Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

O objetivo geral deste método é fornecer um procedimento simples e eficaz de coloração negativa em MET para amostras virais dentro de ambientes de contenção biológica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em virologia sobre a morfologia e as estruturas dos vírus em estudo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite um manuseio fácil e eficaz das grades de microscopia eletrônica em ambientes de contenção biológica. Esta técnica é útil como parte do diagnóstico em MET de um vírus desconhecido, pois pode ser facilmente aplicada a amostras virais em todos os ambientes. Embora tenhamos utilizado principalmente este método para auxiliar estudos de vírus em MET, ele possui uma aplicação muito mais ampla e pode ser usado na investigação em ME de nanopartículas em geral. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois é necessário algum treinamento para garantir que as grades de MET não sejam danificadas durante o carregamento e descarregamento das cápsulas.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando estávamos tendo dificuldades para manipular pequenas grades de ME em contenção biológica.

Para iniciar este procedimento, prepare ou adquira grades de cobre para MET revestidas com Formvar e carbono. Insira as grades revestidas nos cápsulas. Em seguida, transfira os cápsulas carregados junto com os demais suprimentos e reagentes para contenção biológica. Para começar, fixe o cápsula a uma pipeta. Aspire 40 microlitros de suspensão viral para dentro do cápsula. Coloque a pipeta de lado, com as grades orientadas horizontalmente por 10 minutos. Em seguida, pegue a pipeta e descarte a solução viral em um recipiente de resíduos. Aspire 40 microlitros de fixador de glutaraldeído a 2% para dentro dos cápsulas. Coloque a pipeta de lado por 20 minutos. Após esse período, expulse o fixador e aspire 40 microlitros de água desionizada para dentro do cápsula, a fim de remover o fixador. Repita essa lavagem três vezes.

Em seguida, aspire 40 microlitros de acetato de uranila a 1% ou ácido fosfotungstico de potássio a 1% para dentro da cápsula. Deixe a cápsula repousar por 30 segundos. Em seguida, remova a cápsula da pipeta.

Toque um pedaço de papel-filtro na borda das grades para secar. Transfira o papel-filtro para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, mergulhe o papel-filtro em solução de tetróxido de ósmio a 1%.

Coloque a cápsula com a tampa aberta dentro do tubo. Feche o tubo por uma hora para permitir a permeação completa do vapor de tetróxido de ósmio. Após esse período, descontamine o tubo e transfira-o para fora da contenção biológica até a instalação de microscopia eletrônica em BSL-2.

Retire a cápsula do tubo de centrífuga e, em seguida, coloque-a sobre uma pipeta. Aspire 40 microlitros de água desionizada para dentro da cápsula e então transfira a água para um recipiente de resíduos. Repita essa lavagem com água três vezes.

Em seguida, remova a cápsula da pipeta. Usando papel-filtro, seque as grades por absorção. Deixe as grades secarem ao ar e, em seguida, armazene-as em uma caixa para grades até o momento de realizar a imagem em microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Para começar, misture a suspensão viral com um volume igual de glutaraldeído a 4%, obtendo uma concentração final de glutaraldeído a 2%. Utilizando o fixador, inative o vírus por pelo menos 24 horas. Descontamine o tubo e transfira-o para a instalação de ME em BLS-2. Em seguida, fixe uma grade com captura carregada a uma pipeta. Aspire a mistura para dentro da cápsula. Coloque a pipeta de lado, com as grades orientadas horizontalmente, por 10 minutos.

Em seguida, pegue a pipeta e expulse a mistura viral em um recipiente de resíduos. Aspire 40 microlitros de água desionizada para dentro da cápsula e depois descarte a água em um recipiente de resíduos. Repita essa lavagem três vezes.

Após isso, aspire 40 microlitros de UA 1% ou PTA 1% para dentro da cápsula durante 30 segundos. Remova a cápsula da pipeta. Usando papel-filtro, seque as grades por absorção.

Em seguida, deixe as grades secarem ao ar.

Neste estudo, amostras do vírus Ebola de Zaire passam por coloração negativa, utilizando tanto o método manual de gota quanto o método da cápsula. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) geradas por esses métodos mostram detalhes bem definidos, com estruturas de nucleocapsídeo no centro do virion e glicoproteínas visíveis na superfície. Assim, o método da cápsula é capaz de produzir imagens de MET de qualidade semelhante àquelas obtidas pelo método manual de gota. Em seguida, diferentes métodos de inativação de amostras são comparados utilizando o vírus Chikungunya. A inativação da amostra é realizada de forma rápida, usando glutaraldeído 2% por 20 minutos, seguido de exposição a tetróxido de ósmio 1% por uma hora, ou de forma prolongada, usando glutaraldeído 2% por 24 horas. Como pode ser observado, o processo mais longo de inativação, sem o uso de tetróxido de ósmio, permite visualizar mais detalhes ultraestruturais.

Em seguida, utilizando o método da cápsula, duas colorações foram comparadas usando partículas semelhantes a vírus fixadas com aldeído. Tanto o acetato de uranila quanto o ácido fosfotungstico exibem resultados de alta qualidade, com bordas bem definidas e glicoproteínas visíveis.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora e meia, dependendo do número de amostras. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de selecionar o fixador e os reagentes de coloração adequados para os seus objetivos experimentais. Após este procedimento, outros métodos, como a contagem de partículas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais mediante o cálculo das concentrações virais.

Essa técnica melhora a forma como os virologistas podem explorar informações sobre morfologia e estrutura viral com maior facilidade, especialmente em vírus dos níveis BSL-3 e 4. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular facilmente grades de MET para coloração negativa dentro de contenção biológica. Não se esqueça de que o trabalho com aldeído, tetróxido de ósmio e acetato de uranila pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso adequado de equipamentos de proteção individual e uma capela de exaustão química, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.