Name: Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a avaliar a homeostase dopaminérgica em camundongos usando captura sinaptosomal de dopamina e análise por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Esses métodos permitem medir o conteúdo tecidual de dopamina e a funcionalidade do transportador após manipulações in vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo UCPH 2016 programa de excelência (U.G., A.R., K.J.), a Fundação Lundbeck (M.R.) a Fundação Lundbeck centro de biomembranas em nanomedicina (U.G.), o nacional Instituto de saúde subsídios P01 DA 12408 (U.G.), o dinamarquês Conselho para a investigação independente - ciências médicas (U.G.).

as orientações da Inspetoria dinamarquês de Experimentação Animal (número de permissão: 2017-15-0201-01160) foi seguido e experiências realizadas em uma instalação totalmente AAALAC credenciado sob a supervisão de um local ao bem-estar dos animal Comitê.
 1. synaptosomal absorção de dopamina (método 1) Nota: Este protocolo é para avaliação paralela de dois cérebros, mas pode ser utilizado com sucesso para realizar experiências de captação DA synaptosomal com quatro cérebros em paralelo.
<ol><li>Preparações <ol><li>microcentrífuga de 1,5 mL de rótulo 48 tubos por tabela 1 (24 em cada cérebro). Use cores diferentes para os tubos pertencentes a cada cérebro para evitar a confusão entre amostras</li> <li>rótulo 51 cintilação tubos #1-51.</li>
		Fosfato de <li>lugar tampão salino (PBS) no gelo. Isso será usado para manter o cérebro refrigerado.</li>
		<li>Ativar o centrifugador para deixar arrefecer pre-4 ° C.</li>
		<li>Pre-pesar dois tubos de centrífuga de micro para obter o peso exato do tecido durante a preparação de synaptosomal (seção 2.6).</li>
		Buffer de <li>preparar homogeneização pela mistura de 4 mM HEPES e 0,32 M de sacarose. Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo 
		Nota: Tampão de homogeneização pode ser mantido em alíquotas a-20 ° C e descongelado no dia do experimento.</li>
		Buffer de absorção <li>preparar combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH (leva a uma concentração de sódio de cerca de 130 mM) e manter no gelo 
		Nota: Para 2 cérebros, prepare-se 1500 mL de tampão de captação. Preparar o buffer de captação como um 10 x solução sem ácido ascórbico e glicose mantido a 4 ° C. Make 1 x solução de trabalho recentemente no dia, completando com ácido ascórbico e glicose. Ajustar o pH com NaOH para 7.4.</li>
		Buffer de captação de preparar <li>+ ligante combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM, 10 nM Inibidor da Catecol-O-metil-transferase (COMT). Ajustar o pH 7,4 com NaOH e manter no gelo 
		Nota: Usar 50 mL de tampão de captação e adicionar ligante. Pargyline é adicionado para ajudar a prevenir a degradação pela oxidação através da monoamina oxidase (MAO). Inibidor da COMT (RO-41-0960) é adicionada para prevenir a degradação DA (catecolaminas em geral) pela COMT. Desipramina é adicionada ao inibir a absorção através dos transportadores de noradrenalina e serotonina e assim, tornar os resultados de absorção específica para DAT.</li>
		Buffer de captação de preparar <li>+ ligante + cocaína combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM , 10 nM COMT inibidor, cocaína de 500 μM. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH e manter no gelo 
		Nota: Use 7 mL de tampão de captação + ligante e adicionar a cocaína. Cocaína é adicionada para obter uma medição de fundo de captação DA não-específica para subtrair os dados, deixando apenas a absorção de DAT específicos (desde que SERT e NET são inibidas por desipramina conforme descrito acima). Alternativamente, um altamente potente e específico inibidor da DAT GBR-12935, pode ser usado em vez disso. 
		Importante: Manter tudo em gelo com .</li>
	</ol></li> <li>Synaptosomal preparação <ol><li>sacrificar um rato de cada vez por deslocamento cervical e decapitação.</li>
		<li>Cortar a pele com uma tesoura para revelar o crânio e corte qualquer excesso de tecido posterior do crânio esquerda de decapitação. Cortar o crânio com uma pequena tesoura reta ao longo da microporagem sagittalis terminando como anteriormente possível.</li>
		<li>Coloque as pontas da duas tesoura em cada olho do rato e corte no crânio para remover o restante do crânio e do cérebro intacto. Rapidamente Retire o cérebro e colocá-lo em PBS gelado. Isto irá mantê-lo frio, enquanto o segundo cérebro é dissecado.</li>
		<li>Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum (ântero-posterior: +1,5 mm mm-1,50) seguida por uma dissecção mais fina com um perfurador. Veja a Figura 1 para área de soco.</li>
		<li>Manter o tecido no gelo em todos os momentos a avançar.</li>
		<li>Transferir o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para a pesagem. 
		Nota: Este peso será usado na etapa 1.2.14.</li>
		<li>Repeat passo 1.2.1-1.2.6 para o segundo cérebro.</li>
		<li>Uma vez que o peso foi obtido para os cérebros, transferir o tecido para um vidro de homogeneização contendo 1 mL de tampão de homogeneização gelada.</li>
		<li>Homogeneizar o tecido usando um pilão motor conduzido a 800 rpm, 10 traços mesmo. 
		Nota: Um curso é igual a um acima e para baixo a ação, o primeiro traço deve ser cerca de 5 s, o seguinte 3-4 s. homogeneização em meio isotônico é importante para evitar o estouro do sinaptossomas 6. Usando a força apropriada e meio isotônico permitirá que os terminais pré-sináptica reseal delimitador citoplasma, vesículas sinápticas, mitocôndrias e citoesqueleto 15.</li>
		<li>Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coletar o restante homogenate de vidro a homogeneização enxaguando com 0,5 mL de tampão de homogeneização adicionais.</li>
		<li>Manter a amostra em gelo, enquanto o tecido do outro cérebro é homogeneizado. Executar os dois cérebros em paralelo em etapas 1.2.12-1.2.13.</li>
		<li>Núcleos de pelotas e detritos de células por centrifugação (1.000 x g, 10 min, 4° C).</li>
		<li>Transferir o sobrenadante (S1) (contendo as membranas celulares e citoplasma) para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante (que contém o citoplasma) e ressuspender o precipitado (P2) (contendo sinaptossomas brutas) em tampão de homogeneização 40 μL / tecido mg (baseado no peso obtido na etapa 1.2.6). Resuspenda suavemente a fração synaptosomal bruta, com uma pipeta p1000 como muita força vai quebrar as sinaptossomas. 
		Nota: É importante acabar pelo menos 280 μL. Se não, será necessário diluir com mais de 40 μL por mg. 1.2.1-1.2.13 etapas devem ser executadas mais rápido possível, e tudo tem de ser mantido no gelo. Tão logo as sinaptossomas brutas tem sido resuspended no buffer de homogeneização são relativamente estáveis, enquanto são mantidos em gelo 6 , 15 , 16.</li>
	</ol></li></ol> 2. Experiência de absorção <ol><li>Adicionar 440 μL tampão de captação + ligante + cocaína para os designado 12 tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e 440 buffer de captação μL + ligante para os 36 restantes tubos de microcentrifuga de 1,5 mL (ver tabela 1 para o layout). 
	Nota: Remova-os do gelo 15 min antes do início do experimento para trazê-los à temperatura ambiente, mas manter-se no gelo até então conservar inibidores.</li>
	<li>Curva de saturação de preparar (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamina) (91,1 Ci/mmol) em diferentes concentrações finais (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0 μM)).
	<ol><li>Rotular seis tubos de 2ml microcentrifuga como 10, 5, 2,5, 1,25, 0.62 e 0,31.</li>
		<li>Buffer de captação μL adicionar 750 + ligante para os 5 tubos microcentrifuga com número mais baixo.</li>
		<li>Buffer de absorção 1,455.4 Adicionar μL + ligante, 14,6 dopamina μL (1 mM), 30 μl dopamina 3-H (11 μM) ao tubo rotulado 10.</li>
		<li>Transferência 750 μL do tubo rotulado 10 para o tubo de 5. Misture bem e transferir 750 μL deste tubo ao tubo de 2,5. Repita esta diluição com os restantes tubos.</li>
	</ol></li> <li>Pré-enxágue os filtros de microfibra de vidro com 4 mL de tampão de captação depois colocando-os em um balde de filtro bem 12.</li>
	Microcentrífuga de 1,5 mL de <li>Adicionar 10 μL de suspensão de membrana synaptosomal para as primeiras 24 tubos (ver tabela 1 para o layout) com tampão μL 440. Vórtice cuidadosamente e spin para baixo em breve para garantir que a sinaptossomas estão submersos no buffer. Deixar em 37 o C por 10 min. 
	Nota: É importante ser mais exato no times durante o experimento de absorção para uma comparação justa entre cérebros. Use um cronômetro para precisão.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de dopamina concentração 10 e 5 μm (seção 2.2) para o primeiro duas colunas e deixar em 37 o C por 5 min com agitação. Depois de exatamente 5 min, pare a reação adicionando 1 mL de tampão de captação gelada. Faça o mesmo com concentração 2,5 e 1,25 μM (seção 2.2) e, em seguida, com concentração 0.62 e 0,31 μM.</li>
	<li>Adicionar as amostras para os filtros de microfibra previamente enxaguado e lave com 4 x 5 mL de tampão de captação gelada. Quando as primeiras 12 amostras foram adicionadas aos filtros, mudar os filtros para tubos de cintilação. Repita isto com as próximo 12 amostras.</li>
	<li>Repeat passo 2.4-2.6 para o cérebro próximo.</li>
	<li>Contagem max 3 preparar tubos colocando um filtro de microfibra na parte inferior dos tubos de cintilação 49-51 e adicionando 25 µ l da concentração de dopamina máxima no topo (10 μM).</li>
	<li>Deixar todos os 51 tubos de cintilação em uma coifa de 1 h.</li>
	<li>Líquido de cintilação adicionar 3 mL de cada tubo de cintilação e agitação vigorosa num agitador por 1 h.</li>
	<li>Contagem [3 H]-em um beta-contador de 1 min.
	<ol><li>Abrir o programa e escolha: Label: H-3, placa/filtro: frasco de 4 mL, 4 por 6, tipo de ensaio: Normal e contando o tempo: 1 min. 
		Nota: Esta etapa pode ser realizada no dia seguinte se mais conveniente. Deixe amostras cobertas com papel alumínio durante a noite.</li>
	</ol></li> <li>Determinação da proteína <ol><li>usar um kit de ensaio da proteína de BCA padrão para determinar as concentrações de proteína das sinaptossomas de ajustamentos de contagens por minuto (cpm) μg/fmol/min e para comparação adequada de absorção entre as amostras.</li>
	</ol></li></ol> 3. Análise de dados <ol><li>usar os dados de captação experiência tornar-se uma saturação curva para cada grupo e calcular a taxa de reação (V max) e a constante de Michaelis Menten (K M). 
	Nota: O valor de K M reflete a concentração de substrato necessária para chegar a metade de V máx. Nesse sentido, V máx diretamente reflete a função do DAT (capacidade de absorção máxima), que depende do número de DAT na superfície e sobre como sua atividade pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas, bem como na alterações em gradientes de íons. O valor de K M é uma medida indireta da afinidade de substrato para o transportador que, importante também pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas. Para avaliar plenamente as alterações funcionais, portanto, é importante determinar diretamente os níveis de expressão de superfície por exemplo um ensaio de superfície biotinylation. Uma descrição da recaptação de dopamina e uma elaboração sobre o significado dos valores máximo de K, M e V foram revistas pelo Schmitz et al. 17.</li>
</ol> 4. Cromatografia líquida de alta eficiência (método 2) <ol><li>dissecação cerebral <ol><li>rótulo e pesar tubos microcentrifuga; um por região por rato.</li>
		<li>Sacrificar um rato de cada vez por decapitação e desconjunção do colo do útero. Remova rapidamente o cérebro conforme descrito na seção 1.2. Executar outras dissecação imediatamente.</li>
		<li>Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum seguido mais fino bilateral dissecação do NAc e dStr com um perfurador. Veja a Figura 3 para área de soco.</li>
		<li>Transferir o tecido para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque rapidamente em gelo seco. Pesar o tecido e coloque-o no gelo seco imediatamente. 
		Nota: O peso do tecido é importante para o cálculo da concentração mais tarde.</li>
		Repita os passos de <li>4.1.1-4.1.4 com o mouse próximo. 
		Nota: Coloque o tecido em 80 o C até posterior processamento ou imediatamente proceder ao processamento do tecido.</li>
	</ol></li></ol> 5. Preparação do tecido <ol><li>centrífuga de deixe-a esfriar previamente a 4 ° C</li> <li>preparar a solução de homogeneização (0.1 N perclórico ácido (HClO 4)) e fique na Ice.</li>
	<li>Usando solução de homogeneização, preparar um padrão de fresco 0.1 dopamina pmol/μL de uma solução stock de 1 mM (uma diluição 10.000 x). 
	Nota: A solução é preparada dissolvendo dopamina no buffer de homogeneização para uma concentração das ações de 1 mM, que pode ser mantida a 20 ° C por cerca de um mês. Se outras áreas do cérebro são de interesse, concentração da norma terá que ser modificado, desde que outras áreas do cérebro, incluindo o córtex prefrontral, hipocampo, substância negra e área tegmental ventral possuem até 100 vezes menos DA comparado ao striatum.</li>
	<li>Adicionar solução de homogeneização 500 μL de cada amostra (ou seja, tecido NAc e dStr; seção 4.1) e homogeneizar as amostras usando um ultra-homogenizador na velocidade máxima por cerca de 30 s. manter a amostra em água gelada durante a homogeneização. Entre cada amostra, limpar o Homogenizador ultra com água (toda a velocidade para 30 s).</li>
	<li>Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C, 14.000 g. x</li>
	Amostra de <li>de transferência de aproximadamente 200 μL para um vidro 0.22 μm filtro (1 cm de diâmetro), utilizando uma seringa de plástico de 1 mL. 
	Nota: O uso de filtros de vidro não é importante, desde que os filtros escolhidos são 0,22 μm para remover as substâncias de alto peso molecular.</li>
	<li>Analisar amostras por detecção eletroquímica (CE)-HPLC metodologia 18 conforme descrito na seção 6.</li>
</ol> 6. Análise de cromatografia líquida alta performance <ol><li>Prepare a seguinte solução para a fase móvel: acetato de sódio 55 milímetros, octanesulfonic ácido 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitrilo 8%, ácido acético 0,1 M, pH = 3.2. 
	Nota: Ajuste o pH com o ácido acético 0,1 M. É importante ser mais preciso com o pH. A solução deve ser degassed pelo desgaseificador on-line (parte integrante do sistema de HPLC). Fazer 2 L da fase móvel e alterá-lo uma vez por mês (mudá-lo quando o ruído fica perceptível). Devido a flutuações leva cerca de 24 h para ajustar depois de mudar a fase móvel.</li>
	<li>Instalação do detector: <ol><li>Set volts saída para 700 mV e temperatura para 32 ° C no forno detector; isto é muito importante. Fazer um programa de escala usando o manual on-line. Consulte o manual para mais detalhes). Adicionar o programa tempo conforme tabela 2. 
		Nota: Neste estudo, o programa é ajustado para mudar automaticamente a corrente em tempos de retenção ajustado, para manter a HPLC a corrente ideal e para manter os picos do cromatograma, sendo ampliado quanto possível, mas ainda no modo de exibição. Isto foi otimizado para striatal lysates de cérebro de ratos.</li>
	</ol></li> <li>Quando o programa foi adicionado ao detector, faz uma curva de calibração de 3 pontos, injetando o padrão três vezes (5, 10 e 15 μL). 
	Nota: Padrão (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) deve ser injetado a cada décima amostra e amostras calibradas para o padrão mais próximo. Fine tune o sistema o dia antes ajustando o padrão de 3 pontos, e verificando se o cromatograma sai dentro do intervalo esperado. Se for observado ruído substancial, mude a fase móvel. Se um pico superior a 990 mV então re-injetar a amostra em um volume menor, ou fazer um novo programa de gama e uma nova curva padrão. Limite de detecção é medido como 3 vezes o valor de ruído em mV para o menor valor de pico injectado a cada norma (ND, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT e 5-HT).
	<ol><li>Sistema de set-up, abrindo a solução de LC e ativando começa de 1; esta análise no modo online. Digite a ID de usuário e senha e clique em okey. Espere a solução de LC para conectar instrumentos. Ir para tabela de lotes e preencha as informações de dados (por exemplo, tipo de amostra: desconhecido para amostras e std para padrão, tipo de análise:-QT, volume de inj: 10, ISTD amt: golpe de nível 1). Salve o arquivo (vá para arquivo - &#62; salve o arquivo de lote como - &#62; salvar).</li>
		<li>Que o sistema injete a primeira amostra pressionando &#39; lote iniciar &#39;. Isso resultará na injeção de amostra de 10 μL pelo mostruário com um módulo de solvente entrega. 
		Nota: Utilize uma taxa de fluxo da bomba de 0,15 mL/min e uma coluna C18 com fase de reversão. Aqui, foi usado um detector amperométrico para a deteção de eletroquímica. O eletrodo de carbono vítreo deve ser definido para 0,8 V com um eletrodo de referência Ag/AgCl. Fim do ensaio dopamina, use 3 cromatografia µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partícula tamanho 3 µm) para conseguir a separação cromatográfica.</li>
		<li>Extrair as áreas de pico registado e calculado.
		<ol><li>Ir para aquisição de dados a seguir o cromatograma quando tem terminado as amostras. Acesse a Lc análise post - &#62; escolheu o nome do arquivo (o cromatograma abrirá) - &#62; clique em ver. Na barra de integração manual, adicione todos os picos para ser integrado - &#62; ir ao relatório de dados e imprima a leitura. 
			Nota: Aqui o software de solução LC foi usado para controle de sistema e análise de dados.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>De áreas de pico, calcular a concentração de dopamina em uma amostra, como segue, usando a concentração conhecida do padrão: <ol><li>usar a área do pico do padrão (igual a 1 pmol) para adquirir o fator r. 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56093/56093eq1.jpg" /></li> <li>usar fator para obter a concentração das amostras. 
		Concentração da amostra (em pmol por 10 μL) = área do pico de fator A × da amostra</li> <li>Use esta fórmula para obter a concentração da amostra em ng. 
		Amostra concentração pmol / 10 µ l x 500 µ l x MW de dopamina = concentração da amostra em ng amostra concentração (ng) = concentração da amostra (em pmol por 10 μL) x 500 μL x MW de dopamina</li> <li>usar a concentração da amostra no ng para obter t Ele concentração no tecido pg/g da amostra (amostra concentração em pg / g de tecido = tecido pg/g).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este manuscrito descreve protocolos experimentais úteis para delinear DA homeostase em qualquer modelo do rato da escolha. Nós fornecemos protocolos detalhados para medição de níveis no tecido cerebral de ratos usando HPLC e synaptosomal DA absorção para avaliar funcional DA transporte através de DAT. Os procedimentos, protocolos e limites para o experimento HPLC e ensaio de absorção DA synaptosomal serão elaborados abaixo.
O protocolo de captação synaptosomal pode fornecer uma visão útil para...

Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora essencial para comportamento motor, recompensa e função cognitiva1,7,8,9. Desequilíbrios na homeostase DA estão implicados nas várias doenças neuropsiquiátricas como transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, vício em drogas, depressão e doença de Parkinson1. DA é liberada a partir o neurônio pré-sináptica para a fenda sináptica, onde liga a e ativa receptores na membrana pré e pós-sináptica, transmitindo, assim, mais o sinal. O nível na sinapse após lançamento é espacial e temporalmente controlado por DAT3,10. O transportador sequestra do espaço extracelular e, portanto, sustenta fisiológica DA níveis3,11. Remoção de genética de DAT em camundongos faz com que um fenótipo hiperdopaminérgicas caracterizado por níveis elevados DA sinápticos, depleção de intracelular DA piscinas e mudanças profundas na pós-sináptica DAergic10,12de sinalização.
Aqui, apresentam-se dois protocolos separados, um método de medida DA tecido conteúdo e outro para avaliar a funcionalidade do DAT. combinado com o ensaio de superfície biotinylation descrito por Gabriel et al13 esses dois métodos fornecem informações sobre DA conteúdo e funcionais níveis de DAT para uma avaliação completa DA homeostase. Com estes métodos DA homeostase de vários ratos transgénicos ou modelos de doença pode ser caracterizado e descrito. Estas ferramentas foram implementadas e optimizadas e são de uso padrão em nossos laboratórios. Ensaios atuais têm servido para investigar as consequências sobre a homeostase de alterar o C-terminal da DAT14 ou expressam a recombinase Cre sob a Tirosina Hidroxilase (TH) promotor 5.

<table><tbody><tr><td>Inibidor de COMT</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha</td><td>RO-41-0960</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr> <tr><td>[3H] -Dopamina</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA</td><td>NET67-3001MC</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Filtros de microfibra de vidro</td><td>GF / C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>HiSafe Líquido de cintilação</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossômico</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Para o protocolo de captação de DA sinaptossômico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Para o protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Para o protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Para o protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Desipramina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Para captação de DA sinaptossomal protocolo</td></tr><tr><td>Dopamina</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Cocaína</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Matriz cerebral</td><td>Instrumentos ASI</td><td>RBM2000C</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal</td></tr><tr><td>Disruptor mecânico de teflon Cafano</td><td>Buch & Holm</td><td>Descontinuado</td><td>Para protocolo de captação de DA sinaptossomal (homogeneização)</td></tr><tr><td>Antec Decade (Detector amperométrico)</td><td>Antec, Leiden, Holanda</td><td>Descontinuado: novo modelo DECADE Elite / Lite&trade; Detector eletroquímico tipo 175 e 176</td><td>Para protocolo HPLC</td></tr><tr><td>Avantec 0,22 &mu; filtro de vidro m</td><td>Frisenette ApS, Dinamarca</td><td>13CP020AS</td><td>Para protocolo HPLC</td></tr><tr><td>Coluna: Prodigy 3 &mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Alemanha</td><td>Número da peça: 00A-3300-E0</td><td>Para o protocolo da</td></tr><tr><td>HPLC Software da solução do LC</td><td>Estação de trabalho da série de Shimadzu LabSolutions</td><td>Para o protocolo da HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Ácido de Perchlor 0.1M</td><td>Fluka Analítico</td><td>35418-500ml</td><td>Para o protocolo da HPLC (preparação do tecido)</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Para o protocolo</td></tr> <tr><td>da HPLCNatriumdihidrogenofosfato</td><td>Bie& Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Para protocolo de HPLC</td></tr><tr><td>Monohidrato de sódio 1-octanesulfonate</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Para protocolo de HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile, grau de HPLC isocrático</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Para protocolo de HPLC</td></tr><tr><td>Filtre 0.22um</td><td>Frisenette ApS, Dinamarca</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Para protocolo de HPLC (preparação de tecido)</td></tr> <tr><td>ácido orto-fosfórico 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000ml</td><td>Para protocolo de HPLC</td></tr><tr><td>Eletrodo Antec</td><td>, Leiden, Holanda</td><td>AN1161300</td><td>Para protocolo de HPLC (ver manual online)</td></tr><tr><td>Programa de detector no detector eletroquímico DECADE II</td><td>Antec, Leiden, Holanda</td><td>Lite&trade; Tipo eletroquímico 175 e 176 do detector</td><td>para o protocolo da HPLC</td></tr></tbody></table>

avaliação da homeostase dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina synaptosomal

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora, controlando a atividade motora, processos de recompensa e função cognitiva. Comprometimento da neurotransmissão dopaminérgico (DAergic) é fortemente associado com várias doenças associadas a sistema nervoso central, tais como a doença de Parkinson, transtorno déficit-hiperatividade e dependência de drogas1,2 ,3,4. Delinear os mecanismos de doença que envolvem o desequilíbrio DA é criticamente dependente de modelos animais para imitar os aspectos das doenças, e assim protocolos que avaliam a partes específicas do DA homeostase são importantes para fornecer novos insights e possível terapêutico alvos para estas doenças.
Aqui, apresentamos dois protocolos experimentais úteis que quando combinados fornecem uma leitura funcional do sistema de DAergic em camundongos. Parâmetros bioquímicos e funcionais na homeostase DA são obtidos através da avaliação dos níveis DA e de funcionalidade de transporte (DAT) dopamina5. Ao investigar o sistema DA, a capacidade de medir confiantemente níveis endógenos do cérebro de um adulto é essencial. Portanto, apresentamos como realizar a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) no tecido cerebral de ratos para determinar os níveis de DA. Podemos realizar o experimento no tecido do striatum dorsal (dStr) e núcleo accumbens (NAc), mas o método também é apropriado para outras áreas do cérebro DA-inervada.
DAT é essencial para a recaptação para o terminal pré-sináptica, assim, controlar a atividade temporal e espacial de DA. lançado Saber os níveis e a funcionalidade do DAT no striatum é de grande importância na avaliação DA homeostase. Aqui, nós fornecemos um protocolo que permite deduzir simultaneamente informações sobre níveis de superfície e função usando um ensaio de absorção de synaptosomal6 DA.
Atuais métodos combinados com protocolos padrão immunoblotting fornecem o pesquisador com ferramentas relevantes para caracterizar o sistema de DAergic.

Protocolo de captação DA corrente (Figura 1) inclui todas as etapas necessárias para avaliar a funcionalidade do DAT em sinaptossomas de ratos. Nossos dados representativos do método DA absorção (Figura 2) mostra uma curva de saturação com dados não corrigidas (Figura 2B) e ajustados dados (Figura 2A). A curva de saturação mostra captação de ratos tipo selvagem. Geralmen...

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Estamos apresentando duas técnicas neste protocolo. O objetivo da primeira é avaliar a função do transportador de dopamina mediante a medição da captação de dopamina em preparações sinaptossomais. A segunda técnica serve para avaliar os níveis de dopamina em tecidos por meio de análise por HPLC.Estes métodos fornecem parâmetros importantes da homeostase da dopamina ao demonstrar como medir o conteúdo tecidual de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina em camundongos. A principal vantagem dessas técnicas é que elas podem ser realizadas após manipulações in vivo, tais como manipulações quimigenéticas, tratamentos farmacológicos in vivo ou treinamento comportamental dos animais. A demonstração do procedimento de HPLC será feita por Pia Weikop, Professora Associada do Laboratório de Neuropsiquiatria.Para iniciar este procedimento, exponha o crânio cortando a pele e removendo qualquer tecido em excesso. Em seguida, corte o crânio ao longo da sutura sagital, até a região anterior. Posicione as pontas da tesoura nos olhos e remova o crânio remanescente cortando através dele.Remova rapidamente o cérebro e coloque-o em PBS gelado. Em seguida, utilizando uma matriz cerebral, dissecione uma fatia coronal de três milímetros do estriado. Prossiga com uma dissecação mais fina usando uma punção.Posteriormente, transfira os tecidos para um tubo microcentrífugo de 1,5 milímetro para pesagem. Em seguida, repita os procedimentos para o segundo cérebro. Uma vez que o peso tenha sido obtido para ambos os cérebros, transfira os tecidos para um tubo de homogenização contendo um mililitro de tampão de homogenização gelado.Em seguida, homogeneíze o tecido utilizando um pistilo acionado por motor. Depois, transfira o homogenato para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e recolha o homogenato remanescente do vidro de homogeneização lavando-o com 0,5 mililitros de tampão de homogeneização adicional. A seguir, pelletize os núcleos e os detritos celulares por centrifugação.Em seguida, transfira o sobrenadante contendo as membranas celulares e o citoplasma para novos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e centrifugue por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois, descarte o sobrenadante contendo o citoplasma e re-suspenda o pellet contendo sinaptossomos brutos em 40 microlitros por miligrama de tecido em tampão de homogeneização. Nesta etapa, adicione 440 microlitros de tampão de captação, ligante e cocaína a 12 tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro designados e 440 microlitros de tampão de captação e ligante aos 36 tubos microcentrífugos restantes de 1,5 mililitro.Rotule seis tubos de microcentrífuga de dois mililitros como 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 e 0,31. Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de captação e ligante aos cinco tubos de microcentrífuga com os menores números. Depois, adicione 1.455,4 microlitros de tampão de captação e ligante, 14,6 microlitros de dopamina não marcada e 30 microlitros de dopamina tritiada ao tubo rotulado 10.Em seguida, transfira 750 microlitros da mistura do tubo rotulado como 10 para o tubo rotulado como 5. Misture bem e transfira 750 microlitros da mistura deste tubo para o tubo rotulado como 2,5. Repita essa diluição com os tubos restantes.Em seguida, pré-lave os filtros de microfibra de vidro com quatro mililitros de tampão de captação após colocá-los em um suporte de filtro de 12 poços. A seguir, adicione 10 microlitros da suspensão de membranas sinaptossomais aos primeiros 24 tubos microcêntrifugos de 1,5 mililitro contendo 440 microlitros de tampão. Vortexe cuidadosamente e centrifugue brevemente para garantir que os sinaptossomos estejam submersos no tampão.Em seguida, deixe-os a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, adicione 50 microlitros de dopamina de 10 micromolar e cinco micromolar às duas primeiras colunas e deixe-as a 37 graus Celsius por cinco minutos com agitação. Após cinco minutos, interrompa a reação adicionando um mililitro de tampão de captação gelado, repita o procedimento com 2,5 micromolar e 1,25 micromolar e, em seguida, com 0,62 micromolar e 0,31 micromolar.Adicione as amostras aos filtros de microfibra previamente lavados e lave-os com cinco vezes quatro mililitros de tampão de captação gelado. Após as primeiras 12 amostras terem sido adicionadas aos filtros, transfira os filtros para tubos de cintilação. Repita isso com as próximas 12 amostras.Prepare três tubos de contagem máximos colocando um filtro de microfibra no fundo de tubos de cintilação, 49 a 51, e adicionando 25 microlitros da solução máxima de dopamina de 10 micromolar sobre o filtro. Em seguida, deixe todos os 51 tubos de cintilação em uma capela por uma hora. Depois, adicione três mililitros de fluido de cintilação a cada tubo de cintilação e agite vigorosamente em um agitador durante uma hora.Para contar a dopamina tritiada em um contador beta por um minuto, abra o programa e selecione as configurações adequadas. Para a determinação de proteína, utilize um kit padrão de ensaio de proteína BCA, para determinar as concentrações de proteína dos sinaptossomos para ajustes e para comparação adequada da captação entre amostras. Para o preparo do tecido, adicione 500 microlitros de solução de homogenização a cada amostra e homogeneíze todas as amostras usando um homogeneizador ultrarrápido na velocidade máxima por aproximadamente 30 segundos.Mantenha as amostras em água gelada durante a homogeneização. Em seguida, centrifugue as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius, 14.000 × g. Depois disso, transfira aproximadamente 200 microlitros de cada amostra para um filtro de vidro de 0,22 mícron antes de analisar as amostras pelo método EC-HPLC. Para configurar o detector, ajuste a saída para 700 milivolts e a temperatura a 32 graus Celsius no forno do detector.Coloque os frascos no amostrador automático. Crie um programa de faixa utilizando o manual online e adicione o programa de tempo de acordo com a tabela dois. Configure o sistema abrindo o programa.Em seguida, digite o ID do usuário e a senha e clique em OK. Aguarde então a conexão do programa com os instrumentos. Depois, acesse a tabela de lotes e preencha as informações dos dados.Salve o arquivo indo até arquivo, depois clique em salvar arquivo de processamento como, seguido por salvar. Em seguida, injete a primeira amostra pressionando iniciar processamento. Posteriormente, vá para a aquisição de dados para acompanhar o cromatograma quando as amostras terminarem.Em seguida, vá para a análise pós-execução do CL e escolha o nome do arquivo. Depois, clique em visualizar. Na barra de integração manual, adicione todos os picos a serem integrados e, então, vá para o relatório de dados e imprima o resultado.Após o programa ter sido adicionado ao detector, faça uma curva de calibração de três pontos injetando o padrão preparado em cinco, 10 e 15 microlitros. Nesta figura, os dados representativos mostram a curva de saturação da captação de dopamina por meio do transportador de dopamina a partir de preparações sinaptossomais de camundongos selvagens. Os pontos pretos são os valores dos quatro camundongos mostrados separadamente.A curva verde mostra como os dados normalmente seriam representados ao combinar dados de quatro a seis camundongos por grupo. Aqui está o gráfico de saturação dos dados brutos antes do ajuste pela concentração real de proteína das amostras. Este gráfico mostra as contagens das amostras contendo cocaína, que são usadas para subtrair o fundo dos dados de captação.Este controle é essencial para determinar a confiabilidade dos dados de captação. Este histograma mostra a capacidade de captação do transportador de dopamina e este histograma mostra que a Km para o transportador de dopamina é de 0,1 mais ou menos 0,03 micromolar, o que corresponde bem ao método de voltametria com disco rotativo, que descreve valores de Km do transportador de dopamina entre 0,6 e 1,2 micromolar. Ao realizar o procedimento óptico sinaptossomal, é importante manter o tecido sempre em gelo durante a preparação dos sinaptossomos.Após o ensaio de captação de dopamina em sinaptossomos, procedimentos adicionais, como o ensaio de biotinilação de superfície, podem ser realizados para determinar se uma captação de dopamina alterada pode ser explicada por uma expressão alterada do transportador de dopamina na superfície celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar a homeostase da dopamina em camundongos, avaliando a funcionalidade do transportador de dopamina e os níveis de dopamina em preparações de tecido estriatal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo para a realização unilaterais 6-OHDA lesões do feixe prosencéfalo medial em ratinhos é descrito. Este método tem uma baixa taxa de mortalidade (13,3%) com 89% dos animais sobreviventes mostrando&gt; perda de 95% da dopamina do estriado e 90,63 ± -4,02% viés ipsiversive rotacional para o lado da lesão.

Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.

Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Este vídeo demonstra a avaliação da captação de dopamina em sinaptossomos colhidos de cérebros de camundongos. Ele descreve as etapas para preparar os sinaptossomos para a captação de dopamina por meio de transportadores de dopamina, tratando-os com concentrações variadas de dopamina radiomarcada, isolando os sinaptossomos e medindo a radioatividade para quantificar a captação de dopamina.

Medindo a captação de dopamina em sinaptossomos cerebrais de camundongos usando dopamina radiomarcada

Nos distúrbios da doença de Parkinson e de movimento, em geral, os ensaios comportamentais sensíveis e fiáveis ​​são essenciais para testar novas terapêuticas potenciais. Aqui, descrevemos uma bateria gerenciável de testes sensório-motores para os ratos que são sensíveis a diferentes graus de lesão no sistema nigroestriatal e útil para estudos pré-clínicos.

Avaliação da função sensório-motora em rato modelos de doença de Parkinson

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA)...

Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.

Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Aprenda a avaliar a homeostase dopaminérgica em camundongos usando captura sinaptosomal de dopamina e análise por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Esses métodos permitem medir o conteúdo tecidual de dopamina e a funcionalidade do transportador após manipulações in vivo.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

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