Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas
24 de julho de 2017
O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.
O objetivo geral deste experimento é estudar e validar a interação entre complexos proteicos heteroméricos e DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo genômico funcional em um ambiente laboratorial comum. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de genômica funcional, como a genômica planejada. A principal vantagem desta técnica é que ela detecta interações entre proteínas e DNA que envolvem mais de uma proteína ou fator de transcrição.
Inicie este procedimento na tarde daquele que será designado como dia um. Inicie um cultivo de 5 mililitros em meio sintético definido ou meio SD sem uracil a partir de uma placa de Petri recentemente estriada. Incube durante a noite em um agitador a 30 graus Celsius.
No dia seguinte à tarde, inocular 10 mililitros de meio YPDA com 500 microlitros da cultura de crescimento noturno e incubar durante a noite em agitador a 30 graus Celsius. Pela manhã cedo do dia seguinte, inocular 100 mililitros de meio YPDA com 2 mililitros da cultura de crescimento noturno. Crescer esta cultura fresca a 30 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros alcance de 0,4 a 0,8.
Centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de água estéril e reconstitua o precipitado por vortexagem.
Centrifugue a 1000 × g e 21 °C por cinco minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mililitros de acetato de lítio TE e reconstitua o pellet por vortex. Centrifugue a 1000 × g e 21 °C por cinco minutos.
Descarte o sobrenadante. Adicione 4 mililitros de acetato de lítio TE mais 400 microlitros de DNA de esperma de salmão e re-suspenda o precipitado pipetando para cima e para baixo. As células estão agora prontas para transformação, conforme demonstrado no próximo segmento.
A co-transformação das células é realizada em uma placa de mistura de fundo redondo de 96 poços. Primeiro, distribua 20 microlitros de células competentes por poço na placa de 96 poços. Em seguida, adicione aos poços 150 nanogramas de cada um dos dois plasmídeos e do controle de normalização.
Este esquema mostra a configuração geral da placa para a co-transformação das células de levedura com a proteína de interesse. A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões ou fragmentos de DNA testados. Adicione 100 microlitros de acetato de lítio TE com polietilenoglicol por poço e misture três vezes por pipetagem.
Cubra a placa com um selo respirável e incube a 30 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Aplicar choque térmico a 42 graus Celsius por exatamente 20 minutos. Após o choque térmico, centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos.
Utilize uma pipeta multicanal para remover o sobrenadante. Adicione 110 microlitros de TE e misture. Centrifugue novamente por 5 minutos.
Remova 100 microlitros do sobrenadante de cada poço. Mergulhe um furador em etanol a 100%, queime-o, aguarde um minuto para que os pinos do furador esfriem e, em seguida, utilize o furador estéril para ressuspender o pellet. Transfira as células para placas de agar com meio de cultura SD sem triptofano e leucina.
Incube as placas a 30 graus Celsius por dois dias. Na tarde do quinto dia, retire as placas de auger do incubador. Adicione 50 microlitros de TE em cada poço da placa de mistura estéril de 96 poços com fundo em U. Umedeça previamente um punção estéril em TE, retire as colônias da placa de depleção de SD com triptofano e lucina e ressuspenda-as na placa contendo TE.
Transfira as colônias para novas placas de agar com meio SD sem triptofano e leucina, para cobertura superficial ideal. Incube as placas a 30 graus Celsius por 2 dias. Na tarde do dia 7, retire as placas de agar do incubador.
Cubra cada poço de uma placa estéril de mistura de 96 poços em formato u com 50 microlitros de meio SD sem triptofano e leucina. Preencha cada poço de um bloco estéril de 96 poços profundos com 180 microlitros de meio SD sem triptofano e leucina. Esterilize o furador, umedeca previamente o furador e o meio, e transfira colônias da placa para os poços que contêm 50 microlitros de meio cada.
Transfira 20 microlitros de levedura para os 180 microlitros de meio de eliminação de triptofano e leucina SD. Sobre o bloco, coloque uma tampa respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação por 36 horas. Na manhã do nono dia, transfira 100 microlitros de cultura para 500 microlitros de meio YPDA em um bloco esterilizado de 96 poços profundos.
Cubra com um selo respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm por três a cinco horas. Após três a cinco horas, ressuspenda o cultivo e transfira 125 microlitros de cada poço para uma placa de espectrofotômetro. Meça a densidade óptica a 600 nanômetros para garantir que esteja entre 0,3 e 0,6.
Centrifugue as células restantes no bloco de poços profundos a 3000 ×g e 21 °C por 10 minutos. Remova o sobrenadante invertendo o bloco. Adicione 200 µL de tampão Z a cada poço e vortexie.
Centrifugue a 3000 G e 21 graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante invertendo o tubo. Adicione 21 microlitros de tampão Z a cada poço e vortex.
Cubra a placa com folha adesiva resistente a ciclos de congelamento e descongelamento. Em uma cabine de segurança química, realize 4 ciclos de congelamento/descongelamento utilizando nitrogênio líquido e um banho-maria a 42 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de solução recém-preparada de tampão Z beta-mercaptoetanol ONPG a cada poço.
Incubar a 30 graus Celsius por 17 a 24 horas ou até o desenvolvimento da cor. Na manhã do dia 10, verifique se a cor se desenvolveu. Adicione 110 microlitros de carbonato de sódio um molar a cada poço para interromper a reação.
Registre o tempo e vortexe a placa. Centrifugue a 3000 vezes G e 21 graus Celsius por dez minutos. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa de espectrofotômetro.
Meça a densidade óptica a 420 nanômetros. Calcule a atividade da beta-galactosidase em uma planilha conforme descrito no protocolo do texto. Neste estudo, a região promotora de 2600 pares de bases upstream do início do sítio de início da transcrição foi segmentada em seis regiões ou fragmentos.
Esta foto é um exemplo de uma placa bem desenvolvida e positiva após o quinto dia do protocolo. Neste resultado representativo, os fragmentos de DNA um e quatro mostram interação positiva com o complexo das proteínas A e B. Após a medição da atividade de beta-galactosidase, o fragmento um mostra uma indução de quatro vezes da atividade do gene repórter.
É importante lembrar que este procedimento é recomendado para obter informações sobre regiões de DNA somente após a confirmação da interação proteína-proteína proposta e não foi projetado para fornecer informações sobre sítios alvo. Após este procedimento, outros métodos, como ensaio ChIP e MSAR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, identificar os sítios alvo in vivo.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar e validar o papel de complexos proteicos multiméricos que se ligam a um alvo de DNA comum.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio modificado de levedura um-híbrido para estudar e validar interações entre complexos proteicos heteroméricos e DNA em um sistema heterólogo. Este método é aplicável a diversos estudos de genômica funcional.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Genômica Funcional
- Interações Proteína-DNA
- Ensaios Híbridos em Levedura
Antecedentes
- O ensaio de híbrido único em levedura (Y1H) é um método clássico para estudar interações proteína-DNA.
- Esta versão modificada amplia o ensaio Y1H para analisar complexos proteicos heteroméricos.
- Compreender essas interações é fundamental para obter insights sobre a regulação gênica.
- A técnica é adaptável a diversos ambientes laboratoriais.
Objetivo do Estudo
- Validar interações entre complexos proteicos heteroméricos e DNA.
- Fornecer um método confiável para pesquisas em genômica funcional.
- Aprimorar a compreensão das interações entre fatores de transcrição.
Métodos Utilizados
- Inicie com um cultivo de 5 mililitros em meio definido sintético (SD) sem uracil.
- Incube o cultivo durante a noite a 30 graus Celsius em agitador.
- Utilize o ensaio modificado de hibridização em levedura para estudos de interação.
- Analise os resultados para confirmar as interações proteína-DNA.
Principais Resultados
- O ensaio detecta com sucesso interações envolvendo múltiplas proteínas.
- Os resultados fornecem insights sobre a dinâmica da ligação proteína-DNA.
- Demonstra a aplicabilidade do método em genômica funcional.
- Apoia a exploração adicional dos mecanismos de regulação transcricional.
Conclusões
- O ensaio aprimorado de hibridização em levedura é eficaz para estudar interações complexas.
- Este método pode avançar a pesquisa em genômica funcional.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para explorar a regulação gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Equipes de biotecnologia em fase de descoberta precisam de sistemas robustos para validar interações complexas entre proteínas e DNA, especialmente para complexos de fatores de transcrição implicados na regulação gênica. O ensaio modificado de hibridização em levedura um-híbrido (Y1.5H) permite a investigação funcional da ligação de complexos proteicos heteroméricos ao DNA, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos. Essa capacidade é fundamental para o avanço da genômica funcional e para a priorização de alvos em estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a validação direta de interações entre complexos proteicos heteroméricos e DNA relevantes para a regulação gênica.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao confirmar interações físicas antes de investimentos posteriores.
- Facilita estudos de genômica funcional para esclarecer o envolvimento de alvos candidatos em vias biológicas.
- Fornece evidências de interação com o alvo, orientando decisões de triagem de portfólio.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas biológicos validados para leituras quantitativas em ensaios subsequentes.
- Padroniza a detecção de interações proteína-DNA envolvendo múltiplas proteínas, garantindo reprodutibilidade.
- Permite fluxos de trabalho escalonáveis, baseados em placas, adequados para triagem de média escala.
- Apóia a avaliação confiável da especificidade de ligação ao DNA e da formação de complexos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas de genômica funcional com mecanismos regulatórios relevantes para doenças quando complexos-alvo estão implicados na patologia.
- Garante continuidade da descoberta à validação pré-clínica, confirmando a formação de complexos em um sistema controlado.
- Reduz o risco de avançar com alvos que apresentam perfis ambíguos de ligação ao DNA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio Y1.5H situa-se na interseção entre descoberta inicial e desenvolvimento de ensaios, conectando a validação de alvos e a genômica funcional com saídas quantitativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre ligação de complexos proteicos ao DNA e mapeamento de vias.
- Triagem: Fornece medições reprodutíveis e quantitativas da atividade da beta-galactosidase para análise comparativa.
- Análises: Oferece dados de densidade óptica e atividade de genes repórter para distinguir interações positivas.
- Pesquisa Translacional: Oferece uma plataforma para testar complexos regulatórios relevantes para modelos de doenças, quando apoiada por dados de genômica funcional.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a diversos complexos proteicos e regiões de DNA, permitindo ampla aplicação em programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao confirmar interações entre complexos heteroméricos e DNA.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho para reprodutibilidade e escalabilidade de média produtividade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao fornecer evidência precoce de engajamento funcional do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados mecanicistas validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de leveduras e no design de ensaios de genômica funcional.
- Requer acesso a instrumentação padrão de biologia molecular e espectrofotometria baseada em placas.
- Exige padronização entre equipes para controles de normalização e interpretação de dados.
- Adaptável a diversos complexos proteicos e fragmentos de DNA, mas não projetado para mapeamento de sítios alvo in vivo.
- Depende da confirmação prévia de interações proteína-proteína para garantir a especificidade do ensaio.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Preparation of Competent Cells
2:40
Co-transformation of Cells by Heat Shock
4:39
Transferring Cells onto New Plates
5:25
Preparing Culture for Measuring β-galactosidase Activity
8:14
Measuring β-galactosidase Activity
9:07
Results: Y1.5H Assay Detects Heteromeric Protein-DNA Interactions
9:50
Conclusion
