mínima sobre a raiz durante a varredura. Abaixe lentamente o mecanismo de varredura até que o cantiléver entre em contato com a amostra. Em seguida, ajuste o tamanho da varredura para a região desejada e escolha uma velocidade de varredura de uma linha por segundo com 256 pontos de tensão por linha.Por fim, adquira a varredura. Os dispositivos microfluídicos de PDMS com duas camadas descritos aqui possuem um canal central com 200 micrômetros de altura para a raiz principal de Arabidopsis e duas câmaras laterais com 20 micrômetros de altura, para confinar os pêlos radiculares que crescem lateralmente. Isso garante que os pêlos radiculares estejam no mesmo plano de imagem da raiz principal.No interior da plataforma microfluídica, os pelos radiculares podem ser quantificados em nível celular, em termos de seu comprimento, densidade e angularidade de crescimento a partir da raiz. Uma das maiores vantagens do uso de uma plataforma microfluídica é a capacidade de adicionar concentrações precisas e uniformes de tratamentos químicos aos organismos. Aqui, uma plântula é imageada antes e depois da adição de microesferas fluorescentes de poliestireno carboxiladas.A adição deste tratamento abiótico não perturbou a orientação do foco óptico dos pelos radiculares das plântulas. Utilizando marcadores fluorescentes, pode-se observar o fluxo citoplasmático em um pelo radicular. O movimento desses três orgânulos é mostrado neste gráfico de distribuição cumulativa.Além da imagem óptica, esta plataforma também permite imagens por AFM e SEM, devido à sua capacidade de ser desmontada sem perturbar a raiz. Após este procedimento, outros métodos, incluindo imagem química, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como são os perfis químicos ao redor da raiz.

imaging-root-hair-morphology-arabidopsis-seedlings-two-layer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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