Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução
25 de agosto de 2017
Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.
O objetivo geral dessa transferência de genes de vetores de vírus adeno-associados é manipular geneticamente o cérebro e a medula espinhal do rato em larga escala. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da transferência de genes. É uma maneira muito eficiente de introduzir genes in vivo e, portanto, uma técnica muito poderosa e versátil.
Este procedimento é rápido e altamente reprodutível. Usamos essa abordagem de transferência de genes em larga escala para expressar uma proteína relacionada à esclerose lateral amiotrófica em toda a medula espinhal de ratos em várias publicações. O meu colega, Robert Dayton, irá demonstrar o procedimento.
Mychal Grames estará ajudando Robert. Comece preparando a estação de trabalho, primeiro, limpe a superfície com etanol 70%. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento na área de trabalho e ajuste-a para aquecer a 37 graus Celsius.
Coloque uma almofada de bancada em cima da almofada de aquecimento. Verifique se há oxigênio e isoflurano adequados para o procedimento. Limpe a câmara de indução e a máscara de anestesia com etanol 70% e coloque a máscara de anestesia na almofada do banco.
Certifique-se de que o seguinte esteja em mãos, um quadrado de filme de parafina de cerca de 5 x 5 centímetros por animal, uma almofada de preparação de álcool e duas ou três compressas de gaze por animal, pontas de pipeta e uma micropipeta. Em seguida, descongele o vetor à temperatura ambiente e rotule um tubo de microcentrífuga estéril para cada animal. Pipetar o volume necessário de AAV para o tubo apropriado e elevar o volume até o volume de injeção desejado com solução de ringer com lactato ou solução salina.
Pós-vórtice da amostra por um ou dois segundos e, em seguida, centrífuga de pulso por cinco segundos para levar a amostra ao fundo do tubo. Pipetar o volume total de injeção para fora do tubo e para o quadrado de filme de parafina. Em seguida, coloque uma agulha de calibre 30 em uma seringa de um mililitro.
Coloque a agulha com o chanfro voltado para baixo no vetor no filme de parafina. Puxe o êmbolo da seringa para trás até que todo o vírus esteja na agulha e na seringa. Anestesifique adequadamente o rato usando o sistema de anestesia.
Garanta um plano adequado de anestesia pela ausência de reação a uma pinça do dedo do pé. Em seguida, coloque o rato na área de trabalho de lado e mantenha a anestesia usando o cone do nariz. Com o rato deitado de lado, uma veia lateral da cauda deve estar voltada para cima.
A injeção é dois terços abaixo do comprimento da cauda. Limpe o local da injeção com a compressa de preparação de álcool. Segure firmemente a cauda ligeiramente acima da área de injeção, com um dedo diretamente sobre a veia lateral da cauda, isso dilatará a veia.
Com o chanfro voltado para cima, alinhe a agulha com a veia da cauda visível na mesma direção. Perfure a pele sobre a veia da cauda, tomando muito cuidado para evitar que a outra mão segure a cauda e pressione a veia da cauda. Libere a pressão da veia da cauda para permitir o fluxo sanguíneo normal.
Em seguida, mova a agulha para a veia. Para garantir que a agulha perfurou a veia da cauda, puxe ligeiramente o êmbolo para trás. Se a agulha estiver na veia, o sangue fluirá para a agulha.
Depois de reposicionar a agulha, se necessário, estabilize a agulha segurando a extremidade da seringa contra a cauda. Injete lentamente o vetor na cauda a aproximadamente 20 microlitros por segundo. No caso de uma injeção deficiente, o animal será apenas parcialmente transduzido e os resultados provavelmente não serão úteis.
No entanto, com a prática, boas injeções são muito reprodutíveis e confiáveis. Se o vetor tiver sido administrado, remova a agulha da cauda e pressione uma gaze contra o local da injeção para ajudar a estancar o sangramento por 30 a 60 segundos. Desligue a anestesia com isoflurano e o oxigênio.
Monitore o rato até que ele recupere a consciência e depois devolva-o à sua gaiola. Descarte os materiais que podem estar contaminados com AAV em um recipiente de risco biológico apropriado e limpe a estação de trabalho com etanol 70%. Obtenha cortes coronais de 50 mícrons do cérebro fixo e crioprotegido de um animal injetado com AAV, usando um micrótomo deslizante com estágio de congelamento.
Após a imunocoloração para GFP e montagem em lâminas, fotomicrografe cada seção na região de interesse definida com uma lente de baixa ampliação usando um microscópio. Mantenha as configurações da câmera iguais em todas as amostras a serem analisadas e salve os dados como arquivos TIFF. Abra a fotomicrografia no programa Scion Image amplamente disponível.
Duas janelas se abrirão, feche a janela indicada como cor de índice. Escolha as opções e, em seguida, a fatia de densidade. Uma variedade de tons será indicada em vermelho na janela da mesa de pesquisa.
Na janela, use o cursor para preencher apenas a rotulagem GFP específica e pare quando o plano de fundo não específico começar a ser captado na imagem. Em seguida, clique em analisar e definir escala. A quarta linha deve dizer unidades, na lista suspensa, escolha pixels e clique em OK.
Para medir a área fluorescente, clique em analisar e, em seguida, meça. Em seguida, clique em analisar e mostrar resultados. Uma janela de resultados aparecerá e a medição da área fluorescente estará sob o título rotulado como área.
Uma vez que todas as medições tenham sido registradas, calcule a média dos valores de três a seis seções por animal. Use um teste estatístico apropriado para comparar as áreas transduzidas entre os grupos. Esta imagem representativa mostra a imunofluorescência de GFP no cerebelo de ratos, quatro semanas após uma injeção de AAV 9 GFP na veia da cauda.
Um software de análise de imagem foi usado para destacar seletivamente a área fluorescente e quantificar os pixels destacados. Esta é a imagem GFP de um animal não transduzido. A análise desta imagem, usando os mesmos parâmetros para o animal injetado com GFP, detecta um nível muito baixo de sinal de fundo.
Uma vez dominada, a injeção pode ser feita em cerca de cinco minutos por rato. Em conclusão, esta técnica descreve uma maneira de introduzir genes de forma eficiente no SNC de ratos, uma entrega única de genes que produz expressão duradoura e efeitos a longo prazo. Mais importante ainda, o sistema nervoso central é manipulado a partir da periferia.
Uma injeção de vetor intravenoso relativamente não invasiva atinge o cérebro e a medula espinhal, o SNC.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo discute um método para entrega em larga escala de genes ao sistema nervoso central (CNS) em ratos utilizando um vetor de vírus adeno-associado. A técnica tem como objetivo imitar doenças que afetam a medula espinhal e permite a entrega de proteínas terapêuticas por meio de uma única administração periférica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia gênica
- Neurociência
- Desenvolvimento de vetores
Antecedentes
- Os vetores de vírus adeno-associados são eficazes para transferência gênica in vivo.
- A entrega gênica pode auxiliar na compreensão de doenças neurológicas.
- Estudos anteriores utilizaram este método para diversas aplicações.
- A técnica é conhecida por sua eficiência e reprodutibilidade.
Objetivo do Estudo
- Manipular geneticamente o cérebro e a medula espinhal do rato.
- Explorar o potencial da transferência gênica no tratamento de doenças do SNC.
- Fornecer um método rápido e versátil para introdução gênica.
Métodos Utilizados
- Uso de vetores de vírus adeno-associados para transferência gênica.
- Administração periférica para transdução ampla.
- Aplicação do método para expressar proteínas relacionadas a doenças.
- Demonstração do procedimento por um colega.
Resultados Principais
- Expressão bem-sucedida de proteínas relacionadas à esclerose lateral amiotrófica.
- Eficiência comprovada na entrega gênica ao longo da medula espinhal.
- Método validado por meio de múltiplas publicações.
- Destacada a versatilidade da técnica de transferência gênica.
Conclusões
- O método é uma ferramenta poderosa para a pesquisa do SNC.
- Ele fornece insights sobre aplicações de terapia gênica.
- Estudos futuros podem expandir seu potencial terapêutico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite uma transdução eficiente e em larga escala do sistema nervoso central em ratos por meio da administração intravenosa de AAV, apoiando a validação pré-clínica de alvos e a redução de riscos mecanicistas em modelos de doenças neurodegenerativas. A abordagem fornece uma via reprodutível e não invasiva para alcançar expressão ampla do transgene no cérebro e na medula espinhal, facilitando testes de hipóteses em estudos de neurogenética e entrega de proteínas terapêuticas. Sua relevância reside na aceleração dos fluxos de trabalho pré-clínicos mediante a redução da variabilidade biológica e a melhoria da confiança preditiva no engajamento de alvos e na modulação de vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da expressão generalizada de transgenes no sistema nervoso central em um modelo de rato fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a expressão sustentada de transgenes após uma única administração periférica.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao demonstrar transdução dependente da dose em regiões do cérebro e da medula espinhal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera leituras quantificáveis de expressão de transgene por meio da quantificação da fluorescência da GFP em regiões definidas do SNC.
- Reprodutibilidade: Fornece níveis altamente consistentes de transdução entre animais, permitindo a padronização confiável do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com estudos envolvendo múltiplos animais devido ao procedimento rápido de injeção (~5 minutos por rato) e à variabilidade técnica mínima.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modelagem de Doença: Imita a patologia disseminada observada em doenças neurodegenerativas como a ELA por meio da transdução de toda a medula espinhal.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir a expressão de transgenes a longo prazo para avaliação fenotípica.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a avaliação da entrega de proteínas terapêuticas e do engajamento do alvo em compartimentos do SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo testes precoces de hipóteses sobre alvos, desenvolvimento escalonável de ensaios e avaliação fenotípica longitudinal em sistemas relevantes para a doença.
- Biologia de Descoberta: Facilita a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da entrega ampla de transgenes no SNC.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de expressão de transgenes para avaliação de compostos ou construtos.
- Análises: Permite a quantificação baseada em fluorescência da eficiência de transdução utilizando ferramentas de análise de imagem.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao modelar patologias amplas do SNC e a expressão de proteínas terapêuticas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para transferência gênica direcionada ao SNC em múltiplos alvos e modalidades terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir a transdução consistente e em larga escala do SNC para validação de alvos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de um protocolo rápido e bem definido de injeção intravenosa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao fornecer dados confiáveis de transdução do SNC em estudos pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao validar o engajamento do alvo em um modelo de rato relevante para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de roedores, injeção intravenosa e técnica asséptica.
- Depende do acesso à produção de vetores AAV, equipamentos de anestesia e sistemas de imagem de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao volume de injeção, título do vetor e períodos de incubação pós-injeção.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sorotipos, promotores e cargas de transgênico.
- Limitado pelas possíveis respostas imunes ao AAV e pela variabilidade na acessibilidade da veia caudal entre os animais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Preparation for Injection
2:47
Vector Injection
4:55
Quantification of GFP Expression in the Cerebellum
6:48
Rapid Quantification of the GFP-positive Fluorescent Area in the Cerebellum After Intravenous AAV Administration to the Rat
7:30
Conclusion
