Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.

O objetivo geral deste experimento é estudar e validar a interação complexo de proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo genômico funcional em um ambiente de laboratório regular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica funcional, como a genômica planejada. A principal vantagem dessa técnica é que ela detecta interações de DNA de proteínas envolvendo mais de uma proteína ou fator de transcrição.

Comece este procedimento na tarde do que será designado como o primeiro dia. Comece uma cultura de 5 mililitros em meio sintético definido ou SD sem uracila de uma placa de Petri recém-listrada. Incube durante a noite em um agitador de 30 graus Celsius.

Na tarde seguinte, inocular 10 mililitros de meio YPDA com 500 microlitros da cultura noturna e incubar durante a noite em um agitador a 30 graus Celsius. No início da manhã do dia seguinte, inocular 100 mililitros de meio YPDA com 2 mililitros da cultura noturna. Cultive esta cultura fresca a 30 graus Celsius até que a densidade óptica de 600 nanômetros atinja 0,4 a 0,8.

Centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de água estéril e reconstitua o pellet por vórtice.

Centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mililitros de acetato de lítio TE e reconstitua o pellet por vórtice. Centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante. Adicione 4 mililitros de acetato de lítio TE mais 400 microlitros de DNA de esperma de salmão e ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo. As células estão agora prontas para a transformação, conforme demonstrado no próximo segmento.

A cotransformação das células é realizada em uma placa de mistura de fundo em U de 96 poços. Primeiro, distribua 20 microlitros de células competentes por poço na placa de 96 poços. Em seguida, adicione aos poços, 150 nanogramas de cada um dos dois plasmídeos e o controle de normalização.

Este esquema mostra a placa geral configurada para a co-transformação das células de levedura com a proteína de interesse. A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões ou fragmentos de DNA testados. Adicione 100 microlitros de acetato de lítio TE polietilenoglicol por poço e misture três vezes por pipetagem.

Cubra a placa com uma vedação respirável e incube a 30 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Choque térmico a 42 graus Celsius por precisamente 20 minutos. Após o choque térmico, centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos.

Use uma pipeta multicanal para remover o sobrenadante. Adicione 110 microlitros de TE e misture. Centrifugue novamente por 5 minutos.

Remova 100 microlitros do sobrenadante de cada poço. Mergulhe um perfurador em 100% de etanol, queime-o, aguarde um minuto para que os pinos do perfurador esfriem e, em seguida, use o perfurador estéril para ressuspender o pellet. Transfira as células para o triptofano SD e as placas helicoidais de lucina.

Incube as placas a 30 graus Celsius por dois dias. Na tarde do quinto dia, recupere as placas helicoidais da incubadora. Encha cada poço da placa de mistura estéril de 96 poços com 50 microlitros de TE. Umedeça previamente um perfurador estéril em TE, perfure as colônias da placa de saída de triptofano e lucina SD e ressuspenda-as na placa preenchida com TE.

Transfira as colônias para novas placas de triptofano SD e gota de lucina, para uma cobertura ideal da superfície. Incube as placas a 30 graus Celsius por 2 dias. Na tarde do dia 7, retire as placas helicoidais da incubadora.

Encha cada poço de uma placa de mistura estéril de 96 poços com 50 microlitros de triptofano SD e meio de gota de lucina. Encha cada poço de um bloco de poço estéril de 96 de profundidade com 180 microlitros de triptofano SD e meio de gota de lucina. Esterilize o perfurador, pré-umedeça o perfurador e o meio e transfira as colônias da placa para os poços, cada um contendo 50 microlitros de meio.

Transfira 20 microlitros de levedura para os 180 microlitros de triptofano SD e meio de gota de lucina. Sele o bloco com uma vedação respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação por 36 horas. Na manhã do nono dia, transfira 100 microlitros de cultura para 500 microlitros de meio YPDA em um bloco esterilizado de 96 poços de profundidade.

Cubra com uma vedação respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm por três a cinco horas. Após três a cinco horas, ressuspender a cultura e transferir 125 microlitros de cada poço para uma placa de espectrofotômetro. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros para garantir que esteja entre 0,3 e 0,6.

Centrifugue as células restantes no bloco de poço profundo a 3000 vezes G e 21 graus Celsius por 10 minutos. Remover o sobrenadante invertendo. Adicione 200 microlitros de tampão Z a cada poço e vórtice.

Centrifugar a 3000 g e 21 graus Celsius durante cinco minutos. Remover o sobrenadante invertendo. Adicione 21 microlitros de tampão Z a cada poço e vórtice.

Cubra a placa com uma folha de vedação resistente aos ciclos de congelamento e descongelamento. Em uma capela de exaustão, execute 4 ciclos de congelamento/descongelamento usando nitrogênio líquido e um banho-maria de 42 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de solução ONPG de beta mercaptoetanol tampão Z recém-preparada a cada poço.

Incube a 30 graus Celsius por 17 a 24 horas ou até que a cor se desenvolva. Na manhã do dia 10, verifique se a cor se desenvolveu. Adicione 110 microlitros de carbonato de sódio molar a cada poço para interromper a reação.

Registre a hora e vortex a placa. Centrifugue a 3000 vezes G e 21 graus Celsius por dez minutos. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa de espectrofotômetro.

Meça a densidade óptica em 420 nanômetros. Calcular a actividade da beta-galactosidase numa folha de propagação, tal como descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a região promotora de 2600 pares de bases a montante do início do local de início da transcrição foi segmentada em seis regiões ou fragmentos.

Esta foto é um exemplo de uma placa bem crescida e positiva após o quinto dia do protocolo. Neste resultado representativo, os fragmentos de DNA um e quatro mostram interação positiva com o complexo de proteínas A e B. Após a medição da atividade da beta golactisidase, o fragmento um mostra a indução quádrupla da atividade do gene repórter.

É importante lembrar que este procedimento é recomendado para obter informações sobre regiões de DNA somente após a confirmação da interação proteína-proteína proposta e não foi projetado para fornecer informações de locais-alvo. Seguindo esses procedimentos, outros métodos, como ensaio de chip e Msar, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, identificar os locais de destino in vivo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar e validar o papel dos complexos de proteínas multiméricas que se ligam a um alvo comum de DNA.