Name: Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a usar o ensaio híbrido de levedura modificado para estudar interações entre complexos proteicos heteroméricos e DNA em genômica funcional. Este método detecta interações envolvendo múltiplas proteínas ou fatores de transcrição.

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Agradecemos SS Wang, M. Amar e A. Galla pela leitura crítica do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob números de prêmios RO1GM067837 e RO1GM056006 (para a SAK). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as visões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

<html> 1. Preparação do plasmídeo Construir e Reportagem <ol><li> Amplificação por PCR as regiões promotoras / &quot;fragmentos&quot; (de preferência ~ 250 - 500 pb) do ADN alvo a serem analisados ​​para clonagem adicional no vector de entrada usando E. coli (TOP10). </li><li> Após confirmação de seqüenciamento, subclone o clone positivo em um vetor de expressão pGLacZi compatível 7 conforme descrito anteriormente 8 , 9 , 10 , 11 . </li><li> Transformar a estirpe de levedura para a integração do promotor (YM4271) por recombinação homóloga de pGLacZi para gerar tensão repelente de levedura como descrito anteriormente 12 , 13 . As etapas de transformação e confirmação da cepa de levedura com a região de DNA juntamente com a receita da mídia não são descritas aqui, pois as etapas são semelhantes ao protocolo Y1H clássicoAss = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . O plasmídeo de controle pEXP-AD502 pode ser usado para fins de normalização enquanto quantifica a atividade da p-galactosidase como descrito anteriormente 8 . </li><li> Clonar o TF ou proteína de interesse e, posteriormente, clonar o parceiro de proteína interativo nos vetores de expressão pDEST22 e pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain). Os fragmentos do promotor de fermento transformado e os clones de TF são posteriormente utilizados mais adiante no protocolo. </li></ol> 2. Protocolo modificado Y1.5H <ol><li> No dia 1 (tarde), comece com 5 mL de cultura em SD-Ura a partir de uma placa de Petri ou glicerol e incube durante a noite em um agitador de 30 ° C. NOTA: Esta cultura pode ser iniciada a partir de uma placa recém-listada ou diretamente de um estoque de glicerol a 25% ou 30% da leveduraClone com o fragmento de DNA. </li><li> No dia 2 (tarde), inocule 10 mL de meio YPDA com 500 μL da cultura durante a noite e incube durante a noite em um agitador a 30 ° C. </li><li> Dia 3 (início da manhã e toda a tarde): Prepare células competentes (início da manhã). <ol><li> Inocular 100 mL de meio YPDA com os 2 mL da cultura durante a noite e incubar em um agitador a 30 ° C. Cresça esta cultura fresca até o OD 600 atingir 0.4-0.8 (3-5 h). NOTA: Verifique a OD 600 da cultura durante a noite e certifique-se de que o ponto de início OD 600 para esta etapa seja 0,1 - 0,2. O uso de cultura em excesso ou sub-cultivada pode prolongar o experimento. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante. </li><li> Reconstitua os grânulos em 10 mL de água estéril usando um vórtice ou pipetando para cima e para baixo. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante. </li><li> ReconstituiçãoPellets em 2 mL de ácido tris-etilenodiaminotetraacético (TE) / acetato de lítio (LiAc) usando um vórtice ou pipetagem para cima e para baixo. NOTA: veja a receita para TE / LiAc na Tabela 1 . </li><li> Centrifugação por 5 min 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante. </li><li> Re-suspender o sedimento em 4 mL de TE / LiAc + 400 μL de DNA de esperma de salmão (10 mg / mL) para pipetar para cima e para baixo e avançar para o próximo passo. </li></ol></li><li> Co-transformação: choque térmico das células (tarde da tarde) <ol><li> Distribua 20 μL de células por poço em uma placa de mistura de 96 poços (U-bottom). </li><li> Adicione 150 ng (~ 1,5 μL) do plasmídeo pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: plasmídeo TF e pEXP-AD502 mais pDEST32ΔDBD: TF (controle de normalização) nos poços. NOTA: Espera-se resultados ótimos com ~ 150 ng de pDEST22: TF e pDEST32ΔDBD: plasmídeo TF para co-transformação bem-sucedida. Pode variar com as expressões de construção e plasmídeo, assimPrecisa ser otimizado com cada experiência. Outro controle pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD também pode ser incluído a critério do usuário. </li><li> Adicione 100 μL de TE / LiAc / polietileno glicol (PEG) por poço ( misture três vezes ). NOTA: veja a receita para TE / LiAc / PEG na Tabela 1 . </li><li> Cubra a placa com uma vedação respirável e incuba durante 20 a 30 min (pode ser mais longo) a 30 ° C (não é necessária nenhuma agitação). </li><li> Choque de calor durante 20 minutos ( precisamente ) a 42 ° C. </li></ol></li><li> Placa as células. <ol><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Retire o sobrenadante usando uma pipeta multicanal. Adicione 110 μL de TE e misture. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Remova 100 μL do sobrenadante usando uma pipeta multicanal. Re-suspenda o sedimento com o perfurador. </li><li> Transferir células em placas de agar SD-Trp-Leu . Incubar pratosA 30 ° C até o próximo passo. </li></ol></li><li> Dia 5 (tarde): transfira as células em placas novas usando o replicador de perfuração / microplaca. <ol><li> Preencha uma placa de mistura estéril de 96 poços (U-bottom) com 50 μL de TE usando uma pipeta multicanal. Pré-molhe o perfurador no TE. NOTA: O perfurador ou o replicador de microplacas devem ser esterilizados antes desta etapa e, posteriormente, mais tarde no protocolo. A maneira comum de esterilizar o perfurador, como imergê-lo em etanol (100%, não grau de biologia molecular) e depois queimá-lo para a chama pode ser aplicada. Aguarde 1 minuto para resfriar os pinos do perfurador. Cuidado: se realizar a esterilização no banco; Certifique-se de que o banco seja pré-limpo com etanol e sem qualquer material combustível ao redor. Use equipamento de proteção pessoal adequado (PPE). </li><li> Coloque as colônias e volte a suspender na placa cheia de TE. NOTA: Se houver um crescimento suave na placa, as colônias podem ser perfuradas diretamentePara a placa cheia de TE ou, alternativamente, uma colônia única (no caso de colônias múltiplas) deve ser colhida usando um palito de dentes esterilizado para a placa cheia de TE e subsequentemente o perfurador pode ser usado para o próximo passo. </li><li> Transfira-os para novas placas de agar SD-Trp-Leu para uma cobertura de superfície ideal. Incube as placas a 30 ° C até o próximo passo. </li></ol></li><li> Dia 7 (tarde): Comece a cultura para medir a atividade da β-galactosidase. <ol><li> Preencha uma placa de mistura estéril de 96 poços (U-bottom) com 50 μL de mídia SD-Trp-Leu usando uma pipeta multicanal. </li><li> Preencha um bloco de poço estéril de 96 poços com 180 μL de mídia SD-Trp-Leu usando uma pipeta multicanal. </li><li> Pré-molhe o perfurador na mídia e transfira as colônias da placa para os 50 μL de mídia. </li><li> Transfira 20 μL de fermento para os 180 μL de mídia SD-Trp-Leu e selar o bloco com um selo respirável. IncubarPor 36 h a 30 ° C, agitador. </li></ol></li><li> Dia 9 (manhã): Comece a cultura para medição enzimática. <ol><li> Transfira 100 μL de cultura para 500 μL de meio YPDA num bloco de poços de 96 poços esterilizados. </li><li> Cubra a placa de poço profundo esterilizado com uma vedação respirável e incube durante 3 a 5 horas a 30 ° C com agitação a 200 rpm (até OD 600 0,3-0,6). </li><li> Re-suspende a cultura e transfira 125 μL usando uma pipeta multicanal em uma placa de espectrofotômetro (medida OD 600 ). NOTA: Cuidado: não distribua a última gota para evitar bolhas, se a OD 600 estiver abaixo de 0,3 - 0,6, incubar as células restantes por 1 a 2 h mais com base na leitura. A cultura de 125 μL usada nesta etapa pode ser descartada ou transferida de volta para o bloco de poço profundo original, a critério do usuário. </li><li> Centrifugar as células restantes no bloco do poço profundo durante 10 min a 3000 xg e 21 ° C. Remover o supernatanT por inversão. </li><li> Adicione 200 μL de Z-buffer e vortex. NOTA: veja a receita para o Z-buffer na Tabela 1 . </li><li> Centrifugar durante 5 min a 3000 xg e 21 ° C. Remova o sobrenadante por inversão. </li><li> Adicione 20 μL de Z-buffer e vortex. </li><li> Cubra a placa com papel de vedação que pode resistir ao congelamento dos ciclos de descongelamento. Execute 4 ciclos de congelamento / descongelamento usando nitrogênio líquido em uma aspiradora e depois 42 ° C em banho-maria (2 minutos cada). </li><li> Adicionar 200 μL de tampão Z / beta-mercaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-p-galactósido (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg, respectivamente, produzirão 20 mL de solução, sempre preparada fresca ). NOTA: O ONPG levará algum tempo para dissolver adequadamente, para preparar a solução uma hora antes de chegar a essa etapa. ONPG serve como substrato para a medição da atividade da β-galactosidase. </li><li> Incube até 17 - 24 h a 30 ° C (verifique no meio, se a cor desenvolver o pr prVá para o próximo passo). </li></ol></li><li> Dia 10 (manhã): Pare a reação e a medição. <ol><li> Adicione 110 μL de Na 2 CO 3 1M para parar a reação e tempo de gravação. </li><li> Vortex e centrifugação por 10 min a 3000 xg e 21 ° C. </li><li> Pegue 125 μL de sobrenadante usando multicanal e mede OD 420 . NOTA: Cuidado, não distribua a última gota para evitar bolhas. </li><li> Calcule a atividade de β-gal: 1000 x OD 420 / (tempo (min) x volume (mL) x OD 600 em uma planilha. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays%3A+A+historical+and+technical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
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<li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li>
<li>Klein, P., Dietz, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li>
<li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li>
<li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/5/pdb.prot4590.full">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li>
<li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesse.

O procedimento padrão Y1H existente é adequado para identificar uma única presa de proteína que se liga à sua isca de DNA. Com várias modificações técnicas, o sistema existente foi aproveitado para definir redes reguladoras de transcrição. No entanto, os TFs são conhecidos por funcionar como uma parte dos complexos envolvendo duas ou mais TFs ou proteínas, com apenas alguns dos TF capazes de se ligar ao DNA. As proteínas ou TFs que possuem apenas os domínios de ligação à proteína e a falta de capacidade para se ligar ao...

<html> Em geral, para entender as interações proteína-DNA, o teste Y1H é o sistema preferido usado com sucesso em uma configuração laboratorial 1 . O ensaio básico de Y1H envolve dois componentes: a) uma construção repórter com ADN de interesse clonado com sucesso a montante de um gene que codifica uma proteína repórter; E b) uma construção de expressão que irá gerar uma proteína de fusão entre o TF de interesse e um domínio de ativação da transcrição de fermento (AD). O DNA de interesse é comumente referido como &quot;isca&quot;, enquanto a proteína de fusão é conhecida como &quot;presa&quot;. Nos últimos anos, várias versões do ensaio Y1H foram desenvolvidas para atender às necessidades específicas com suas próprias vantagens 2 . O ensaio Y1H existente pode ser implementado com sucesso para identificar e validar a interação de uma proteína de cada vez com a isca de DNA, mas não possui a capacidade de identificar interações heterodiméricas ou multimeric proteína-DNA. &quot;&gt; O método descrito aqui é uma versão modificada dos pesquisadores habilitados para Y1H para estudar simultaneamente múltiplas proteínas que se ligam à sua sequência de DNA alvo. O objetivo deste ensaio é expressar a proteína de interesse com um domínio de ativação (pDEST22: TF) e avaliar a ativação das regiões de DNA candidatas fundidas a um repórter na presença e / ou ausência do parceiro de proteína que interage (pDEST32ΔDBD-TF) no sistema de levedura. Esse ensaio nos permitirá determinar se a interação entre esses dois As proteínas são necessárias para a ativação do alvo. Este é um sistema compatível com clonagem GATEWAY e, portanto, é viável para uso em uma configuração regular de laboratório. Este protocolo baseia-se na transformação direta, o que proporciona a facilidade de co-transformação de diferentes TFs em um sistema de levedura . Assim, é uma estratégia vantajosa para validar os complexos de proteína que se ligam aos seus possíveis alvos de DNA para validação molecular e funcional in vitro fOu qualquer sistema. As técnicas atuais, como os métodos de purificação por afinidade em Tandem (TAP), são caras e intensivas em mão-de-obra, mas permitem a detecção de hetrocomplexos protéicos em grande escala 3 , 4 , 5 . Este um híbrido de levedura modificado pode ser realizado com sucesso em uma configuração de laboratório regular em pequena escala ( Figura 1 ) e também é rentável. O ensaio Y1.5H pode facilitar pesquisadores em toda a comunidade para testar e validar sua hipótese para definir o papel da ligação do complexo de proteína multimérica a um alvo de DNA comum usando um sistema heterólogo. Com base nos achados, a hipótese poderia ser validada in vivo no sistema de estudo preferido. Recentemente, utilizamos essa abordagem para definir o papel de um TF e seu modo de ação para regular a floração em Arabidopsis 6 .

<table><tbody><tr><td>pDEST22 vector</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Kit de sistema híbrido Pro-Quest Two</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Kit de sistema híbrido Pro-Quest Two; este vecor é modificado. É pDEST32 menos ligação ao DNA Domínio</td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Kit de clonagem</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Cepa</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER Sistema híbrido</td></tr><tr><td>único pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Kit de dois sistemas híbridos</td></tr><tr><td>GATEWAY LR Clonase II mistura enzimática</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>mídia YPDA Clontech</td><td></td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD mídia mínima</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO Suplemento</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Triptofano Do Suplemento</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperm (10mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 poços de fundo redondo Placa</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547 bloco</td><td></td></tr><tr><td>de poço de 96 profundidades</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>Folha Selável</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td>Molecular</td><td></td><td>Espectrofotômetro</td></tr> <tr><td>de Microplacas SPECTRAMAX PLUSIncubadora</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modelo nº 5250- 37 graus, 6250-30 graus</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>Puncher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriplates (150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema híbrido de levedura-um modificado para estudos de interação de dna de complexo de proteínas heteroméricas

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ao longo dos anos, o ensaio de um híbrido de levedura provou ser uma técnica importante para a identificação e validação de interações físicas entre proteínas, como fatores de transcrição (TFs) e seu alvo de DNA. O método apresentado aqui utiliza o conceito subjacente do Y1H, mas é modificado para estudar e validar os complexos de proteínas que se ligam ao DNA alvo. Assim, é referido como o ensaio de um híbrido (Y1.5H) de levedura modificado. Este ensaio é rentável e pode ser facilmente realizado em uma configuração regular de laboratório. Embora utilizando um sistema heterólogo, o método descrito pode ser uma ferramenta valiosa para testar e validar a ligação do complexo de proteína heteromérica ao (s) alvo (s) de DNA da genômica funcional em qualquer sistema de estudo, especialmente a genômica vegetal.

O procedimento geral de montagem de placas para a co-transformação de regiões de DNA nas células de levedura com proteína de interesse ( Figura 2 ). A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões / fragmentos de DNA testados. Após o dia 5 do protocolo, uma placa bem cultivada e positiva deve ser visível como na Figura 3 . Em nosso estudo, a região promotora de 2600 pb...

O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

O objetivo geral deste experimento é estudar e validar a interação entre complexos proteicos heteroméricos e DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo genômico funcional em um ambiente laboratorial comum. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de genômica funcional, como a genômica planejada. A principal vantagem desta técnica é que ela detecta interações entre proteínas e DNA que envolvem mais de uma proteína ou fator de transcrição.Inicie este procedimento na tarde daquele que será designado como dia um. Inicie um cultivo de 5 mililitros em meio sintético definido ou meio SD sem uracil a partir de uma placa de Petri recentemente estriada. Incube durante a noite em um agitador a 30 graus Celsius.No dia seguinte à tarde, inocular 10 mililitros de meio YPDA com 500 microlitros da cultura de crescimento noturno e incubar durante a noite em agitador a 30 graus Celsius. Pela manhã cedo do dia seguinte, inocular 100 mililitros de meio YPDA com 2 mililitros da cultura de crescimento noturno. Crescer esta cultura fresca a 30 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros alcance de 0,4 a 0,8.Centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de água estéril e reconstitua o precipitado por vortexagem.Centrifugue a 1000 × g e 21 °C por cinco minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mililitros de acetato de lítio TE e reconstitua o pellet por vortex. Centrifugue a 1000 × g e 21 °C por cinco minutos.Descarte o sobrenadante. Adicione 4 mililitros de acetato de lítio TE mais 400 microlitros de DNA de esperma de salmão e re-suspenda o precipitado pipetando para cima e para baixo. As células estão agora prontas para transformação, conforme demonstrado no próximo segmento.A co-transformação das células é realizada em uma placa de mistura de fundo redondo de 96 poços. Primeiro, distribua 20 microlitros de células competentes por poço na placa de 96 poços. Em seguida, adicione aos poços 150 nanogramas de cada um dos dois plasmídeos e do controle de normalização.Este esquema mostra a configuração geral da placa para a co-transformação das células de levedura com a proteína de interesse. A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões ou fragmentos de DNA testados. Adicione 100 microlitros de acetato de lítio TE com polietilenoglicol por poço e misture três vezes por pipetagem.Cubra a placa com um selo respirável e incube a 30 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Aplicar choque térmico a 42 graus Celsius por exatamente 20 minutos. Após o choque térmico, centrifugue a 1000 vezes G e 21 graus Celsius por 5 minutos.Utilize uma pipeta multicanal para remover o sobrenadante. Adicione 110 microlitros de TE e misture. Centrifugue novamente por 5 minutos.Remova 100 microlitros do sobrenadante de cada poço. Mergulhe um furador em etanol a 100%, queime-o, aguarde um minuto para que os pinos do furador esfriem e, em seguida, utilize o furador estéril para ressuspender o pellet. Transfira as células para placas de agar com meio de cultura SD sem triptofano e leucina.Incube as placas a 30 graus Celsius por dois dias. Na tarde do quinto dia, retire as placas de auger do incubador. Adicione 50 microlitros de TE em cada poço da placa de mistura estéril de 96 poços com fundo em U. Umedeça previamente um punção estéril em TE, retire as colônias da placa de depleção de SD com triptofano e lucina e ressuspenda-as na placa contendo TE.Transfira as colônias para novas placas de agar com meio SD sem triptofano e leucina, para cobertura superficial ideal. Incube as placas a 30 graus Celsius por 2 dias. Na tarde do dia 7, retire as placas de agar do incubador.Cubra cada poço de uma placa estéril de mistura de 96 poços em formato u com 50 microlitros de meio SD sem triptofano e leucina. Preencha cada poço de um bloco estéril de 96 poços profundos com 180 microlitros de meio SD sem triptofano e leucina. Esterilize o furador, umedeca previamente o furador e o meio, e transfira colônias da placa para os poços que contêm 50 microlitros de meio cada.Transfira 20 microlitros de levedura para os 180 microlitros de meio de eliminação de triptofano e leucina SD. Sobre o bloco, coloque uma tampa respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação por 36 horas. Na manhã do nono dia, transfira 100 microlitros de cultura para 500 microlitros de meio YPDA em um bloco esterilizado de 96 poços profundos.Cubra com um selo respirável e incube a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm por três a cinco horas. Após três a cinco horas, ressuspenda o cultivo e transfira 125 microlitros de cada poço para uma placa de espectrofotômetro. Meça a densidade óptica a 600 nanômetros para garantir que esteja entre 0,3 e 0,6.Centrifugue as células restantes no bloco de poços profundos a 3000 ×g e 21 °C por 10 minutos. Remova o sobrenadante invertendo o bloco. Adicione 200 µL de tampão Z a cada poço e vortexie.Centrifugue a 3000 G e 21 graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante invertendo o tubo. Adicione 21 microlitros de tampão Z a cada poço e vortex.Cubra a placa com folha adesiva resistente a ciclos de congelamento e descongelamento. Em uma cabine de segurança química, realize 4 ciclos de congelamento/descongelamento utilizando nitrogênio líquido e um banho-maria a 42 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de solução recém-preparada de tampão Z beta-mercaptoetanol ONPG a cada poço.Incubar a 30 graus Celsius por 17 a 24 horas ou até o desenvolvimento da cor. Na manhã do dia 10, verifique se a cor se desenvolveu. Adicione 110 microlitros de carbonato de sódio um molar a cada poço para interromper a reação.Registre o tempo e vortexe a placa. Centrifugue a 3000 vezes G e 21 graus Celsius por dez minutos. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa de espectrofotômetro.Meça a densidade óptica a 420 nanômetros. Calcule a atividade da beta-galactosidase em uma planilha conforme descrito no protocolo do texto. Neste estudo, a região promotora de 2600 pares de bases upstream do início do sítio de início da transcrição foi segmentada em seis regiões ou fragmentos.Esta foto é um exemplo de uma placa bem desenvolvida e positiva após o quinto dia do protocolo. Neste resultado representativo, os fragmentos de DNA um e quatro mostram interação positiva com o complexo das proteínas A e B. Após a medição da atividade de beta-galactosidase, o fragmento um mostra uma indução de quatro vezes da atividade do gene repórter.É importante lembrar que este procedimento é recomendado para obter informações sobre regiões de DNA somente após a confirmação da interação proteína-proteína proposta e não foi projetado para fornecer informações sobre sítios alvo. Após este procedimento, outros métodos, como ensaio ChIP e MSAR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, identificar os sítios alvo in vivo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar e validar o papel de complexos proteicos multiméricos que se ligam a um alvo de DNA comum.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.

Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

As proteínas interagem entre si e essas interações determinam em grande parte suas funções. Os parceiros de interação proteica podem ser identificados em alto rendimento in vivo usando um ensaio de aptidão de levedura baseado no ensaio de complementação de fragmentos de proteína diidrofolato redutase (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

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Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

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Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de &gt; 1.000 TFs em uma única experiência.

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As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

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Aprenda a usar o ensaio híbrido de levedura modificado para estudar interações entre complexos proteicos heteroméricos e DNA em genômica funcional. Este método detecta interações envolvendo múltiplas proteínas ou fatores de transcrição.

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