Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

O objetivo geral deste método é fornecer um procedimento de coloração TEM negativo simples e eficaz para amostras virais dentro da biocontenção. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em virologia sobre a morfologia e as estruturas dos vírus que estão sendo investigados. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece manuseio fácil e eficaz de grades de microscopia eletrônica em ambientes de biocontenção.

Esta técnica é usada como parte do diagnóstico TEM de um vírus desconhecido porque pode ser facilmente aplicada a amostras virais em todos os ambientes. Embora tenhamos usado esse método principalmente para auxiliar nos estudos de TEM de vírus, ele tem uma aplicação muito mais ampla e pode ser usado na investigação EM da maioria das nanopartículas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é preciso alguma prática para garantir que as grades TEM não sejam danificadas quando carregadas e descarregadas das cápsulas.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos tendo problemas para lidar com pequenas grades EM em biocontenção. Para iniciar este procedimento, prepare ou compre grades de cobre TEM virais e revestidas de carbono. Insira as grades MET revestidas em cápsulas.

Em seguida, transfira as cápsulas carregadas junto com outros suprimentos e reagentes para a biocontenção. Para começar, coloque a cápsula em uma pipeta. Aspire 40 microlitros de expansão do vírus para dentro da cápsula.

Coloque a pipeta de lado, com as grades orientadas horizontalmente por 10 minutos. Em seguida, pegue a pipeta e dispense a solução do vírus em uma contenção de resíduos. Aspire 40 microlitros de fixador de glutaraldeído a 2% nas cápsulas.

Coloque a pipeta de lado por 20 minutos. Em seguida, expulse o fixador e aspire 40 microlitros de água desionizada para dentro da cápsula, para lavar o fixador. Repita esta lavagem três vezes.

Em seguida, aspire 40 microlitros de acetato de uranila a 1% ou ácido fosfotúngstico a 1% de potássio na cápsula. Deixe a cápsula descansar por 30 segundos. Em seguida, remova a cápsula da pipeta.

Toque um pedaço de papel de filtro na borda das grades para secar. Transfira o papel de filtro para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, mergulhe o papel de filtro em solução de tetróxido de ósmio a 1%.

Coloque a cápsula com a tampa aberta no tubo. Sele o tubo por uma hora para permitir a permeação completa do vapor de tetróxido de ósmio. Depois disso, descontamine o tubo e transfira-o da biocontenção para a instalação BSL-2 EM.

Remova a cápsula do tubo de centrífuga e coloque-a em uma pipeta. Aspire 40 microlitros de água desionizada para a cápsula e, em seguida, distribua a água para um recipiente de resíduos. Repita esta lavagem com água três vezes.

Em seguida, remova a cápsula da pipeta. Usando papel de filtro, seque as grades. Deixe as grades secarem ao ar e armazene-as em uma caixa de grade, até que estejam prontas para realizar a imagem MET.

Para começar, misture a suspensão do vírus com um volume igual de 4% de glutaraldeído, para obter uma concentração final de 2% de glutaraldeído. Usando fixador, inative o vírus por pelo menos 24 horas. Descontamine o tubo e transfira-o para a instalação BLS-2 EM.

Depois disso, conecte uma captura carregada em grade a uma pipeta. Aspire a mistura para a cápsula. Coloque a pipeta de lado com as grades orientadas horizontalmente por 10 minutos.

Em seguida, pegue a pipeta e expulse a mistura de vírus em um recipiente de lixo. Aspire 40 microlitros de água desionizada para a cápsula e depois descarte a água em um recipiente de lixo. Repita esta lavagem três vezes.

Depois disso, aspire 40 microlitros de 1% de QA ou 1% de PTA na cápsula por 30 segundos. Remova a cápsula da pipeta. Usando papel de filtro, seque as grades.

Em seguida, deixe as grades secarem ao ar. Neste estudo, as amostras do vírus Ebola do Zaire sofrem coloração negativa, usando o método de gotículas manuais e o método da cápsula. As imagens TEM geradas a partir desses métodos mostram detalhes claramente definidos, com estruturas de nucleocapsídeo no centro da variante e glicoproteínas visíveis na superfície.

Assim, o método da cápsula é capaz de produzir imagens MET de qualidade semelhante às produzidas pelo método de gotículas manuais. Em seguida, diferentes métodos de inativação de amostras são comparados usando o vírus Chikungunya. A inativação da amostra é obtida rapidamente, usando 2% de glutaraldeído por 20 minutos com exposição subsequente ao tetróxido de 1% de ósmio por uma hora, ou durante a noite, usando 2% de glutaraldeído por 24 horas.

Como pode ser visto, o processo de inativação mais longo sem tetróxido de ósmio permite que mais detalhes ultraestruturais sejam vistos. Em seguida, utilizando o método da cápsula, duas colorações foram comparadas usando partículas semelhantes a vírus fixadas em aldeído. Tanto o acetato de uranila quanto o ácido fosfotúngstico apresentam resultados de alta qualidade, com bordas claramente definidas e glicoproteínas visíveis.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora e meia, dependendo do número de amostras. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar reagentes fixadores e de coloração adequados para seus objetivos experimentais. Seguindo este procedimento, outros métodos, como contagem de partículas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais calculando as concentrações de vírus.

Essa técnica melhora a maneira como os virologistas podem explorar a morfologia do vírus e estruturar as informações com maior facilidade, especialmente em vírus de nível BLS-3 e 4. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como lidar facilmente com grades TEM para coloração negativa dentro da biocontenção. Não se esqueça de que trabalhar com aldeído, tetróxido de ósmio e acetato de uranila pode ser extremamente perigoso e precauções como equipamento de proteção individual adequado e uma capela de exaustão química devem sempre ser usadas durante a execução deste procedimento.