Triagem de Nanopartículas Bioativas em Células Imunes Fagocíticas para Inibidores da Sinalização de Receptores Toll-like

O objetivo geral deste procedimento de triagem é identificar novas nanopartículas bioativas que podem inibir a sinalização do receptor do tipo toll. Este método pode ajudá-lo a identificar fisicamente novos nanoinibidores direcionados à sinalização de receptores do tipo toll em células imunes inatas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, robusta e fácil de executar usando sistemas de células repórter.

As aplicações dessa técnica se estendem à terapia de muitas doenças inflamatórias porque a sinalização do receptor toll-like está envolvida na patogênese dessas doenças. Embora este método possa fornecer alta triagem em nanopartículas de ouro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de nanopartículas, bem como pequenas moléculas terapêuticas e biologias. Para iniciar este procedimento, prepare os meios de cultura conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, adicione 100 mililitros de água ultrapura sem endotoxinas a um frasco de vidro limpo de 125 mililitros. Adicione uma bolsa de pó de substrato de fosfatase alcalina embrionária secretada e agite a solução suavemente até que esteja totalmente dissolvida. Incubar a 37 graus Celsius durante uma hora para garantir a dissolução completa dos substratos.

Usando uma membrana de 0,2 micrômetro, filtre a solução. Armazene a quatro graus Celsius até a hora de usar. Em seguida, adicione uma bolsa de pó de substrato de luciferase a um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 25 mililitros de água ultrapura livre de endotoxinas.

Depois que o pó se dissolver completamente, armazene a quatro graus Celsius por até uma semana até a hora de usar. Em seguida, prepare as soluções-mãe de todos os outros reagentes, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de cultivar e preparar as células, transfira-as do frasco de cultura para um tubo de centrifugação.

Gire as células a 300 vezes G por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda-os no meio R-10 na concentração de 1 X 10 elevado a 6 células por mililitro. Adicionar alíquotas da solução de PMA à suspensão celular, de modo a que a concentração final seja de 50 nanogramas por mililitro.

Despeje a suspensão celular em um reservatório de reagente estéril. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros da suspensão celular para cada poço de uma placa de cultura de fundo plano de 96 poços. Incubar em uma incubadora de cultura de células por 24 horas a 37 graus Celsius.

Depois disso, use um aspirador a vácuo para remover cuidadosamente o meio de cultura. Usando um microscópio invertido, verifique as células para garantir que os macrófagos derivados estejam aderidos no fundo do poço. Lave suavemente as células duas vezes usando 100 microlitros de PBS por poço para cada lavagem.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio R-10 fresco a cada poço. Deixe as células descansarem por dois dias em uma incubadora a 37 graus Celsius antes de realizar o ensaio repórter. Primeiro, determine a dose ideal de LPS conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, adicione 180 microlitros de solução Quanti-Blue pré-aquecida a cada poço de uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, transfira 20 microlitros de sobrenadante de cada amostra para a placa. Incube a 37 graus Celsius por uma a duas horas para permitir que a cor se desenvolva de rosa a azul escuro.

Depois que a densidade óptica estiver acima de um, use um leitor de placas para determinar a absorção em 655 nanômetros. Para iniciar a análise da ativação do IRF, transfira 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada amostra para uma nova placa branca de fundo plano transparente de 96 poços. Usando a autoinjeção, adicione 50 microlitros da solução de luciferase a cada poço.

Em seguida, colete imediatamente a luminescência poço por poço para produzir uma curva de resposta à dose para determinar a concentração ideal de LPS para triagem de nanopartículas. Em seguida, centrifugue 20 volumes da solução híbrida peptídeo-GMP em tubos Eppendorf de 1,5 mililitro a 18.000 vezes G por 30 minutos. Descarte cuidadosamente os sobrenadantes.

Transfira os híbridos para um único tubo fresco e lave-os duas vezes com um mililitro de PBS. Depois disso, ressuspenda os híbridos lavados em um volume de meio R-10. Misturar volumes iguais dos híbridos concentrados e do LPS contendo meio R-10 de modo a que a concentração final dos híbridos e do LPS seja, respectivamente, de 100 nanomolares e 10 nanogramas por mililitro.

Em seguida, remova o meio de cultura da placa de cultura de macrófagos. Adicione 100 microlitros da mistura híbrida de LPS em cada poço, com três repetições para cada condição. Inclua um controle negativo e um controle LPS.

Incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, transfira o meio de cada poço para um tubo de centrífuga separado. Centrifugue os tubos a 18.000 vezes G e quatro graus Celsius por 30 minutos.

Transfira os sobrenadantes para uma nova placa inferior redonda de 96 poços. Para iniciar o ensaio repórter nessas amostras, adicione 180 microlitros de solução Quanti-Blue pré-aquecida a cada poço de uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, transfira 20 microlitros dos sobrenadantes de cada amostra para esta placa.

Incube a 37 graus Celsius por uma a duas horas até que a cor azul escura se desenvolva para uma densidade óptica acima de um. Depois disso, use um leitor de placas para registrar a absorção em 655 nanômetros. Em seguida, transfira 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada amostra para uma placa branca de fundo plano transparente de 96 poços.

Usando um injetor automático, adicione 50 microlitros da solução de luciferase a cada poço e registre imediatamente a luminescência poço por poço. Em seguida, valide o efeito inibitório dos candidatos potenciais e avalie a especificidade do TLR conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a ativação de NF-Kappa B AP1 é detectada pelo ensaio colorimétrico SEAP, no qual a ativação de TLR-4 por LPS resulta na ativação de NF-Kappa B AP1 e na produção de SEAP.

O SEAP liberado converte o substrato, levando a uma mudança de cor proporcional à quantidade de SEAP liberada após a estimulação. Isso é quantificado medindo a absorbância em 655 nanômetros. Em seguida, a ativação mediada por LPS de IRF levou à expressão de luciferase, catalisando o substrato para produzir luminescência.

Uma concentração ideal de LPS de 10 nanogramas por mililitro é determinada a partir dessas respostas de dose para rastrear uma biblioteca previamente estabelecida de híbridos peptídeo-GMP. A partir disso, um grupo de híbridos é identificado por sua potente capacidade de inibir a ativação desencadeada por LPS para NF-Kappa B AP1 e IRF. A validação dessa atividade inibitória mostra que, à medida que a concentração de LPS aumenta, os efeitos inibitórios do híbrido diminuem, conforme esperado.

O immunoblotting é então realizado para confirmar a atividade de inibição. O híbrido principal reduz a fosforilação do p65, inibe a degradação do I-Kappa B alfa e retarda a fosforilação do IRF3, confirmando que o híbrido principal, P12, é capaz de inibir a sinalização TLR-4 mediadora de LPS. Investigações adicionais revelam que o P12 também reduz a sinalização NF-Kappa B AP1 mediada por TLR-2 e TLR-5, bem como a ativação de IRF mediada por TLR-3, sugerindo que o P12 tem atividade inibitória potente em várias vias de TLR.

Após este procedimento, outras medidas como immunoblotting e o ensaio de citotoxicidade devem ser realizadas para validar os resultados da triagem e evitar a descoberta de falsos positivos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores no campo da nanomedicina explorassem nanoinibidores na sinalização de receptores toll-like como terapêutica informativa e de última geração.