Determinação de ácidos sialic em amostras de fígado e leite de tipo selvagem e

O objetivo geral desta metodologia é a detecção de ácido N-acetilneuramínico e ácido N-glicolilneuramínico no fígado e no leite de camundongos selvagens e com inativação do gene CMAH, utilizando análise por HPLC. Este método pode auxiliar na resposta a questões na área da glicosciência, especificamente sobre o efeito que os genótipos de modelos de camundongos CMAH têm sobre os teores reais de ácidos siálicos nesses animais. A principal vantagem dessa técnica em comparação com triagens genéticas é que os níveis relativos de ácidos siálicos também podem ser determinados em camundongos heterozigotos.

A avaliação deste método será realizada por Cui Cao e Wang Wenjiao, dois estudantes de pós-graduação do nosso laboratório. Inicie este procedimento com a coleta de leite murino e tecido hepático de camundongos com o gene CMAH inativado, conforme descrito no protocolo textual. Para isolar ácidos siálicos do leite, transfira 50 microlitros de leite para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e adicione 1,2 mililitros da solução aquosa de ácido acético preparada.

Para isolar ácidos siálicos de tecido hepático, descongele suavemente de 20 a 50 miligramas de fígado de camundongo e transfira-o para um homogeneizador de tecidos Dounce. Adicione 1,2 mililitro da solução aquosa de ácido acético e homogeneíze o tecido por cisalhamento suave durante 10 segundos. Transfira a suspensão resultante para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, incubar o leite acidificado ou suspensão tecidual por quatro horas a 80 graus Celsius. Depois, centrifugar a amostra a 14 mil vezes g por 10 minutos. Transferir os 1000 microlitros superiores do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente até completa secagem. Redissolva a amostra em 500 microlitros de água destilada. Em seguida, prepare uma coluna micro de troca aniônica transferindo 200 miligramas de resina de troca aniônica por amostra para tubos vazios de 3 mililitros com torneira acoplada.

Adicione 2 mililitros da solução aquosa de ácido acético para substituir os íons cloreto na resina por íons acetato. Feche a torneira assim que o solvente atingir o topo da resina. Adicione suavemente 2 mililitros de água destilada e abra a torneira.

Interrompa o fluxo assim que a maior parte do solvente atingir o topo da resina. Certifique-se de que a resina esteja sempre coberta com solvente. Em seguida, lave a coluna de resina mais duas vezes com dois mililitros de água destilada para remover o excesso de acetato.

Transfira os 500 microlitros resultantes do solvente da amostra para a coluna de resina e descarte o fluxo passante. Lave suavemente a resina com 2 mililitros de água destilada. Elua os ânions da amostra da resina utilizando 1 mililitro de uma solução de acetato de amônio 50 milimolar em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente até secagem completa. Pese entre 5 e 8 miligramas de ácido N-acetilneuramínico em uma balança analítica e transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Anote o peso exato e adicione 164 microlitros de água destilada para cada miligrama.

Obtenha o ácido N-glicoilneuramínico em quantidades menores a um preço moderado, como em alíquotas de 1 miligrama. Adicione 154 microlitros de água destilada diretamente ao composto para obter uma solução estoque de aproximadamente 20 milimolar de Neu5Gc. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Esta solução pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por até 12 meses. Combine 5 microlitros de cada solução estoque em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente até secagem completa.

Adicione 20 microlitros da solução de OPD às amostras de ácido siálico obtidas do leite de camundongo, fígado de camundongo ou ao padrão misto de ácidos siálicos. Vortexe a amostra vigorosamente por 30 segundos. Em seguida, incube as amostras por quatro horas a 80 graus Celsius no escuro.

Após deixar as amostras esfriarem por cinco minutos, adicione 80 microlitros de água destilada. Em seguida, centrifugue os tubos a 14 mil vezes g durante um minuto. Depois, transfira 80 microlitros do sobrenadante para um frasco de HPLC de alta recuperação de 300 microlitros.

As amostras de ácido siálico derivatizadas podem ser armazenadas entre quatro e seis graus Celsius por até uma semana. Analise as amostras utilizando um sistema padrão de HPLC conectado a um detector de fluorescência online. Utilize uma coluna de fase reversa C18 com 250 milímetros de comprimento e 4,6 milímetros de diâmetro para a análise.

Após preparar o solvente A e o solvente B e configurar a corrida de CLAE conforme detalhado no protocolo, injete 50 microlitros da amostra no sistema de CLAE. Monitore a eluição utilizando o comprimento de onda de excitação do detector de fluorescência de 373 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 448 nanômetros. Por fim, calcule a quantidade relativa de Neu5Gc conforme descrito no protocolo textual.

Mostram-se aqui cromatogramas representativos de ácidos siálicos marcados com fluorescência provenientes de amostras de leite, derivados de camundongos CMAH knock-out homozigotos e camundongos CMAH knock-out heterozigotos. Também são mostrados camundongos selvagens. Da mesma forma, são apresentados aqui os cromatogramas de ácidos siálicos marcados com fluorescência derivados do fígado de camundongo.

A comparação das quantidades relativas de Neu5Gc mostra que camundongos homozigotos com inativação do gene CMAH não contêm Neu5Gc, enquanto camundongos heterozigotos com inativação do CMAH e camundongos selvagens contêm entre 10 e 75% de Neu5Gc. Após dominar a técnica, as amostras podem ser preparadas em até oito horas, desde que o procedimento seja realizado corretamente. Além disso, as amostras podem ser analisadas por amostragem automática em HPLC durante a noite.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de efetuar o isolamento do ácido siálico e a etapa de derivatização no mesmo dia. Após o procedimento, outros métodos, como a análise por espectrometria de massas, podem ser realizados para confirmar a natureza dos sinais fluorescentes obtidos. O desenvolvimento desta técnica permite que os pesquisadores investiguem a distribuição do ácido siálico em amostras biológicas.

Não se esqueça de que trabalhar com ácido acético e ácido fórmico concentrados pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.