Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

O objetivo geral deste protocolo é isolar células intersticiais da válvula de rato ou VICs para estudar os mecanismos da doença valvar aórtica calcificada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da calcificação da válvula, como por que os VICs calcificam e o que podemos evitar que essas células calcifiquem. As principais vantagens desta técnica são a acessibilidade e o potencial de transformação em linhagens celulares para estudos posteriores.

Realizar todas as dissecações em coifa ventilada previamente desinfetada com etanol 70% para garantir a esterilidade das amostras e reagentes. Esterilize as ferramentas de dissecação autoclavando-as, seguidas de imersão das pontas das ferramentas em um béquer contendo 70% de etanol antes do uso. Mergulhe as ferramentas de dissecação em copos de tampão de lavagem antes de entrar em contato com o animal ou tecidos.

Após o abate dos ratos conforme descrito no protocolo de texto, coloque o animal em decúbito dorsal em uma placa de dissecção de vidro e desinfete a pele pulverizando com etanol a 70%. Para dissecar o coração, faça uma incisão de quatro centímetros na linha média do rato com o auxílio de uma tesoura de dissecção para expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente a caixa torácica e os pulmões para expor o coração. Remova o coração com uma tesoura afiada.

Armazene o coração dissecado em tampão de lavagem gelada até que todas as dissecações grosseiras dos ratos estejam completas. Para microdissecar cada coração, transfira o coração dissecado para uma placa de Petri coberta com tampão de lavagem. Apare o músculo cardíaco com uma tesoura reta de mola para ficar à esquerda com uma pequena área ao redor da aorta ascendente e da raiz da aorta.

Usando a mesma tesoura reta de mola, corte cuidadosamente a aorta ascendente em direção ao ventrículo esquerdo e exponha os folhetos da válvula aórtica. Em seguida, transfira a aorta aberta para uma placa de Petri estéril fresca cheia de solução salina balanceada de Hank. Disseque os folhetos da válvula aórtica marcados por sua forma única em U na base da aorta com uma tesoura Vannas.

Armazene todos os folhetos em um mililitro de tampão de lavagem gelada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro até que todas as dissecações estejam completas. Depois de colhidos todos os folhetos, centrifugue-os a 100 g durante um minuto a quatro graus Celsius para remover o tampão de lavagem. Para remover as células endoteliais da válvula ou VECs, digerir os folhetos em 100 microlitros de 425 unidades por mililitro de colagenase II por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Interrompa a digestão pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Centrifugue a 100g por 30 segundos para pellet os folhetos. Depois de descartar cuidadosamente o sobrenadante, lave os folhetos com 500 microlitros de tampão de lavagem e reproduza as células por centrifugação a 100g por 30 segundos.

Para colher os VICs dos folíolos, digerir com 100 microlitros da colagenase II por 1,5 a duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, libere os VICs pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Dilua a colagenase II em 19 mililitros de meio de cultura e centrifugue a 670g por cinco minutos para granular os VICs e os restos restantes do folheto da válvula.

Depois de rejeitar o sobrenadante, transferir os folhetos e os VIC para placas ou balões de cultura. Cultive as VICs por cinco a sete dias em meio de cultura até que a confluência seja atingida a 37 graus Celsius na presença de 5% de CO2, trocando o meio após 72 horas. Para preparar VICs primárias de ratos para experimentos de calcificação in vitro, semeie as células a uma densidade de 150.000 células por poço em placas de seis poços.

Mantenha as células em meio de cultura até mais de 90% de confluência. Trate os VICs com calcificação versus meio de controle e incube a 37 graus Celsius na presença de 5% de CO2 por mais 72 horas. Para estudar as VICs primárias calcificadas de rato para análises subsequentes a jusante, remover a calcificação ou o meio de controle.

Lave as monocamadas com tampão de lavagem para remover os íons de cálcio e fosfato não ligados antes de realizar a caracterização VIC de rato, conforme detalhado no protocolo de texto. Para estudos de calcificação VIC em ratos, corar as monocamadas celulares com solução de Vermelho de Alizarina S a 5%, balançando suavemente em um shaker por 20 minutos. Em seguida, lave três vezes com água destilada por cinco minutos de cada vez.

Para quantificar a deposição de cálcio, use um kit de ensaio bioquímico de cálcio. Sanguessuga de íons de cálcio usando ácido clorídrico 0,6 molar por 24 horas a quatro graus Celsius com agitação suave. Colha o sobrenadante e meça a concentração de cálcio usando um kit de dosagem de cálcio seguindo as diretrizes do fabricante.

Finalmente, calcule a concentração de cálcio como uma fração da proteína celular total, conforme descrito no protocolo de texto. O fenótipo VIC das células isoladas foi confirmado por imunofluorescência, sondando os marcadores VIC, vimentina e actina alfa de músculo liso. Além disso, a expressão do regulador de crescimento VIC, fator de crescimento tecidual beta-1 e 2, foi confirmada por meio de análise de PCR.

A análise de Western blot também foi realizada para verificar se as VICs de ratos foram negativas para o marcador de células endoteliais CD 31, usando VECs mitrais caninas como controle positivo. Os VICs de ratos foram expostos a níveis elevados de cálcio e fosfato, que mimetizam condições patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia. Tratamento de VICs com calcificação induzida por cálcio e fosfato, conforme determinado pela coloração com vermelho de alizarina para deposição de cálcio e determinação colorimétrica dos níveis de cálcio após lixiviação de ácido clorídrico.

O tratamento de VICs com cálcio e fosfato induziu um aumento significativo na expressão de mRNA dos marcadores osteogênicos MSX2, ALPL e PHOSPHO1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma a duas horas, excluindo a digestão de 18 folhetos valvares. Ao tentar este procedimento, é importante garantir a esterilidade durante a dissecção e digestão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar VICs primários de ratos e usá-los para investigar os mecanismos por trás da calcificação do VIC. Após este procedimento, outros métodos como citometria de fluxo e análise de microscopia podem ser realizados para estudar a fisiologia e o comportamento do VIC. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores no campo da pesquisa cardiovascular explorarem os mecanismos de classificação da válvula aórtica em humanos usando o modelo de rato.