Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN
12 de novembro de 2017
Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.
O objetivo geral desses experimentos é induzir lesões de DNA usando microirradiação local de células e observar o recrutamento de proteínas envolvidas nos processos de reparo do DNA. Este método pode nos ajudar a entender uma questão muito complexa e profunda, como as células normais e cancerígenas respondem à lesão do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que somos capazes de estudar a resposta a danos no DNA em células vivas individuais. A demonstração do procedimento será feita por Sona Legartova, pós-doutoranda e Jana Suchankova, estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, cultive células HeLa em DMAM suplementado com 10% de FBS e antibióticos apropriados. Incubar as células a 37
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Visão Geral
A microirradiação a laser é uma técnica valiosa para investigar os mecanismos de reparo do DNA em células vivas. Este estudo apresenta um método otimizado para utilizar lasers UVA com o fim de induzir lesões específicas no DNA, preservando ao mesmo tempo a progressão normal do ciclo celular.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Reparação do DNA
- Biologia celular
- Microirradiação a laser
Contexto
- Compreender a reparação do DNA é essencial para obter informações sobre as respostas celulares ao dano.
- A microirradiação com laser permite a indução precisa de lesões no DNA.
- Manter o ciclo celular normal é essencial para o estudo preciso dos mecanismos de reparação.
- Os lasers UVA são eficazes na criação de danos localizados no DNA.
Objetivo do Estudo
- Otimizar um método de microirradiação local utilizando lasers UVA.
- Investigar os efeitos de lesões induzidas no DNA sobre a progressão do ciclo celular.
- Aprimorar a compreensão dos processos de reparo do DNA em células vivas.
Métodos Utilizados
- Utilização de lasers UVA para microirradiação.
- Monitoramento da progressão do ciclo celular após irradiação.
- Avaliação dos mecanismos de reparo do DNA em células irradiadas.
- Comparação do comportamento de células normais e irradiadas.
Resultados Principais
- O método de microirradiação otimizado induziu com sucesso lesões no DNA.
- As células mantiveram a progressão normal do ciclo celular apesar da irradiação.
- Foi alcançada uma avaliação eficaz dos mecanismos de reparo do DNA.
- Os achados contribuem para a compreensão das respostas celulares ao dano no DNA.
Conclusões
- O método otimizado de microirradiação com laser UVA é eficaz para o estudo da reparação do DNA.
- Mantiver o ciclo celular normal é crucial para resultados experimentais precisos.
- Essa abordagem pode ser aplicada a pesquisas adicionais sobre danos e reparação do DNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia confocal avançada combinada com microirradiação a laser permite a investigação precisa, em células vivas, de interações entre proteínas e cinética de reparo em lesões do DNA. Essa capacidade é fundamental para reduzir riscos em hipóteses iniciais de descoberta sobre vias de resposta ao dano no DNA e para gerar confiança preditiva na validação de alvos. A abordagem sustenta a continuidade translacional ao permitir estudos mecanicistas em contextos celulares relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a observação direta da recrutação de proteínas e da dinâmica de interação em locais de dano ao DNA em células vivas.
- Apóia a validação funcional de alvos de reparo do DNA mediante a quantificação da cinética e do envolvimento da via.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao distinguir respostas dependentes do ciclo celular utilizando o sistema Fucci.
- Fornece evidências de seletividade da via e do engajamento do alvo em modelos relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece sistemas validados de células vivas para avaliação quantitativa da cinética e interações de proteínas.
- Apóia a padronização de ensaios por meio da indução reprodutível de lesões no DNA com parâmetros definidos de laser.
- Permite triagem de alto conteúdo de moduladores que afetam a dinâmica de proteínas de reparo do DNA.
- Fornece resultados quantitativos por meio de FRAP, FLIM e FLIM-FRET para avaliação robusta de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas mecanicistas com fenótipos de reparo de DNA relevantes para doenças em células cancerígenas e normais.
- Apoia a descoberta de biomarcadores ao vincular a cinética de interação de proteínas aos resultados celulares após danos.
- Permite avanços ajustados ao risco, fornecendo dados preditivos sobre a modulação de vias de reparo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta metodologia integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes, apoiando tanto a verificação de hipóteses quanto o triagem quantitativo em sistemas de células vivas.
- Biologia da Descoberta: Fornece análise em tempo real do recrutamento e interação de proteínas em lesões no DNA para esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis da cinética e interações proteicas para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Utiliza FRAP, FLIM e FLIM-FRET para gerar dados cinéticos e de interação comparativos entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta o comportamento mecanicista das proteínas à fase do ciclo celular e aos resultados da reparação do DNA em modelos relevantes.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a diversos alvos de reparação do DNA e sistemas celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos de reparo do DNA e na desconvolução de vias.
- Valor Operacional: Padroniza a indução de danos no DNA em células vivas e os fluxos de trabalho de análise quantitativa de proteínas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao fornecer evidências mecanicistas de interação com o alvo e modulação da via.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e mecanismos de reparo do DNA para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas avançadas de microscopia confocal e de imagem em células vivas.
- Exige acesso a plataformas de microirradiação a laser e infraestrutura de imagem quantitativa.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de irradiação e dos protocolos de análise cinética.
- A adaptação entre diferentes tipos celulares pode exigir otimização das configurações do laser e dos marcadores do ciclo celular.
- A interpretação dos dados cinéticos e de interação deve considerar a fase do ciclo celular e o tipo de lesão no DNA.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cultivation of HeLa-derived Cell Lines
1:48
Cell Transfection
3:21
Induction of Local DNA Lesions and Confocal Microscopy
4:47
Fluorescence Lifetime Image Microscopy
6:24
FRET Efficiency Using the FLIM-FRET Script
7:48
FRAP Analysis
8:50
Results: Analysis of Recruitment of mCherry-tagged PCNA and -53BP1 at DNA Lesions in HeLa Cells
11:00
Conclusion
