Name: Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a avaliar anticorpos Anti-Neu5Gc IgG em soros humanos usando ensaio de microarray de sialoglicano de alta vazão. Este método avança pesquisas em glicoimunologia e diagnóstico de câncer.

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Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Prêmio de Pesquisa de Desenvolvimento de Carreira do Israel Cancer Research Fund, uma concessão da Iniciativa Nacional de Nanotecnologia de Israel e Helmsley Charitable Trust para uma Área de Tecnologia Focal em Nanomedicines para Teranostics Personalizados (VP-K) e National Institutos de saúde concedem R01GM076360 (para XC).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Uma fabricação de microarrays de glicano bem-sucedida requer um planejamento cuidadoso e inclui várias etapas importantes no protocolo. Estes incluem: (1) planejar os layouts de blocos e placas que definem todos os parâmetros subseqüentes ( por exemplo, distâncias, espaçamento, quantidade de amostras e impressão); (2) limpar os pinos e garantir a integridade do pino, o que é crítico para controlar a homogeneidade do ponto; (3) mantendo alta umidade durante a impressão, crítica para evitar a evaporação da amostr...

Sias são açúcares ácidos que cobrem as cadeias de glicano nas glicoproteínas de superfície celular e glicolípidos em vertebrados. A expressão de Sia é modificada em células cancerosas 1 e correlaciona-se com progressão e / ou metástase 2 , 3 . Duas das principais formas Sia em mamíferos são Neu5Ac e sua forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Os seres humanos não podem sintetizar Neu5Gc devido a uma inativação específica do gene que codifica a enzima CMAH. Este Sia não-humano incorpora metabólicamente em células humanas como &quot;auto&quot;, provenientes de alimentos ricos em minerais Neu5Gc ( por exemplo, carne vermelha) 4 , 5 . Neu5Gc está presente em níveis baixos nas superfícies celulares do epitélio humano e do endotélio, mas especialmente se acumula em carcinomas. Neu5Gc é reconhecido como estrangeiro pelo sistema imunológico humoral humano 2 , 6 .A complexidade antigênica de Neu5Gc-glycan pode surgir em vários níveis, incluindo modificação de Neu5Gc, ligação, glicanos subjacentes e andaimes e sua densidade, tudo refletido pela complexidade da resposta de anticorpos anti-Neu5Gc em seres humanos 6 . Alguns desses anticorpos servem como biomarcadores de carcinoma e potencial imunoterapêuticos 7 . O advento da síntese quimiomenzima de diferentes sialoglicanos 8 abriu caminho para a análise mais aprofundada de tais anticorpos, facilitada pelo uso de tecnologia de microarray de glicano 9 , 10 . Assim, com a preparação e manipulação facilitadas de grandes bibliotecas de carboidratos naturais e sintéticos, as microarrays de glicano tornaram-se uma poderosa tecnologia de alto débito para investigar as interações de carboidratos com uma miríade de biomoléculas 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . Em um formato de matriz, são utilizadas quantidades mínimas de materiais e esta exibição multivalente de glicanos biologicamente relevantes permite a investigação de milhares de interações de ligação em um único experimento. Importante, esta tecnologia também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao monitoramento de respostas imunes em várias amostras 7 , 12 . A fabricação bem-sucedida de microarray de glicano requer a consideração de três aspectos importantes: o tipo de robô de impressora, química de conjugação de glicano e ótica de detecção. Quanto à consideração do instrumento de impressão, duas técnicas estão disponíveis: impressoras de contato e sem contato. Em impressão de contato, os pinos de aço 1-48 são mergulhados em uma placa de fonte de vários poços contendo solução de glicano e são manchados em lâminas de vidro funcionalizadas, contactando diretamente a superfície deslizante de vidro. A quantidade da solução é deO fator do slide é uma função da duração persistente na superfície deslizante. Geralmente, as amostras são primeiro pré-manchadas em um bloco de vidro (para alcançar manchas homogêneas) antes de serem impressas na superfície deslizante. Em impressoras sem contato ( por exemplo, a impressora piezoelétrica), os glicanos são impressos a partir de um capilar de vidro usando sinais elétricos controlados. O sinal elétrico pode ser finamente calibrado para obter uma impressão mais precisa em relação à impressão de contato. O tamanho e a morfologia das manchas também são relativamente mais homogêneas. Uma vantagem adicional é a reciclagem da amostra de volta para a placa de origem após a impressão. No entanto, a principal desvantagem das impressoras piezoelétricas é a limitação da tipagem de impressão (4 ou 8), resultando em uma duração de impressão muito longa, o que requer atenção especial para a estabilidade do slide, a temperatura, a umidade e a evaporação da amostra. A impressora a jato de tinta sem contato requer volumes de amostra maiores 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; Em contraste com as opções disponíveis limitadas para métodos de impressão, a química de conjugação de glicano é uma consideração mais complexa, com muitas opções para escolher. A química de imobilização selecionada deve explicar os grupos ativos nos glicanos e a reatividade da superfície deslizante. Os glicanos a serem imobilizados sobre uma superfície de microarrays específica, sinteticamente sintetizada ou naturalmente isolada, exigem um grupo reativo idêntico. Além disso, os glicanos precisam ser puros e homogêneos. Por outro lado, a superfície de imobilização e a química devem proporcionar reprodutibilidade e densidade de ligação confiável. Múltiplos métodos de imobilização foram desenvolvidos com a inclusão covalente ou não covalente (absorção física) 10 , 11 , 12 , 13 . Para obter informações altamente detalhadas sobre a tecnologia impressa de microarray de glicano para os não iniciadosInvestigador, consulte estas excelentes críticas 13 , 15 . Importante, as informações mínimas recentes exigidas para uma iniciativa Glycomics Experiment (MIRAGE) descrevem diretrizes para a preparação de amostras 16 e para relatar dados de análises de microarrays de glicanos 17 para melhorar os padrões neste campo em crescimento. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a fabricação de microarrays de sialoglicano usando uma nano-impressora de contato específico em um formato de 16 poços. Cada um dos glicanos possui uma amina primária que medeia a sua ligação covalente para lâminas de vidro activadas com epóxi. Também descrevemos o desenvolvimento e a análise de um slide usando várias amostras de soros humanos, anticorpos e lectinas de plantas vinculativas de Sia. Os ensaios de microarrays de Sialoglycan envolvem várias etapas principais que incluem fabricação, processamento, desenvolvimento e análise de matrizes. A fabricação de matrizes exige planejar o arLayout de raios, preparando os glicanos e a placa fonte, programando a nano-impressora e imprimindo as lâminas. Posteriormente, os slides são processados, desenvolvidos e analisados ​​( Figura 1 ).

<table><tbody><tr><td>Amina primária contendo sialoglycans</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, EUA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Entre em contato info@glycohubusa.com para solicitações de compostos</td><td>Glicanos impressos</td></tr><tr><td>Fosfato monossódico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Componente tampão de impressão</td></tr><tr><td>Fosfato dissódico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Componente tampão de impressão</td></tr><tr><td>Fosfato solução salina tamponada</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Tampão de impressão/incubação/tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagente bloqueador de lâminas</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>Sigma G-7893</td><td>Componente tampão de impressão</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Reagente bloqueador de lâminas</td></tr><tr><td>Ovalbumina (Grau V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Proteína de bloqueio de slides</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Detergente de lavagem deslizante</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marcador na matriz</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, molécula inteira</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Componente de impressão</td></tr><tr><td>Biotinilado- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Lectina vegetal &ndash; ligação Sia-alpha2&ndash; 6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant Lectin &ndash; binding Sia-alpha2&ndash; 3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Detecção primária</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Ligação à biotina</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Detecção secundária contra IgG humano</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secundário detecção contra amostras de soro humano IgY de frango</td></tr><tr><td></td><td>Banco de</td><td></td> sangue <td>israelense Detecção primária</td></tr><tr><td>Nitrogênio comprimido (Grau 5)</td><td></td><td></td><td>Ferramenta geral de espanagem/secagem</td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com epóxi</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Lâminas</td></tr><tr><td>Revestidas com epóxi</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slides. Neste tipo de lâminas, a superfície é mais hidrofóbica (em comparação com as lâminas de retirada do núcleo), portanto, o tampão de impressão de glicanos precisaria ser complementado com 0,005% de Tween-20 para obter 100 &micro; Manchas de tamanho M.</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 384 poços</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Placa de impressão</td></tr><tr><td>Marcador de laboratório VWR</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Etiquetagem de lâminas</td></tr><tr><td>Matriz de tubos de coloração</td><td>MST</td><td></td><td>Ferramenta de revelação de lâminas</td></tr><tr><td>Banho de coloração</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Ferramenta de revelação de lâminas</td></tr><tr><td>Suportes de vidro de lâminas</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Ferramenta</td></tr> <tr><td>de revelação de lâminasGenePix Scanner</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>4000B</td><td>Scanner de slides</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Array impressora</td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Pinos de impressão</td></tr><tr><td>ProPlate Module</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Módulo de desenvolvimento de slides</td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Necessário para arrayer e umidificador</td></tr><tr><td>Multi Pippete eletrônico, 8 canais, faixa de volume 2-125 &mu; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete para descarte de amostras em placa de 384 poços</td></tr></tbody></table>

perfis anti-neu5gc igg em sera humana com um ensaio de microarray de sialoglicano

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

As células são cobertas com um manto de cadeias de carboidratos (glicanos) que é comumente alterado em câncer e que inclui variações na expressão do ácido siálico (Sia). Estes são os açúcares ácidos que possuem uma espinha dorsal de 9 carbonos e que captam vertebrados de glicanos nas superfícies celulares. Duas das principais formas Sia em mamíferos são o ácido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e sua forma hidroxilada, ácido N- glicolneuraminico (Neu5Gc). Os seres humanos não podem produzir Neu5Gc endógeno devido à inativação do gene que codifica a hidroxilase de cianina 5&#39;-monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). O Neu5Gc estrangeiro é adquirido por células humanas através do consumo dietético de carne vermelha e produtos lácteos e, posteriormente, aparece em glicanos diversos na superfície celular, acumulando-se principalmente em carcinomas. Consequentemente, os seres humanos possuem anticorpos anti-Neu5Gc circulantes que desempenham vários papéis no câncer e outras doenças mediadas por inflamação crônica e que estão se tornando potenciais diagnósticos e terapêuticosRgets. Aqui, descrevemos um ensaio de microarrays de sialoglicano de alto rendimento para avaliar esses anticorpos anti-Neu5Gc nos soros humanos. Os glicanos que contêm Neu5Gc e seus pares de controles correspondentes (glicanos contendo Neu5Ac), cada um com uma amina primária do núcleo, estão ligados covalentemente a lâminas de vidro revestidas com epóxi. Nós exemplificamos a impressão de 56 slides em um formato de 16 poços usando uma nano-impressora específica capaz de gerar até 896 arrays por impressão. Cada slide pode ser usado para exibir 16 amostras de soros humanos diferentes para a avaliação da especificidade, intensidade e diversidade de anticorpos anti-Neu5Gc. O protocolo descreve a complexidade desta ferramenta robusta e fornece uma orientação básica para aqueles que visam investigar a resposta ao antígeno de carboidratos dietéticos Neu5Gc em diversas amostras clínicas em um formato de matriz.

Array Printing, Development and Analysis: A impressão de um microarray de sialoglicano com múltiplas amostras de glicano e curvas de IgG STD humanas em 16 blocos diferentes requer uma calibração completa para garantir que todas as amostras sejam impressas o mais uniformemente possível em todos os 16 blocos por slide e para todos os slides na mesma execução de impressão. Portanto, são necessários vários experimentos de calibração ...

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

O objetivo geral do ensaio de microarray de sialoglicanos é avaliar a IgG Anti-Neu5Gc em soros humanos de maneira de alto rendimento contra uma coleção diversificada de sialoglicanos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da glicoimunologia, como a forma como os anticorpos anti-Neu5Gc estão envolvidos com várias doenças humanas, incluindo câncer, doenças cardíacas e xenotransplante. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o perfil de alto rendimento de anticorpos anti-Neu5Gc contra uma miríade de antígenos sialoglicanos.Demonstrando o procedimento estará Sharon Yehuda, uma estudante de mestrado do meu laboratório. O planejamento cuidadoso e detalhado da fabricação e layout da matriz é importante para garantir o sucesso. Este processo é detalhado no protocolo de texto e nas informações complementares.Dilua cada glicano a 100 micromolares em um volume total de 100 microlitros de tampão de impressão de glicano em tubos de microcentrífuga. Em seguida, prepare a amina primária contendo corante fluorescente a um miligrama por milímetro com tampão marcador. Em seguida, dilua para um micrograma por mililitro em um volume total de um mililitro.Preparar d

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

Este trabalho mostra o potencial da tecnologia de matriz (PGA) glicano impressa para a análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação.

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

O desfecho primário em ensaios clínicos para doenças neuromusculares é geralmente melhora da função muscular. Portanto, avaliar o efeito de potenciais compostos terapêuticos sobre o desempenho muscular pré clinicamente em modelos do rato é de grande importância. Nós aqui descrever vários testes funcionais para resolver esta questão.

Avaliação do Desempenho Funcional no<em&gt; Mdx</em&gt; Mouse Modelo

Aprenda a avaliar anticorpos Anti-Neu5Gc IgG em soros humanos usando ensaio de microarray de sialoglicano de alta vazão. Este método avança pesquisas em glicoimunologia e diagnóstico de câncer.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

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