Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução
25 de agosto de 2017
Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.
O objetivo geral dessa transferência gênica com vetor de vírus adeno-associado é manipular geneticamente o cérebro e a medula espinhal do rato em uma ampla escala abrangente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transferência gênica. É uma maneira muito eficiente de introduzir genes in vivo e, portanto, uma técnica muito poderosa e versátil.
Este procedimento é rápido e altamente reprodutível. Utilizamos esta abordagem de transferência gênica em larga escala para expressar uma proteína relacionada à esclerose lateral amiotrófica em toda a medula espinhal de ratos em diversas publicações. Meu colega, Robert Dayton, demonstrará o procedimento.
Mychal Grames ajudará Robert. Comece preparando a estação de trabalho: primeiro, limpe a superfície com etanol 70%. Em seguida, coloque uma almofada aquecida na área de trabalho e ajuste-a para aquecer a 37 graus Celsius.
Coloque uma almofada de bancada sobre o aquecedor. Verifique se há oxigênio e isoflurano suficientes para o procedimento. Limpe a câmara de indução e a máscara de anestesia com etanol 70% e coloque a máscara de anestesia sobre a almofada de bancada.
Certifique-se de ter em mãos o seguinte: um quadrado de filme de parafina de aproximadamente 5 x 5 centímetros por animal, um lenço umedecido com álcool e duas ou três compressas de gaze por animal, ponteiras e uma micropipeta. Em seguida, descongele o vetor em temperatura ambiente e rotule um tubo estéril de microcentrífuga para cada animal. Pipete o volume necessário de AAV no tubo apropriado e complete o volume até o volume de injeção desejado com solução de Ringer lactato ou solução salina.
Após agitar a amostra no vórtex por um ou dois segundos, faça uma centrifugação breve de cinco segundos para levar a amostra para o fundo do tubo. Pipete o volume total de injeção para fora do tubo e sobre o quadrado de filme de parafina. Em seguida, coloque uma agulha de calibre 30 em uma seringa de um mililitro.
Coloque a agulha com o bisel voltado para baixo no vetor sobre o filme de parafina. Puxe o êmbolo da seringa até que todo o vírus esteja dentro da agulha e da seringa. Anestesie adequadamente o rato utilizando o sistema de anestesia.
Assegure um plano anestésico adequado pela ausência de reação a um aperto no dedo do pé. Em seguida, posicione a rata na área de trabalho de lado e mantenha a anestesia utilizando o cone nasal. Com a rata deitada de lado, uma veia lateral da cauda deve estar voltada para cima.
A injeção é realizada a dois terços do comprimento da cauda. Limpe o local da injeção com o cotonete umedecido em álcool. Segure firmemente a cauda logo acima da área de injeção, com um dedo diretamente sobre a veia lateral da cauda; isso fará com que a veia se dilate.
Com o bisel voltado para cima, alinhe a agulha com a veia caudal visível na mesma direção. Fure a pele sobre a veia caudal, tomando muito cuidado para evitar a outra mão que segura a cauda e pressiona a veia caudal. Libere a pressão da veia caudal para permitir o fluxo sanguíneo normal.
Em seguida, mova a agulha para dentro da veia. Para garantir que a agulha perfurou a veia da cauda, puxe levemente o êmbolo. Se a agulha estiver dentro da veia, o sangue fluirá para dentro dela.
Após reposicionar a agulha, se necessário, estabilize-a segurando a extremidade da seringa contra a cauda. Injete lentamente o vetor na cauda a aproximadamente 20 microlitros por segundo. No caso de uma injeção inadequada, o animal será apenas parcialmente transduzido e os resultados provavelmente não serão úteis.
No entanto, com prática, injeções adequadas são muito reprodutíveis e confiáveis. Se o vetor tiver sido administrado, retire a agulha da cauda e pressione um pedaço de gaze contra o local da injeção para ajudar a conter o sangramento por 30 a 60 segundos. Desligue a anestesia com isoflurano e o oxigênio.
Monitore a rata até que ela recupere a consciência e, em seguida, devolva-a à sua gaiola. Descarte os materiais que possam estar contaminados com AAV em um recipiente apropriado para risco biológico e limpe a bancada com etanol 70%. Obtenha seções coronais de 50 mícrons do cérebro fixado e crioprotegido de um animal injetado com AAV, utilizando um micrótomo deslizante com estágio congelante.
Após a imunomarcação para GFP e montagem em lâminas, fotomicrografe cada corte na região de interesse definida com uma lente de baixa ampliação usando um microscópio. Mantenha as configurações da câmera iguais em todas as amostras a serem analisadas e salve os dados como arquivos TIFF. Abra a fotomicrografia no programa Scion Image, amplamente disponível.
Duas janelas serão abertas; feche a janela indicada como cor do índice. Escolha as opções e, em seguida, a fatia de densidade. Uma faixa de tons será indicada em vermelho na janela da tabela de consulta.
Na janela, use o cursor para preencher apenas a marcação específica de GFP e pare quando o fundo não específico começar a ser detectado na imagem. Em seguida, clique em analisar e definir escala. Na quarta linha, onde deve constar unidades, escolha pixels na lista suspensa e clique em ok.
Para medir a área fluorescente, clique em analisar e depois em medir. Em seguida, clique em analisar e mostrar resultados. Uma janela de resultados aparecerá e a medição da área fluorescente estará sob o título denominado área.
Após registrar todas as medições, calcule a média dos valores obtidos em três a seis secções por animal. Utilize um teste estatístico apropriado para comparar as áreas transduzidas entre os grupos. Esta imagem representativa mostra a imunofluorescência de GFP no cerebelo de rato, quatro semanas após uma injeção na veia caudal de AAV 9 GFP.
O software de análise de imagens foi utilizado para destacar seletivamente a área fluorescente e quantificar os pixels destacados. Esta é a imagem GFP de um animal não transduzido. A análise desta imagem, utilizando os mesmos parâmetros do animal injetado com GFP, detecta um sinal de fundo muito baixo.
Uma vez dominada, a injeção pode ser realizada em cerca de cinco minutos por rato. Em conclusão, esta técnica descreve uma maneira de introduzir genes de forma eficiente no SNC de ratos, em que uma única entrega genética produz expressão duradoura e efeitos de longo prazo. Mais importante, o sistema nervoso central é manipulado a partir da periferia.
Uma injeção intravenosa de vetor relativamente não invasiva alcança o cérebro e a medula espinhal, o SNC.
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Visão Geral
Este artigo discute um método para entrega em larga escala de genes ao sistema nervoso central (CNS) em ratos utilizando um vetor de vírus adeno-associado. A técnica tem como objetivo imitar doenças que afetam a medula espinhal e permite a entrega de proteínas terapêuticas por meio de uma única administração periférica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia gênica
- Neurociência
- Desenvolvimento de vetores
Antecedentes
- Os vetores de vírus adeno-associados são eficazes para transferência gênica in vivo.
- A entrega gênica pode auxiliar na compreensão de doenças neurológicas.
- Estudos anteriores utilizaram este método para diversas aplicações.
- A técnica é conhecida por sua eficiência e reprodutibilidade.
Objetivo do Estudo
- Manipular geneticamente o cérebro e a medula espinhal do rato.
- Explorar o potencial da transferência gênica no tratamento de doenças do SNC.
- Fornecer um método rápido e versátil para introdução gênica.
Métodos Utilizados
- Uso de vetores de vírus adeno-associados para transferência gênica.
- Administração periférica para transdução ampla.
- Aplicação do método para expressar proteínas relacionadas a doenças.
- Demonstração do procedimento por um colega.
Resultados Principais
- Expressão bem-sucedida de proteínas relacionadas à esclerose lateral amiotrófica.
- Eficiência comprovada na entrega gênica ao longo da medula espinhal.
- Método validado por meio de múltiplas publicações.
- Destacada a versatilidade da técnica de transferência gênica.
Conclusões
- O método é uma ferramenta poderosa para a pesquisa do SNC.
- Ele fornece insights sobre aplicações de terapia gênica.
- Estudos futuros podem expandir seu potencial terapêutico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite uma transdução eficiente e em larga escala do sistema nervoso central em ratos por meio da administração intravenosa de AAV, apoiando a validação pré-clínica de alvos e a redução de riscos mecanicistas em modelos de doenças neurodegenerativas. A abordagem fornece uma via reprodutível e não invasiva para alcançar expressão ampla do transgene no cérebro e na medula espinhal, facilitando testes de hipóteses em estudos de neurogenética e entrega de proteínas terapêuticas. Sua relevância reside na aceleração dos fluxos de trabalho pré-clínicos mediante a redução da variabilidade biológica e a melhoria da confiança preditiva no engajamento de alvos e na modulação de vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da expressão generalizada de transgenes no sistema nervoso central em um modelo de rato fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a expressão sustentada de transgenes após uma única administração periférica.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao demonstrar transdução dependente da dose em regiões do cérebro e da medula espinhal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera leituras quantificáveis de expressão de transgene por meio da quantificação da fluorescência da GFP em regiões definidas do SNC.
- Reprodutibilidade: Fornece níveis altamente consistentes de transdução entre animais, permitindo a padronização confiável do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com estudos envolvendo múltiplos animais devido ao procedimento rápido de injeção (~5 minutos por rato) e à variabilidade técnica mínima.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modelagem de Doença: Imita a patologia disseminada observada em doenças neurodegenerativas como a ELA por meio da transdução de toda a medula espinhal.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir a expressão de transgenes a longo prazo para avaliação fenotípica.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a avaliação da entrega de proteínas terapêuticas e do engajamento do alvo em compartimentos do SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo testes precoces de hipóteses sobre alvos, desenvolvimento escalonável de ensaios e avaliação fenotípica longitudinal em sistemas relevantes para a doença.
- Biologia de Descoberta: Facilita a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da entrega ampla de transgenes no SNC.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de expressão de transgenes para avaliação de compostos ou construtos.
- Análises: Permite a quantificação baseada em fluorescência da eficiência de transdução utilizando ferramentas de análise de imagem.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao modelar patologias amplas do SNC e a expressão de proteínas terapêuticas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para transferência gênica direcionada ao SNC em múltiplos alvos e modalidades terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir a transdução consistente e em larga escala do SNC para validação de alvos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de um protocolo rápido e bem definido de injeção intravenosa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao fornecer dados confiáveis de transdução do SNC em estudos pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao validar o engajamento do alvo em um modelo de rato relevante para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de roedores, injeção intravenosa e técnica asséptica.
- Depende do acesso à produção de vetores AAV, equipamentos de anestesia e sistemas de imagem de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao volume de injeção, título do vetor e períodos de incubação pós-injeção.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sorotipos, promotores e cargas de transgênico.
- Limitado pelas possíveis respostas imunes ao AAV e pela variabilidade na acessibilidade da veia caudal entre os animais.
