Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

O objetivo geral do ensaio de microarray de sialoglicanos é avaliar a IgG Anti-Neu5Gc em soros humanos de maneira de alto rendimento contra uma coleção diversificada de sialoglicanos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da glicoimunologia, como a forma como os anticorpos anti-Neu5Gc estão envolvidos com várias doenças humanas, incluindo câncer, doenças cardíacas e xenotransplante. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o perfil de alto rendimento de anticorpos anti-Neu5Gc contra uma miríade de antígenos sialoglicanos.

Demonstrando o procedimento estará Sharon Yehuda, uma estudante de mestrado do meu laboratório. O planejamento cuidadoso e detalhado da fabricação e layout da matriz é importante para garantir o sucesso. Este processo é detalhado no protocolo de texto e nas informações complementares.

Dilua cada glicano a 100 micromolares em um volume total de 100 microlitros de tampão de impressão de glicano em tubos de microcentrífuga. Em seguida, prepare a amina primária contendo corante fluorescente a um miligrama por milímetro com tampão marcador. Em seguida, dilua para um micrograma por mililitro em um volume total de um mililitro.

Preparar diluições da curva padrão de IgG humana conforme descrito no protocolo de texto. Coloque a placa de 384 poços no gelo. Usando uma multipipeta eletrônica, alíquota de sete microlitros de cada glicano, marcador e curva padrão IgG de acordo com o layout da placa encontrado no protocolo de texto.

Cubra a placa com parafilme e gire para baixo por dois minutos a 250 vezes g e 12 graus Celsius. A impressão deve ser realizada em local livre de poeira com umidade de 60 a 70%Aqui, todas as etapas são realizadas em uma sala limpa com luvas e roupas adequadas para proteção. Ligue a máquina de impressora nano e o umidificador.

Depois de programar a máquina de impressão conforme descrito no protocolo de texto, posicione a placa de 384 poços com amostras aliquotadas em seu local no deck do arrayer e remova a tampa do parafilme. Neste ponto, comece a imprimir. Numere as lâminas com uma caneta marcadora resistente a solventes de álcool e guarde-as em uma caixa selada a vácuo no escuro.

Para processar as matrizes, primeiro remova uma lâmina da caixa selada a vácuo e coloque-a em uma capa química por cinco minutos, com a matriz voltada para cima, para evaporar o excesso de líquido. Em seguida, hidrate a lâmina colocando-a em um tubo de coloração cheio de água deionizada. Cubra o tubo com papel alumínio e incube por cinco minutos com agitação lenta e suave à temperatura ambiente.

Para bloquear os grupos epóxi reativos na lâmina, mergulhe a lâmina no tubo de coloração de 50 mililitros cheio de solução de bloqueio de etanolamina pré-aquecida. Cubra o tubo com papel alumínio e incube por 30 minutos com agitação lenta e suave em temperatura ambiente. Descarte a solução de bloqueio de etanolamina no recipiente de lixo de risco biológico apropriado.

Em seguida, coloque a lâmina em um tubo de coloração novo e limpo, cheio de água deionizada a 50 graus Celsius. Cubra o tubo com papel alumínio e incube por 10 minutos com agitação lenta e suave em temperatura ambiente. Descarte a água e transfira as lâminas para um porta-manchas de vidro.

Coloque o aparelho em um suporte de placa oscilante e centrifugue a lâmina para secar. Em seguida, coloque a lâmina em uma divisória de 16 poços. Depois de pré-umedecer os poços, use uma multipipeta para alíquota de 200 microlitros de PBST nos poços de lâminas.

Em seguida, coloque-os em uma câmara coberta e úmida e agite por cinco minutos. Remova o PBST sacudindo e batendo suavemente em uma toalha de papel limpa. Em seguida, alíquota de 200 microlitros de tampão de bloqueio de PBS-Ovalbumina em cada poço.

Coloque as lâminas em uma câmara úmida e incube por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, prepare a detecção primária, diluída no buffer de bloqueio PBS-OVA, conforme descrito no protocolo de texto. Retire o tampão de bloqueio PBS-OVA da lâmina e adicione 200 microlitros de anticorpo primário por poço.

Incubar as lâminas em uma câmara úmida por duas horas. Em seguida, retire a detecção primária da lâmina e lave três vezes com PBST. Incubar a lâmina em PBST durante cinco minutos numa câmara húmida antes de lavar uma última vez com PBST.

Em seguida, lave uma vez com PBS. Em seguida, prepare o anticorpo secundário em PBS conforme descrito no protocolo de texto. Retire o PBS da lâmina e adicione 200 microlitros de anticorpo secundário.

Retire o anticorpo secundário da lâmina e lave quatro vezes com PBST como antes. Remova cuidadosamente a estrutura e, em seguida, coloque as lâminas em um tubo de coloração de 50 mililitros cheio de PBS e agite por cinco minutos. Em seguida, encha dois banhos de coloração de lâminas com água deionizada.

Coloque a corrediça no suporte da corrediça e mergulhe a corrediça no primeiro banho. Mergulhe rapidamente o slide dez vezes. Em seguida, transfira a lâmina para o segundo banho e mergulhe mais dez vezes.

Após a imersão, incube a lâmina por dez minutos em temperatura ambiente com agitação. Após a incubação, descarte a água e transfira a lâmina para um porta-manchas de vidro. Coloque o porta-manchas de vidro em um suporte de placa oscilante e centrifugue a lâmina para secar.

Abra a porta do scanner e coloque a lâmina dentro, com a matriz voltada para baixo. Neste ponto, inicie a digitalização. Salve os slides digitalizados como um arquivo TIFF.

Para preparar um slide para análise, selecione Load Array List" e carregue o arquivo GAL apropriado que mapeia as matrizes em cada bloco no slide. As lâminas foram desenvolvidas com 16 diferentes porções de detecção primária, uma em cada bloco. A planta Lectin SNA se liga ao ácido siálico ligado a a2-6.

Considerando que a planta Lectin MALII se liga ao ácido siálico ligado a a2-3. A IgY anti-Neu5Gc policlonal liga-se aos sialoglicanos contendo Neu5Gc, mas não se liga aos sialoglicanos contendo Neu5Ac. Para traçar o perfil de IgG anti-Neu5Gc, 12 soros de doadores humanos saudáveis foram analisados no microarray de sialoglicano impresso e desenvolvidos usando IgG anti-humana marcada com fluorescência em normalizado para nanogramas por microlitro.

Todos os soros humanos testados continham vários níveis de IgG Anti-Neu5Gc com quase nenhum reconhecimento dos pares correspondentes de sialoglicanos contendo Neu5Ac. Além disso, os padrões de reconhecimento de IgG anti-Neu5Gc são altamente diversos entre esses 12 soros diferentes, tanto no nível de intensidade quanto na diversidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como traçar o perfil dos anticorpos Anti-Neu5Gc em várias amostras humanas de maneira de alto rendimento, usando um sistema de microarray de glicano.