Name: Triagem de Nanopartículas Bioativas em Células Imunes Fagocíticas para Inibidores da Sinalização de Receptores Toll-like (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a triagem de nanopartículas bioativas em células THP-1 para inibir a sinalização de receptores Toll-like. Este método rápido e robusto utiliza sistemas de células repórter para identificar nanoinibidores com potencial terapêutico em doenças inflamatórias.

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Os autores gostariam de reconhecer o apoio do Programa para Professor de Nomeação Especial (Eastern Scholar) nas Instituições de Aprendizagem Superior de Shanghai (HY), o fundo de partida do Hospital das Primeiras Pessoas de Xangai (HY), o apoio da Grant Gaudeng Clinical Medicine Grant de Shanghai Jiaotong Faculdade de Medicina da Universidade (HY) e o financiamento da Fundação Crohn e Colite do Canadá (CCFC) (SET e HY).

1. Preparação de meios de cultura celular e reagentes <ol><li> Prepare o meio de cultura celular R10 completo adicionando os suplementos de 10% de soro bovino fetal (FBS), L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1 mM no meio RPMI-1640. <ol><li> Prepare o meio de cultura de seleção R10-Z adicionando os antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para manter a expressão de SEAP sob o controle de NF-κ B / AP-1 ativação. Para selecionar células que expressam os genes repórter SEAP e luciferase, adicione Zeocin (100 μg / mL) e blasticidina (10 μg / mL) a R10 (como R10-ZB). </li></ol></li><li> Prepare a solução de substrato SEAP dissolvendo uma bolsa do substrato em pó (por exemplo , QUANTI-Blue) em 100 mL de água livre de endotoxina ultrapura em um balão de vidro limpo de 125 mL. <ol><li> Reduzir a solução suavemente e incubar a 37 ° C durante 1 h para garantir a dissolução completa dos substratos. </li> &lt;Li&gt; Filtra a solução usando uma membrana de 0,2 μm para garantir a sua esterilidade (opcional) e armazená-la a 4 ° C até 2 semanas antes da utilização. </li></ol></li><li> Prepare a solução de substrato de luciferase dissolvendo uma bolsa do pó de substrato ( p . Ex. , QUANTI-Luc) em 25 mL de água livre de endotoxina ultrapura em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL. <ol><li> Depois de dissolver completamente o pó, use a solução imediatamente. Alternativamente, armazene a solução a 4 ° C (até uma semana) ou a -20 ° C (até um mês) antes da utilização. CUIDADO: Ambas as soluções de substrato são sensíveis à luz e devem evitar a exposição à luz sempre que possível. Vários ciclos de congelamento-descongelamento da solução podem causar instabilidade do substrato e encurtar sua vida útil. </li></ol></li><li> Prepare a solução-mãe de 13-acetato de 12-miristato de pébolo (PMA) em sulfóxido de dimetilo de grau molecular (DMSO) para ter uma concentração de 500 μg / mL. Faça alíquotas da solução-mãe (10 μL em um tubo de 500 μL) e armazená-los a -20 ° C. </li><li> Prepare a solução de reserva de LPS (E-coli K12) em água estéril e isenta de endotoxina com uma concentração de 5 mg / mL e faça alíquotas para armazenamento a longo prazo a -20 ° C. Prepare uma solução de LPS em funcionamento, diluindo o LPS de reserva em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 100 μg / mL e guarde a -20 ° C antes da utilização. CUIDADO: A preparação de reagente para uso em cultura deve ser realizada em um gabinete de biossegurança e todos os recipientes devem ser esterilizados antes da utilização. Devem ser evitados os ciclos repetidos de congelamento-descongelamento das soluções PMA e LPS. </li></ol> 2. Cultura de macrófagos derivados de células de repórter de THP-1 <ol><li> Use duas linhas celulares repórter THP-1: células THP-1-XBlue e THP-1-Dual. O primeiro possui um gene repórter SEAP controlado por NF-κB / AP-1 e este possui um sistema de repórter duplo, o mesmo gene repórter SEAP e um gene de luciferase controlado por IRF. oOs procedimentos de cultura são idênticos, exceto os meios de cultura de seleção. <ol><li> Descongelar um estoque de células de trabalho (~ 5 x 10 6 células) em 10 mL de meio R10, centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Ressuspender células em 10 mL de meio R10 e transferi-las para um balão de cultura T75. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias até que as células atinjam uma densidade de 1 x 10 6 células / mL. </li><li> Quando o crescimento celular atinge sua capacidade, células de passagem para reduzir a densidade celular na faixa de 2-5 x 10 5 células / mL, para que as células possam continuar a crescer. </li><li> Após pelo menos 1 passagem, comece a cultivar as células no meio de cultura de seleção: R10-Z para THP-1-XBlue e R10-ZB para THP-1-Dual. Depois de cultivar as células com meio de cultura de seleção para pelo menos 1 passagem, as células estão prontas para a experiência. CUIDADO: o crescimento excessivo das células pode levar à morte celular significativa; A viabilidade celular deve manter&gt; 98%. Mantenha um registro do número da passagem como o celPode comportar-se de forma diferente após várias passagens (&gt; 20 passagens). NOTA: Os frascos de cultura celular podem ser reutilizados várias vezes para economizar custos; No entanto, esta prática pode aumentar o risco de contaminação geral e contaminação cruzada entre frascos diferentes (se manipula diferentes linhas celulares ao mesmo tempo). Durante a troca de mídia e a passagem da célula, a centrifugação é ajustada em 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> Para realizar o ensaio de células repórter, as células de sementes em uma placa de cultura de células de fundo plano de 96 poços e diferenciá-las em macrófagos. Os procedimentos são descritos a seguir. <ol><li> Transferir as células do balão para um tubo de centrífuga, centrifugar as células a 300 xg durante 5 min e ressuspendê-las no meio R10 a uma concentração de 1 x 10 6 células / mL. Adicione alíquotas da solução de PMA nas suspensões celulares com uma concentração final de 50 ng / mL. </li><li> Transfira 100 μL das suspensões celulares em cada poço dos 96-nósAplique usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa a 37 ° C (numa incubadora de cultura de células) durante 24 h. </li><li> Após a incubação, remova cuidadosamente o meio de cultura usando um aspirador de vácuo (ou com uma pipeta multicanal) e lave suavemente as células com PBS (100 μL / poço) duas vezes; Adicione 100 μL de meio R10 fresco em cada poço. Descanse as células por 2 dias em uma incubadora antes de realizar o ensaio repórter. CUIDADO: O passo de repouso é muito importante para permitir que as células se acalmem após a estimulação de PMA em seu estado de silêncio normal. Isso pode reduzir significativamente os sinais de fundo dos genes repórter em condições não estimadas. NOTA: Após 24 estimulações com PMA, as células são diferenciadas em fenótipo tipo macrófago, com uma característica de adesão celular no fundo do poço e uma característica morfológica de pseudopoda. </li></ol></li></ol> 3. Triagem para Nano-inibidores TLR4 potenciais usando as células Reporter </P&gt; NOTA: Uma vez que a sinalização TLR4 utiliza caminhos dependentes de MyD88 e dependentes de TRIF, ele é selecionado como o alvo principal para abranger uma ampla gama de caminhos de sinalização TLR. As células repórter de THP-1-XBlue são usadas para examinar principalmente a ativação NF-κB / AP-1 enquanto as células THP-1-Dual são para ativação de IRF a partir da transdução de sinal dependente de TRIF. <ol><li> Identifique a dose ideal de LPS gerando uma curva dose-resposta antes da triagem. <ol><li> Diluir a solução LPS em funcionamento para uma concentração final de 0,01 a 100 ng / mL em meio R10 (fazer a diluição na escala log10). Layout do desenho da placa e faça a diluição em uma placa de cultura de 96 poços de fundo redondo. Certifique-se de que cada poço tenha um mínimo de 110 μL de solução após a diluição. </li><li> Remova cuidadosamente o meio de cultura da placa sem semente celular (a partir de 2.2.3) usando um aspirador de vácuo. </li><li> Transferir o meio R10 contendo LPS preparado na placa de diluição (3.1.1) iNa placa de cultura de acordo com o layout das amostras. Incubar a placa a 37 ° C (numa incubadora de cultura de células) durante 24 h. </li><li> Às 24 h, transfira cuidadosamente os sobrenadantes (80 μL / poço) para uma nova placa de fundo redondo de 96 poços. Realize o ensaio de luminescência colorimétrica e / ou luciferase nestas soluções imediatamente ou guarde-as a 4 ° C (várias horas) ou -20 ° C (dias) antes do desenvolvimento do ensaio. NOTA: O design do layout da placa deve ser simples e claro para experiências e análise de dados. Para cada condição, 2-4 repetições devem ser consideradas. Sempre inclua um grupo de controle negativo (LPS nulo). Recomenda-se a utilização de células THP-1-XBlue para a ativação NF-κB / AP-1, uma vez que as células duplas têm um fundo relativamente alto de NF-κ B / AP-1 ativação após serem diferenciadas em macrófagos. No entanto, é viável usar as células duplas para relatar a ativação NF-κB / AP-1 e IRF. </li></ol></li><li> Desenvolva a corEnsaio imetrico para a ativação de NF-κB / AP-1 e o ensaio de luminescência de luciferase para ativação de IRF. <ol><li> Para avaliar a ativação NF-κB / AP-1, transfira 20 μL de sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de cultura de 96 poços de fundo plano; E adicione 180 μL de solução pré-aquecida de substrato SEAP em cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 - 2 h para permitir o desenvolvimento da cor (rosa a azul escuro). Recolher a absorção a 655 nm em um leitor de placas. CUIDADO: O tempo de incubação pode ser variado com base no desenvolvimento da cor (30 minutos até a incubação durante a noite). Recomenda-se que aguarde até que a densidade óptica (OD) da cor mais escura chegue acima de 1, evitando a saturação do desenvolvimento de cor (OD&gt; 3). </li><li> Para a análise da ativação de IRF, transfira 10 μL de sobrenadante de cada amostra para dentro de uma placa branca de fundo transparente de 96 poços. Adicione a solução de luciferase (50 μL) e colete imediatamente a luminescência wEllo pelo poço. NOTA: Recomenda-se o uso de um leitor de placas de luminescência com uma função de auto-injeção para garantir a consistência na leitura da luminescência do poço ao poço e da placa à placa. Se as soluções de substrato forem injetadas manualmente, assegure-se de um tempo consistente de incubação e configuração de leitura para cada poço. </li></ol></li><li> Conduza o ensaio de rastreio em vários híbridos peptídicos-GNP com estimulação LPS de 10 ng / mL (com base em 3.1). Siga o mesmo procedimento em 3.2 para o desenvolvimento do ensaio repórter. <ol><li> Concentre os híbridos peptídicos-PNP a 200 nM em meio R10 usando o método de centrifugação. Centrifugar 20 volumes da solução híbrida (10 nM) a 18.000 xg durante 30 min, e descartar cuidadosamente os sobrenadantes. Recolher os híbridos (na parte inferior do tubo) em um tubo, lavá-los com PBS duas vezes e re-suspender os híbridos em um volume do meio R10. </li><li> Misture volumes iguais dos híbridos concentrados eLPS (20 ng / mL) contendo meio R10 para ter uma concentração final dos híbridos e LPS para ser 100 nM e 10 ng / mL, respectivamente. </li><li> Remova o meio de cultura da placa cultivada (2.2.3) e adicione 100 μL da solução mista em cada poço (3 repetições para cada condição); Incluem um controle negativo (somente no meio) e um controle de LPS (LPS de 10 ng / mL sem híbridos). </li><li> Após 24 h de incubação a 37 ° C, transfira o meio de cada poço para dentro de um tubo e centrifugue os tubos a 18.000 xg, 4 ° C durante 30 min. Recolher os sobrenadantes (50-80 μL / tubo) para uma placa de fundo redondo de 96 poços e realizar o ensaio repórter como descrito em 3.2. CUIDADO: Ao descartar os sobrenadantes após a centrifugação, não agite os híbridos na parte inferior do tubo. NOTA: A centrifugação no passo 3.3.4 é muito importante para remover os híbridos de nanopartículas não internalizadas do meio de cultura e pode evitar a interferência dos híbridos com o coLeituras lorimétricas / luminescentes. Isso ocorre porque as nanopartículas de ouro podem absorver amplos comprimentos de onda de luz, dependendo do tamanho e da aglomeração. </li></ol></li></ol> 4. Validando o efeito inibitório dos candidatos potenciais NOTA: Para confirmar o efeito inibitório dos potenciais candidatos a partir da triagem, são utilizadas duas abordagens. Uma é examinar as respostas de dose dos estimulantes (LPS) a uma concentração híbrida fixa (ou ao contrário); O outro é observar diretamente a inibição nos sinais NF-κB / AP-1 e IRF3 via imunotransferência. <ol><li> Na aproximação um, execute o ensaio repórter com 100 nM dos híbridos de chumbo e duas concentrações de LPS a 1 ng / mL e 10 ng / mL seguindo os mesmos procedimentos descritos em 3.3. Inclua um híbrido inativo (com base nos resultados de triagem) como um controle híbrido para comparação. </li><li> Para a abordagem de imunotransferência, siga o padrão eProcedimentos experimentais. <ol><li> Cicatrizar células THP-1 em meio R10, semear as células em uma placa de cultura de 12 poços (2 x 10 6 células / poço), e diferenciá-las em macrófagos, tratando as células com 50 μg / mL de PMA por 24 horas, seguidas de repouso por 2 dias. </li><li> Após a diferenciação celular, estimule células com LPS de 10 ng / mL com / sem híbridos (100 nM) ao longo do tempo (até 4 h). Em vários pontos de tempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 min), prepare os lisados ​​celulares para imunotransferência. Inclua um híbrido inativo como controle. </li><li> Sonda os sinais de IκBα, p65 fosforilado e IRF3 fosforilado para examinar o efeito inibitório dos híbridos de chumbo na ativação de NF-κB e IRF3. Sonda os sinais de β-actina e IRF3 totais como controles internos. NOTA: A transdução do sinal geralmente ocorre muito mais rápido (em algumas horas), em seguida, a expressão das enzimas repórter SEAP e luciferase (24 h). É altamente recomendável também realizarEnsaio de viabilidade dos híbridos testados às 24 h como outro método de validação. </li></ol></li></ol> 5. Avaliando a especificidade TLR NOTA: Para investigar a especificidade TLR do péptido principal-GNP híbrido, outras vias de sinalização TLR são testadas, incluindo TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 são excluídos porque os macrófagos derivados de THP-1 não respondem bem à estimulação desses TLRs devido à falta de expressão de TLR7, 8 e 9 em macrófagos 34 . <ol><li> Teste várias concentrações (1 ng / mL a 25 μg / mL) dos ligandos específicos para TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) e TLR5 (flagelina) em ambos os macrófagos derivados de células repórter para obter a concentração ideal seguindo o mesmo Procedimento em 3.1 e 3.2. </li><li> Tratar as células com as misturas do híbrido chumbo (100 nM) e cada ligando de TLR na concentração obtida de 5,1 para avaliar a especificidade inibitória do chumbo hDe acordo com o procedimento experimental descrito em 3.3. Inclua o híbrido inativo como controle de comparação. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma vez que os TLRs estão envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias, eles emergiram como alvos terapêuticos para a modulação de respostas imunes e condições inflamatórias. No entanto, o desenvolvimento clínico de terapêuticas para inibir as vias de sinalização TLR teve sucesso limitado até à data. O fármaco antipalúdico hidroxicloroquina que inibe TLR7 e TLR9 está em uso clínico 35 , 36 . Da mesma forma, apenas um número limitado de compostos evol...

Os receptores Toll-like (TLRs) são um dos elementos-chave no sistema imune inato que contribuem para a primeira linha de defesa contra infecções. Os TLRs são responsáveis ​​por detectar invasores patógenos, reconhecendo um repertório de padrões moleculares associados a patógenos (ou PAMPs) e a montagem de reações de defesa através de uma cascata de transdução de sinal 1 , 2 . Existem 10 TLR humanos identificados; Exceto TLR10 para o qual o (s) ligando (s) permanecem obscuros, cada TLR pode reconhecer um grupo distinto e conservado de PAMPs. Por exemplo, TLR2 e TLR4, localizados principalmente na superfície celular, podem detectar lipoproteínas e glicolípidos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente; Enquanto TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, principalmente presentes nos compartimentos endossômicos, podem detectar produtos de ARN e DNA de vírus e bactérias 3 . Quando estimulados por PAMPs, os TLRs desencadeiam respostas imunes essenciais ao libertar pro-infMediadores lacônicos, recrutando e ativando células imunes efectoras e coordenando eventos imunes adaptativos subseqüentes 4 . A transdução de sinalização TLR pode ser simplesmente categorizada em duas vias principais 5 , 6 . Um é dependente do fator de diferenciação mielóide da proteína adaptadora 88 (MyD88) - a via dependente de MyD88. Todos os TLRs, com exceção do TLR3, utilizam esta via para ativar o fator nuclear kappa-cadeia leve-intensificador de células B ativadas (NF-kB) e proteína quinases associadas a mitógenos (MAPKs), levando à expressão de mediadores pró-inflamatórios, como TNF- Α, IL-6 e IL-8. A segunda via utiliza o interferão-β indutor de adaptador contendo TIR (TRIF) - o caminho dependente de TRIF ou independente de MyD88 - para ativar fatores reguladores de interferão (IFN) e NF-κ B, resultando na produção de IFN tipo I. Sinalização TLR intactaÉ fundamental para a nossa proteção diária contra infecções microbianas e virais; Defeitos nas vias de sinalização TLR podem levar à imunodeficiência e muitas vezes prejudicam a saúde humana. 7 No entanto, a sinalização TLR é uma &quot;espada de dois gumes&quot; e a ativação excessiva e descontrolada do TLR é prejudicial. As respostas TLR hiperativas contribuem para a patogênese em muitas doenças inflamatórias humanas agudas e crônicas 8 , 9 . Por exemplo, a sepsis caracterizada por inflamação sistêmica e lesão multiorgânica é principalmente devido a respostas imunes agudas e esmagadoras em relação a infecções, com TLR2 e TLR4 desempenhando um papel crucial na fisiopatologia da sepse 10 , 11 , 12 . Além disso, TLR5 foi encontrado para contribuir para a inflamação pulmonar crônica de pacientes com fibrose cística 13, 14 . Além disso, a sinalização TLR endossomal desregulada (por exemplo, TLR7 e TLR9) está fortemente associada ao desenvolvimento e progressão de várias doenças auto-imunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) e artrite reumatóide (RA) 15 , 16 . Essas linhas convergentes de evidência identificam a sinalização TLR como um potencial alvo terapêutico para muitas doenças inflamatórias 17 . Embora a regulação farmacológica das respostas de TLR seja antecipada a ser benéfica em muitas condições inflamatórias, infelizmente, atualmente existem poucos compostos clinicamente disponíveis para inibir a sinalização TLR 9 , 17 , 18 . Isto é em parte devido à complexidade e redundância das vias TLR envolvidas na homeostase imune e na patologia da doença. Portanto, procurando por romance, PotenT agentes terapêuticos para direcionar múltiplas vias de sinalização de TLR podem preencher um fosso fundamental e superar o desafio de avançar os inibidores de TLR na clínica. À luz dos rápidos avanços em nanociências e nanotecnologias, os nanodispositivos estão emergindo como os moduladores de TLR de próxima geração devido às suas propriedades únicas 19 , 20 , 23 . O tamanho da nanoescala permite que estes nano-terapêuticos tenham melhor distribuição biológica e circulação sustentada 24 , 25 , 26 . Eles podem ser ainda funcionalizados para atender aos perfis farmacodinâmicos e farmacocinéticos desejados 27 , 28 , 29 . Mais emocionante, a bio-atividade desses novos nanodispositivos surge de suas propriedades intrínsecas, que podem ser adaptadas paraAplicações médicas específicas, em vez de simplesmente atuar como um veículo de entrega para um agente terapêutico. Por exemplo, uma nanopartícula parecida com a lipoproteína de alta densidade (HDL) foi projetada para inibir a sinalização TLR4, eliminando o ligando TLR4 LPS 23 . Além disso, desenvolvemos um sistema híbrido de nanopartículas de péptido-ouro, onde os péptidos decorados podem alterar as propriedades superficiais das nanopartículas de ouro e permitir-lhes ter várias atividades biológicas 30 , 31 , 32 , 33 . Isso os torna uma classe especial de drogas (ou &quot;nano-drogas&quot;) como a nova geração de nano-terapêutica. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para identificar uma nova classe de híbridos de nanopartículas de péptido-ouro (péptido-PNP) que podem inibir potentemente múltiplas vias de sinalização de TLR em células imunes fagocíticas 32 , </suP&gt; 33 . A abordagem é baseada em linhas celulares repórter THP-1 comercialmente disponíveis. As células repórter consistem em duas construções repórter estáveis ​​e induzíveis: uma carrega um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP) sob o controlo de um promotor induzível pelos factores de transcrição NF-κB e proteína activadora 1 (AP-1); O outro contém um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores indutíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Após a estimulação de TLR, a transdução de sinal leva à ativação de NF-κB / AP-1 e / ou IRFs, que liga os genes repórter ao SEAP secreto e / ou à luciferase; Tais eventos podem ser facilmente detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes com um espectrofotômetro ou um luminômetro. Usando essa abordagem para pesquisar nossa biblioteca previamente estabelecida de híbridos peptídicos-PNP, identificamos candidatos líderes que podem inibir potentemente as vias de sinalização TLR4. A atividade inibitória do péptido principal -Os híbridos PNP foram então validados usando outra abordagem bioquímica de imunotransferência e avaliados em outras vias TLR. Esta abordagem permite o rastreio rápido e eficaz de novos agentes que visam as vias de sinalização TLR.

<table><tbody><tr><td>THP-1-XBlue repórter célula</td><td>InvivoGen</td><td>thpx-sp</td><td>mantém a passagem de cultura de células abaixo de 20</td></tr><tr><td>THP-1-Dual repoter</td><td>cell invivoGen</td><td>thpd-nfis</td><td>mantém a passagem de cultura de células abaixo de 20</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sem L-glutamina)</td> <td>GE Health Care</td><td>SH30096.02</td><td>Aqueça até 37 &deg; C antes do uso; adicionar suplementos para fazer um meio completo R10</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (qualificado)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td>Inativado por calor; 10% em RPMI-1640</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>2 mM no meio completo R10</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>1 mM no meio completo R10</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, 1X, sem cálcio, magnésio</td><td>GE Health Care</td><td>SH30028.02</td><td>Uso para lavagem de células e preparação de reagentes</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td>Substrato SEAP</td></tr><tr><td>QUANTI-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qlc2</td><td>Substrato de luciferase</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td>Antibióticos de seleção para células</td></tr> <tr>repórter<td>Blasticidina</td><td>InvivoGen</td><td>anti-bl-1</td><td>Antibióticos de seleção para células repórter</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO) para biologia molecular</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Uso para preparação de reagentes</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para biologia molecular</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Uso para diferenciação celular</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td>TLR4 ligante</td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pms</td><td>TLR2/1 ligante</td></tr><tr><td>Poly (I:C) HMW</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pic</td><td>TLR3 ligante</td></tr><tr><td>Flagelina de S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapuro</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-epstfla</td><td>TLR5 ligante</td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384 leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Leia o ensaio colorimétrico</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multimodo Infinite M200 Pro com injectores</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Ler luminosidade</td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Micro-centrifugador com temperatura controlada (até 18.000 g)</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X-15R Beckman</td><td>Coulter</td><td>N/A</td><td>Centrifugador de uso geral com temperatura controlada (para uso em cultura de células)</td></tr><tr><td>Placa de ensaio Costar, branco de 96 poços com fundo plano transparente, cultura de tecido tratada</td><td>Corning Costar</td><td>3903</td><td>Usado para ensaio de luminescência</td></tr></tbody></table>

screening nanopartículas bioativas em células imunológicas fagocíticas para inibidores da sinalização do receptor de toll-like

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

A regulação farmacológica das respostas do receptor Toll-like (TLR) é de grande promessa no tratamento de muitas doenças inflamatórias. No entanto, tem havido compostos limitados disponíveis até agora para atenuar a sinalização de TLR e não houve nenhum inibidor de TLR clinicamente aprovado (exceto o medicamento antipalúdico hidroxicloroquina) em uso clínico. À luz dos avanços rápidos na nanotecnologia, a manipulação da capacidade de resposta imune usando nano-dispositivos pode fornecer uma nova estratégia para tratar essas doenças. Aqui, apresentamos um método de rastreio de alto rendimento para identificar rapidamente novas nanopartículas bioativas que inibem a sinalização TLR em células imunes fagocíticas. Esta plataforma de triagem é construída em células repórter baseadas em células THP-1 com ensaios colorimétricos e de luciferase. As células repórter são manipuladas a partir da linha celular monocítica THP-1 humana por integração estável de duas construções repórter induzíveis. Um deles expressa um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP)Sob o controle de um promotor induzível pelos fatores de transcrição NF-κB e AP-1 e o outro expressa um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores induzíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Na estimulação de TLR, as células repórter ativam Fatores de transcrição e subseqüentemente produz SEAP e / ou luciferase, que podem ser detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes. Usando uma biblioteca de nanopartículas de nanopartículas peptídicas-ouro (GNP) estabelecidas em nossos estudos anteriores como exemplo, identificamos um híbrido peptídico-GNP que poderia efetivamente inibir os dois braços da cascata de sinalização TLR4 desencadeada pelo seu ligando protótipo, lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados foram validados por técnicas bioquímicas padrão, incluindo imunotransferência. Uma análise posterior estabeleceu que esse híbrido principal tinha um amplo espectro inibitório, atuando em múltiplas vias TLR, incluindo TLR2, 3, 4 e 5. Esta abordagem experimental permite uma avaliação rápida deA nanopartícula (ou outros compostos terapêuticos) pode modular a sinalização TLR específica em células imunes fagocíticas.

A abordagem experimental global está ilustrada na Figura 1 . As duas linhas de células repórter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, são utilizadas para visualizar rapidamente as respostas TLR, avaliando a ativação de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. A ativação de NF-κB / AP-1 pode ser detectada pelo ensaio colorimétrico SEAP, enquanto que a ativação IRF é monitorada por luminescência de luciferase. As células monocíticas de THP-1 podem ser facilmente deriv...

A sinalização do receptor Toll-like (TLR) desempenha um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças inflamatórias humanas, e a regulação das respostas de TLR por nanopartículas bioativas é antecipada para ser benéfica em muitas condições inflamatórias. As células repórter baseadas em células THP-1 fornecem uma plataforma de triagem versátil e robusta para identificar novos inibidores da sinalização TLR.

Screening Nanopartículas Bioativas em Células Imunológicas Fagocíticas para Inibidores da Sinalização do Receptor de Toll-like

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

O objetivo geral deste procedimento de triagem é identificar novas nanopartículas bioativas capazes de inibir a sinalização do receptor tipo toll. Este método pode ajudá-lo a identificar fisicamente novos nanoinibidores que visam a sinalização do receptor tipo toll em células imunes inatas. A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida, robusta e fácil de realizar utilizando sistemas de células repórter.As aplicações desta técnica estendem-se à terapia de diversas doenças inflamatórias, pois a sinalização dos receptores tipo toll demonstrou estar envolvida na patogênese dessas doenças. Embora este método possa proporcionar alta triagem em nanopartículas de ouro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de nanopartículas, bem como a moléculas terapêuticas de pequeno porte e biológicos. Para iniciar este procedimento, prepare os meios de cultura conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, adicione 100 mililitros de água ultrapura livre de endotoxinas a um frasco de vidro limpo de 125 mililitros. Adicione uma bolsa de pó do substrato de fosfatase alcalina secretada embrionária e gire suavemente a solução até que esteja completamente dissolvida. Incube a 37 graus C

screening-bioactive-nanoparticles-phagocytic-immune-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O ensaio sialidase é uma abordagem simples técnica que irá elucidar mecanismo molecular romance (s) de sensores de TLR de infecções microbianas e envolvimento em doenças inflamatórias ao nível do receptor na superfície celular de macrófagos ao vivo.

Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Pegue culturas de células semelhantes a micróglias derivadas de monócitos humanos.Introduzir nanopartículas contendo um medicamento anti-inflamatório na cultura experimental e o medicamento livre no controle.As nanopartículas apresentam um invólucro hidrofílico e um núcleo hidrofóbico encapsulando a droga lipofílica.As células endocitam as nanopartículas, que liberam o fármaco por via intracelular, aumentando sua entrega.O fármaco livre entra por difusão passiva, processo limitado pelo...

Entrega aprimorada mediada por nanopartículas de um medicamento anti-inflamatório em células semelhantes à microglia

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em células repórter para triagem de nanopartículas bioativas potenciais que inibem a sinalização do receptor do tipo Toll (TLR). O ensaio envolve a introdução de lipopolissacarídeos (LPS) misturados com híbridos de nanopartículas peptídeo-ouro para macrófagos repórteres que expressam as proteínas repórter - fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) e luciferase. A redução do sinal TLR induzido por LPS mediado pelos híbridos é determinada pela medição...

Um ensaio para rastrear nanopartículas bioativas para inibição de sinalização de receptores do tipo Toll

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Um ensaio celular do repórter do macrófago para examinar a sinalização nf-kB/AP-1 mediada pelo receptor em macrófagos em camadas de proteína adsorbed em superfícies poliméricas

Este protocolo descreve um método de imagem celular viva com lapso de tempo para visualizar a fagocitose de células de câncer de mama triplo negativo marcadas com proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico, utilizando um microscópio automatizado.

Imagiologia de Time-Lapse da Fagocitose de Células de Cancro da Mama Triplo-Negativo Marcadas com Proteína Fluorescente Verde por Macrófagos Mediada por Anticorpos

Aprenda a triagem de nanopartículas bioativas em células THP-1 para inibir a sinalização de receptores Toll-like. Este método rápido e robusto utiliza sistemas de células repórter para identificar nanoinibidores com potencial terapêutico em doenças inflamatórias.

Screening Nanopartículas Bioativas em Células Imunológicas Fagocíticas para Inibidores da Sinalização do Receptor de Toll-like

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