Name: Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a isolar células intersticiais valvulares de rato para estudar a calcificação da válvula aórtica. Este método permite investigar os mecanismos celulares e moleculares da doença valvular calcificada em modelo in vitro.

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CD31 anticorpo usado foi um presente generoso do Dr. Karen Tan, Universidade de Edimburgo. Este estudo foi suportado pelo financiamento da biotecnologia e biológicos Sciences Research Council (BBSRC), sob a forma de uma subvenção de programa estratégico do Instituto (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM e CF), um Instituto carreira caminho Fellowship BB/F023928/1 (VEM) e bolsa de estudo financiamento através de um caso de BBSRC Studentship BB/K011618/1 (LC).

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de usuários do Instituto Roslin o Animal, e os animais foram mantidos em conformidade com diretrizes do Home Office (Reino Unido) para o cuidado e o uso de animais. Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 - semana de idade, do sexo masculinos.
1. reagente receitas
<ol><li>Prepare o meio de cultura usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) e mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Adicione 10% esterilizado inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e gentamicina 1%.</li>
	<li>Prepare o meio de calcificação usando meio de cultura e 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.<ol>
<li>Prepare-se 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2) pesando fora 555 mg de CaCl2 e dissolvendo-o em 5 mL de água destilada para completar 5 mL de 1 M CaCl2. Filtre a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução.</li>
		<li>Prepare-se 1 M de fosfato de sódio por pesagem 710 mg anidro fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) e 600 mg de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), dissolvendo cada um separadamente em 5 mL de água destilada água. Combine 3.870 µ l de Na2HPO4 e 1.130 µ l de NaH2PO4e filtro através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem contendo gentamicina solução sal equilibrado (HBSS) e 1% de Hank.</li>
</ol>2. preparação do exaustor de dissecação
<ol><li>Realize todas as dissecções em uma campânula ventilada, previamente desinfectada com álcool 70% para garantir a esterilidade das amostras e reagentes.</li>
	<li>Esterilize instrumentos de dissecação por autoclave-los seguidos por imersão as dicas das ferramentas em um béquer contendo antes de etanol 70% de usar.</li>
	<li>Preparar o béquer contendo tampão de lavagem e mergulhe os instrumentos de dissecação em tampão de lavagem antes de entrar em contacto com o animal ou tecidos. Mantenha o tampão de lavagem no gelo em todos os momentos.</li>
</ol>3. extração de rato primária das vítimas
Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 - semana de idade, do sexo masculinos.
<ol><li>Abater os ratos (~ 100 g) por deslocamento cervical em conformidade com diretrizes de UK Home Office.</li>
	<li>Para dissecar o coração de cada rato, coloque o animal em decúbito dorsal em um tabuleiro de dissecação de vidro e desinfectar a pele por pulverização com etanol a 70%.</li>
	<li>Faça uma incisão de 4 cm na linha média do rato com o auxílio de tesouras de dissecação, para expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente a caixa torácica e os pulmões, para expor o coração.</li>
	<li>Remover o coração com um par de afiada, tesoura curva de primavera e armazenar o coração dissecado em tampão de lavagem frio de gelo até que todas as dissecções brutas dos ratos estão completas.</li>
	<li>Para microdissecar cada coração, transferência, este último em um prato de Petri coberto de tampão de lavagem. Guarnição do músculo cardíaco com uma tesoura reta Primavera (lâmina de 6 mm) para ficar com uma pequena área em torno da aorta ascendente e a raiz da aorta.</li>
	<li>Usando a mesma mola tesoura reta (lâmina de 6 mm), cuidadosamente aberto a aorta ascendente para o ventrículo esquerdo e expor os folhetos da válvula aórtica.</li>
	<li>Transferência da aorta aberta em uma placa de Petri estéril, fresco cheio de HBSS. Disse o folhetos da válvula aórtica, marcado pela sua única forma de 'U' na base da aorta, com um par de capsulotomia Vannas-tipo micro tesoura (lâmina de 3 mm).</li>
	<li>Armazene todos os folhetos em 1 mL de tampão de lavagem frio do gelo, em um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL até todas as dissecções são completas.</li>
	<li>Uma vez que todos os folhetos foram colhidos, centrifugá-los a 100 x g por 1 min a 4 ° C para remover o tampão de lavagem.</li>
	<li>Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura celular para garantir a esterilização. Para remover os VECs, digerir os folhetos em 100 µ l 425 U/mL colagenase II por 5 min a 37 ° C. Perturbar a digestão pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l.</li>
	<li>Centrifugar 100 x g por 30 s para os folhetos de pelotas e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Lave duas vezes com tampão de lavagem 500 µ l e re-pelota as células por centrifugação a 100 x g durante 30 s.</li>
	<li>Para colher as vítimas de folhetos, digerir com 100 µ l de 425 colagenase U/mL II para 2 h e depois solte as vítimas pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l.</li>
	<li>Dilua a colagenase II em 19 mL de meio de cultura e centrifugar a 670 x g por 5 min para as vítimas e restantes detritos de folheto da válvula de Pelotas. Descartar o sobrenadante e transferir folhetos e vítimas para placas/frascos de cultura em conformidade (tabela 1).</li>
	<li>Cultura das vítimas por 5-7 dias em meio de cultura, até confluência é alcançada a 37 ° C, na presença de 5% (dióxido de carbono) CO2, alterando o meio após 72 h. Para posterior utilização em experimentos em vitro , passagem até 5 vezes depois de confluencia atinge 100%.</li>
</ol>4. indução de calcificação das vítimas de rato
Nota: Para todos os experimentos, conte células com um hemocytometer.
<ol><li>Execute todas as célula primária de semeação e de passagem em capas esterilizadas para evitar a contaminação. Para preparar rato primário das vítimas em vitro experiências de calcificação, propagar as células em uma densidade de 150.000 células/poço em placas 6-boas. Manter-se em meio de cultura até confluência ≥ 90% (tipicamente 72 h).</li>
	<li>Tratar as vítimas com calcificação versus meio de controle e incubar a 37 ° C, na presença de 5% CO2, para um adicional 72 h.</li>
	<li>Para estudar o rato primário calcificado VICs para posteriores análises a jusante, retire o meio de calcificação/controle e lave as monocamadas com tampão de lavagem para remover íons de Ca e Pi vinculados.</li>
</ol>5. rato VIC caracterização
<ol><li>Para imunocoloração monitorar para marcadores fenotípicos tais como vimentina e α-SMA, o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas de sementes contendo lamínulas (células vão crescer na superfície das lamínulas) e deixe crescer até a confluência de 50%.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e corrigir as monocamadas de células com paraformaldeído 4% (PFA) durante 10 minutos antes de lavá-los 3 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS), por 5 min cada tempo. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>Incubar a monocamada de células com bloqueio e permeabilização de buffer (1X PBS, 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário, 0,3% Triton X-100) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar as monocamadas de células com anticorpos do rato do anti-α-SMA antivimentina e coelho que diluído em tampão de diluição de anticorpo (albumina de soro bovino 1% + 0,3% Triton X-100 em PBS) durante a noite a 4 ° C, agitando suavemente sobre um roqueiro. Nota: Controlos negativos consistiam em não conjugada mouse IgG e IgG, usando as mesmas diluições como as amostras de teste de coelho.</li>
	<li>No dia seguinte, lave os anticorpos primários 3 vezes com PBS, por 5 min cada tempo.</li>
	<li>Incube as monocamadas de células com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo por 1h à temperatura ambiente, agitando suavemente sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBS e tweeze suavemente para fora as lamelas (que contêm o rato VICs) com um par de pinças e coloque sobre uma lamela contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Deixe os slides para curar pelo menos 24 h a 4 ° C antes de Visualizar com um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Para a análise ocidental do borrão, propagar o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas e deixar crescer em meio de cultura até 100% confluentes.</li>
	<li>Use 8 µ g de proteína para executar um Western blot para medir a expressão do CD31 e descartar qualquer contaminação de VEC. Nota: Um protocolo padrão ocidental do borrão foi seguido conforme descrito anteriormente,9.</li>
	<li>Para estudos de gene, extrair o ácido ribonucleico (RNA), usando um kit comercial, seguindo as orientações do fabricante.</li>
	<li>Obter o cDNA usando a transcrição reversa para medir a expressão dos genes-alvo utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em tempo real (RT-PCR, também conhecida como qPCR) com detecção de fluoróforo verde, utilizando Gapdh como o gene de referência, como anteriormente descreveu a10.<ol>
<li>Use o seguinte programa para análise PCR: 1 ciclo de 94 ° C por 3 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 63 ° C por 30 s, 72 ° C por 35 s e finalmente 1 ciclo de 72 ° C por 5 min.</li>
		<li>Use o seguinte programa para análise de qPCR: 1 ciclo de 95 ° C por 10 min, 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min e um ciclo adicional de 95 ° C por 1 min, a 55 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute uma eletroforese em gel para analisar os produtos de PCR usando um gel de agarose 2% em tampão Tris/borato/EDTA (TBE).</li>
</ol>6. rato VIC calcificação estudos
<ol><li>Por alizarina Red S e estudos bioquímicos de calcificação, siga a propagação e a calcificação diretrizes descritas na seção 4.</li>
	<li>Mancha as monocamadas de células com solução a 5% de vermelho de alizarina S, agite-o suavemente em uma coqueteleira, por 20 min. Posteriormente, lave 3 vezes com água destilada, por 5 min cada tempo. Adquira imagens de cada poço.</li>
	<li>Para quantificar a deposição de Ca, utilize um kit de ensaio Ca bioquímico. Lixiviação de íons Ca2 + usando 0,6 M o ácido clorídrico (HCl) por 24 h a 4 ° C, com agitação suave.</li>
	<li>Colher o sobrenadante e medida a concentração de Ca usando um ensaio de Ca kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante.</li>
	<li>Calcule a concentração de cálcio como uma fração da proteína celular total. Desnature proteínas celulares desde as monocamadas de células com 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) + 0,1% sulfato dodecyl de sódio (SDS). Determine a concentração de proteína total usando um detergente compatível (DC) proteína ensaio seguindo as orientações do fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+stenosis%3A+a+disease+of+the+valve+and+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).</li>
<li>Freeman, R. V., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+Pathogenesis%2C+disease+progression%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies.</a> Circulation. 111, 3316-3326 (2005).</li>
<li>Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+formation+and+inflammation+in+cardiac+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bone formation and inflammation in cardiac valves.</a> Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).</li>
<li>Monzack, E. L., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+valvular+interstitial+cells+become+true+osteoblasts%3F+A+side-by-side+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison.</a> J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).</li>
<li>Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+valve+interstitial+cells+in+valve+calcification+and+their+response+to+atorvastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin.</a> Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Gu, X., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Rho+pathway+in+regulating+valvular+interstitial+cell+phenotype+and+nodule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).</li>
<li>Rodriguez, K. J., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+valvular+interstitial+cell+calcification+by+components+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).</li>
<li>Rattazzi, M., Iop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clones+of+interstitial+cells+from+bovine+aortic+valve+exhibit+different+calcifying+potential+when+exposed+to+endotoxin+and+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).</li>
<li>Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+androgen+receptor+from+vascular+smooth+muscle+cells+demonstrates+a+role+for+testosterone+in+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification.</a> Sci Rep. 6 (April), 24807(2016).</li>
<li>Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+IGF2+expression+during+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification.</a> J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).</li>
<li>Latif, N., Quillon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+valve+interstitial+cell+phenotype+and+function+using+a+fibroblast+growth+factor+2+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation.</a> PLoS ONE. 10 (6), (2015).</li>
<li>Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+valve+interstitial+cell+phenotypes+in+regulating+heart+valve+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology.</a> Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).</li>
<li>Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+converting+enzyme+and+kininase-II-like+activities+in+cultured+valvular+interstitial+cells+of+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart.</a> Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).</li>
<li>Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Msx2+promotes+cardiovascular+calcification+by+activating+paracrine+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals.</a> J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).</li>
<li>Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOVAS-1+cell+line%3A+a+new+in+vitro+model+of+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification.</a> Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).</li>
<li>Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+PHOSPHO1+suppresses+vascular+smooth+muscle+cell+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification.</a> J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).</li>
<li>Cui, L., Rashdan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+stage+renal+disease-induced+hypercalcemia+may+promote+aortic+valve+calcification+via+Annexin+VI+enrichment+of+valve+interstitial+cell+derived-matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physio%22%5BJournal%5D)">End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles.</a> J Cell Physio. , (2017).</li>
<li>Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo detalhado descreve um método prático para a aquisição de rato primária das vítimas, permitindo que o isolamento destas células de válvulas de coração de rato através de digestão enzimática. Nosso método mais suporta e estende-se o uso de um rato anteriormente relatados em vitro modelo para estudo de calcificação da valva aórtica13. O isolamento das vítimas da válvula aórtica apresenta o potencial de contaminação de VECs vizinhas. No entanto, nossos dados de imunofluorescência confirmam que a etapa de digestão inicial é suficiente para remover os VECs, tornando as células isoladas negativa para o marcador de células endoteliais, CD31. Além disso, α-SMA coloração confirma o fenótipo ativado das vítimas, que é necessário para a calcificação12.
Isolamentos de VIC anteriormente foram relatados em animal grande modelos6,7,8. No entanto, estas espécies são restringidas pelas limitado genéticas e moleculares ferramentas disponíveis para estudo a jusante, bem como sua acessibilidade restrita em laboratórios ao redor do mundo. Em contraste, tais ferramentas estão bem estabelecidas em roedores prontamente disponíveis e, portanto, a capacidade de isolar permite rato-derivado de vítimas uma maior capacidade de delineamento experimental. O uso de vítimas de ratos jovens também significa que as células são relativamente mais proliferativas que ratos mais velhos, exigindo, portanto, menos animais para produzir mais células. Embora os ratos estão prontamente acessíveis, mas devido a ratos tendo nomeadamente pequenas corações, o isolamento do mouse principal vítimas seria mais demoradas e consideravelmente mais animais seriam necessários para isolar o mesmo rendimento de células como o modelo de rato.
Uma vantagem significativa desta abordagem descrita é que as vítimas podem ser isoladas temporalmente do tipo selvagem e ratos transgênicos, bem como modelos do rato de lesão de válvula e doença cardiovascular. Usando o modelo de rato exigiria um maior número de animais para experiências em grande escala, portanto, para reduzir o uso de animais, rato primário das vítimas pode ser transformado para produzir uma linha de celular, uma vez que tem sido bem caracterizada.
Enquanto as graves implicações clínicas de CAVD são amplamente reconhecidas, os mecanismos causais subjacentes ainda precisa ser determinado. Além disso, a medicação eficaz terapias que podem prevenir e curar potencialmente calcificação da válvula aórtica não estão disponíveis no presente. A cultura de vítimas sob condições de calcificação, portanto, fornece um modelo altamente relevantes em vitro de CAVD. Mostramos que os níveis elevados de Ca e Pi induzem a calcificação em vitro de rato isolado vítimas com um concomitante aumento na expressão de marcadores de gene osteogênica Msx2, Alple Phospho1. É amplamente estabelecido que estes marcadores estão associados com o processo patológico de calcificação vascular14,15,16. Portanto, nossos dados mostram que a cultura de rato vítimas em calcificação médio é um modelo adequado com dedicada ao estudo de calcificação da válvula aórtica em vitro. De fato, estudos recentes de nosso laboratório utilizaram este modelo para demonstrar que Ca promove a calcificação da válvula aórtica através de enriquecimento anexina VI de VIC-derivado de matriz vesículas17.
Apesar dos benefícios de usar o rato vítimas e sua caracterização eficiente, existem ainda algumas limitações. Primeiro, o tamanho da população de VIC dentro válvulas do rato é muito pequeno, e, portanto, muitos animais são necessárias para gerar o número de células suficientes para estudos extensos em vitro . No entanto, é possível superar esta limitação por estudos preliminares de empresa em linhas de célula intersticial de válvula imortalizado, como relatado recentemente por nós18e posteriormente empregando culturas primárias para verificar e estendem estas conclusões.
Em resumo, o método descrito explica o sucesso isolamento, cultura e calcificação do rato primária das vítimas, que podem ser posteriormente avaliados usando uma variedade de análises, incluindo ensaios bioquímicos, bem como a proteína e análises de RNA. Este modelo oferece um sistema confiável e conveniente para se investigar CAVD em vitroe fornece uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos moleculares responsáveis por esta doença destrutiva.

A válvula aórtica saudável é composta de três folhetos, para que a distribuição do esforço mecânico durante a abertura e fechamento da válvula é repartida igualmente. Folheto da válvula tem uma estrutura definida de três camadas distintas: a fibro, spongiosa e ventricularis, que casa válvula células intersticiais (VICs) como o tipo de célula predominante. Essas três camadas são imprensadas entre duas camas de válvula células endoteliais (VECs)1.
VICs desempenham um papel fundamental na progressão de calcificar aórtica válvula calcificação (CAVD), a doença valvular cardíaca mais comum no mundo ocidental. CAVD é descrito como uma condição progressiva que ativamente regulada o tecido valvular e seu microambiente circundante. As mudanças celulares inicialmente causam espessamento fibrótico e eventualmente uma extensa calcificação dos folhetos da válvula aórtica. Isto então leva à estenose da valva aórtica significativa e, finalmente, deixou saída ventricular obstrução2, deixando a substituição cirúrgica da válvula como o tratamento só viável.
A fisiopatologia da CAVD é complexa, mas compartilha mecanismos semelhantes ao de mineralização óssea fisiológica3. Ao mesmo tempo, vários estudos têm demonstrado a capacidade de VICs submeter-se a trans-diferenciação osteogênica e calcificação4,5, os mecanismos subjacentes a esse processo ainda precisa ser totalmente elucidado, destacando o exigência crucial para um modelo viável e relevante em vitro de CAVD.
Trabalhos anteriores por um número de laboratórios com sucesso isolado vítimas de modelos de suínos e bovinos e culta essas células sob condições6,7,8de calcificação. Devido ao grande tamanho da válvula aórtica nesses modelos, isolamento de células através da digestão enzimática tem sido altamente eficaz na geração de populações puras de células. No entanto, estes modelos podem ser restritivos devido à limitada disponibilidade de ferramentas moleculares para espécies animais grandes. Em contraste, modelos de roedores permanecem vantajosos devido a custos relativamente mais baixos, potencial de manipulação genética e a ampla gama de ferramentas moleculares que estão prontamente disponíveis. No entanto, o isolamento das vítimas de pequenos modelos animais não é amplamente empregado, que é uma consequência provável das dificuldades encontradas ao trabalhar com amostras pequenas.
Este protocolo detalhado informa um método abrangente para o isolamento direto do rato vítimas. Por dissecção cuidadosa da válvula, seguida por uma série de digestões enzimáticas, vítimas podem ser isoladas e empregadas em uma grande variedade de técnicas experimentais, incluindo a expressão de gene, calcificação e cultura de células. Este modelo altamente relevantes em vitro de CAVD fará, sem dúvida, um contributo essencial para aumentar o nosso conhecimento deste processo patológico.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>Mola reta (lâmina de 8 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15905</td><td>Autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>Tesoura SuperFine Vannas (lâmina de 5 mm, 8 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Autoclave antes do uso.</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5 (11 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Filtro antes de adicionar ao meio de cultura.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Diluir a 70% v/v em água destilada.</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1150PB17</td><td>Diluir a 0,6M com água destilada.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1823</td><td>Diluir a 0,1M com água destilada.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo anti-rato de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td> 1<td>/250 diluição em tampão de diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo anti-coelho de burro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Diluição de 1/250 em tampão de diluição de anticorpo.</td></tr><tr><td>Kit sobrescrito II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Kit Taq Polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borate/EDTA (TBE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>Diluir para 1x com água misturada, antes de usar.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500</td><td>2% em 1x Tris/Borato/EDTA(TBE).</td></tr><tr><td>Tampão de lise (RIPA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Balão T75</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>Balão T175</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>placas qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>Rat Msx2 primer</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>Rat Alpl primer</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00190680</tr><tr><td>Primer Enpp1 de rato</td><td>Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T25</td><td>Sigma</td><td>CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dibásico</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Diluir a 0,1% com NaOH 0,1M.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluir a 4% com PBS.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho de alizarina S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td>Completar até 2% com água destilada e ajustar para pH 4,2.</td></tr><tr><td>TGF&beta;-1 par de primers: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>Concentração Sigma</td><td></td><td>usada: 10 &mu; </td></tr><tr><td>M TGF&beta;-2 par de primers: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG</td><td>Concentração Sigma</td><td></td><td>usada: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-Actina&menos; Anticorpo peroxidase produzido em</td> camundongo <td>Sigma</td><td>A3854</td><td>diluição 1/50000 em 5% BSA em solução salina tamponada com tris + 0,1% Tween (TBS / T).</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina</td><td>de camundongo Sigma</td><td>v6389</td><td>diluição de 1/900 em tampão de diluição > <forte</forte> (1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,3% Triton X-100).</td></tr><tr><td>IgG de camundongo</td><td>Sigma</td><td>I5381</td><td>Diluído na mesma concentração de estoque que o anticorpo anti-vimentina de camundongo antes da diluição no tampão de diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>GeneTex IgG de coelho</td><td></td><td>GTX35035</td><td>Diluído na mesma concentração de estoque que o anticorpo de actina de músculo liso anti-alfa de coelho antes da diluição no tampão de diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>Anticorpo de actina de músculo liso de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>diluição de 1/200 em tampão de diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>Coelho anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>diluição de 1/50 em 5% BSA inTBS / T.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com HRP</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>1/3000 diluição em 5% BSA em TBS / T.</td></tr><tr><td>Colagenase II</td><td>Worthington</td><td>41512862</td><td>Ajuste para 425 U / mL com água destilada e depois filtre.</td></tr><tr><td>SYBR green mastermix</td><td></td><td>Primerdesign PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de cálcio</td><td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína DC</td><td>Bio-Rad</td><td></td> 5000111 <td></td></tr><tr><td>reagente ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>Hiperfilme ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600007</tr><tr><td>PCR ladder</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento para eletroforese em gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa (0.22 &mu; m)</td> <td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>Hematocitômetro</td><td>Marienfeld Superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><forte>Câmera configurada para imagens vermelhas de alizarina:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Lente Nikon D800</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, pinça de dissecação GED</td><td></td><td></td>1:2.8</tr><tr><td>10 cm, extremidades curvas</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td>Autoclave antes do uso.</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Valvopatia aórtica calcífica (CAVD) é caracterizada por espessamento progressivo dos folhetos da válvula aórtica. É uma condição frequentemente encontrada nos pacientes idosos e fase final da doença renal (DRT), que geralmente sofrem de hiperfosfatemia e hipercalcemia. Presentemente, existem sem terapias de medicação que podem parar sua progressão. Os mecanismos subjacentes a esse processo patológico permanecem obscuros. Folheto da válvula aórtica é composto por uma fina camada de células endoteliais de válvula (VECs) nas superfícies exteriores das cúspides da aorta, com células intersticiais de válvula (VICs) imprensadas entre os VECs. O uso de um modelo do rato permite o estudo em vitro de calcificação ectópica baseada na vivo soro fisiopatológicas fosfato (Pi) e os níveis de cálcio (Ca) dos pacientes que sofrem de hiperfosfatemia e hipercalcemia. O protocolo descrito detalha o isolamento de um rato puro população VIC, como mostrado pela expressão de marcadores de VIC: músculo liso-alfa actina (α-SMA) vimentina e tecido fator de crescimento beta (TGFβ) 1 e 2 e a ausência de cluster de diferenciação (CD) 31, um VEC marcador. Expandindo as vítimas, estudos bioquímicos, genéticos e de imagem podem ser realizados para estudar e desvendar os mediadores chaves subjacente CAVD.

O objectivo do presente protocolo foi descrever o isolamento primário rato vítimas de e cultura-los para em vitro experiências de calcificação. Empregando o método descrito acima, rato vítimas pode ser com êxito isolado e expandiu-se para o estudo dos mecanismos responsáveis pela CAVD.
VICs primário de rato co localizar com marcadores de VIC estabelecida:
O fenótipo de VIC de células isoladas foi confirmado através de imunofluorescência por sondagem para os marcadores de VIC: vimentina e α-SMA (vermelho e verde, respectivamente, figura 1A) e está de acordo com anteriores relatórios11,12. Os representante controles negativos usando mouse não conjugada e IgG de coelho são mostrados na figura 1B. Além disso, a expressão do regulador de crescimento-VIC TGFβ-1 e TGFβ-2 foi confirmada através da análise PCR (Figura 1). A fim de confirmar que o rato isolado primárias vítimas estavam livres de contaminação endotelial, análise ocidental do borrão foi realizada para verificar esse rato vítimas estavam negativas para o marcador de células endoteliais, CD31, usando VECs mitral caninas como um controle positivo ( Figura 1).
CA e Pi induzir rato VIC calcificação:
Concentrações elevadas de Ca e/ou Pi sistêmicas geralmente a unidade a calcificação das vítimas em vitro. Para apreciar o potencial de calcificação do rato isolado das vítimas, as células foram expostas a níveis elevados de Ca e Pi, que imitam condições patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia em pacientes de DRT. Tratamento das vítimas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induzido calcificação, conforme determinado pela coloração de alizarina Red S para deposição de Ca (Figura 2A) e determinação colorimétrica dos níveis de Ca seguindo HCl lixiviação (81 dobra; p < 0.05 usando o Student t-teste; Figura 2B).
Alterações de expressão de gene associadas com calcificação VIC:
A calcificação de células vasculares em vitro está associada um perfil molecular distinto. No presente estudo, o tratamento das vítimas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induziu um aumento significativo na expressão do mRNA dos marcadores osteogênicas: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 prega mudança; p < 0,01; Figura 3A), fosfatase alcalina, Alpl (1.49 prega mudança; p < 0,001; Figura 3B) e fosfatase phosphoethanolamine/fosfocolina, Phospho1 (4.7 prega mudança; p < 0,01 usando ANOVA One-Way; A Figura 3). No entanto, a expressão do marcador osteogênica, Runx2e calcificação inibidor ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, permaneceu inalterado (Figura 3D–E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg"> Figura 1. Expressão de marcadores de VIC. (A) imunofluorescência mostrando coloração dupla e colocalization de actina de músculo liso-alfa (α-SMA; verde) e vimentina em células intersticiais válvula (VICs). (B) imagem representativa dos controles negativos usando o mouse e IgG de coelho. Núcleos são corados em azul usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Barra de escala = 50 µm. (C) a presença de transformar o fator de crescimento beta 1 (TGFβ-1) e TGFβ-2 nas vítimas (faixas 1 - 3) Como indicado pela análise PCR. 4 Lane é o controle de água. Gene de referência utilizado foi Gapdh. (D) análise ocidental do borrão mostrando a expressão abundante de CD31 em células endoteliais canino da válvula mitral (VECs) em comparação com nenhuma expressão nas vítimas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg"> Figura 2. Calcificação in vitro de rato VICs. Deposição de CA nas vítimas tratadas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi, conforme determinado pela: (A) fotografia mostrando alizarina Red S coloração de monocamadas de células inteiras no poço e (B) determinação colorimétrica dos níveis de Ca após a lixiviação de HCl. T do estudante-teste foi realizado para analisar a significância entre os grupos de dois dados. Os resultados são apresentados como média ± no MEV mostrou *p < 0.5 comparado com controle; (n = 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg"> Figura 3. Alterações de expressão do gene associadas a calcificação de VIC. Prega mudança na expressão do mRNA de marcadores osteogênicas (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2e (E) Enpp1 nas vítimas tratadas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi para a expressão de RNAm de 48 h. é mostrada como uma mudança de dobra em comparação com o gene endógeno referência Gadph. One-Way ANOVA, utilizando o modelo linear geral, incorporando as comparações por pares foi realizada para analisar a significância entre vários grupos. Os resultados são apresentados como média ± no MEV mostrou * *p < 0,01; p < 0,001 em relação ao controle; (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Número de folhetos da válvula</td>
			<td>Placa de cultura/balão</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 a 15</td>
			<td>1 bem na placa de 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 a 30</td>
			<td>1 bem na placa de 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 +</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Orientações gerais para o número de folhetos necessários para semeadura inicial.

Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar células intersticiais valvares de rato, ou VICs, para estudar os mecanismos da doença valvar aórtica calcificante. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da calcificação valvar, como por que as VICs calcificam e o que podemos fazer para impedir que essas células calcifiquem. As principais vantagens desta técnica são a acessibilidade e o potencial de transformação em linhagens celulares para estudos posteriores.Realize todas as dissecações em uma capela de exaustão previamente desinfetada com etanol 70% para garantir a esterilidade das amostras e reagentes. Esterilize os instrumentos de dissecação por autoclavagem, seguida pela imersão das pontas dos instrumentos em um béquer contendo etanol 70% antes do uso. Mergulhe os instrumentos de dissecação em béqueres com tampão de lavagem antes de entrarem em contato com o animal ou tecidos.Após sacrificar os ratos conforme descrito no protocolo textual, posicione o animal em decúbito dorsal sobre uma placa de dissecação de vidro e desinfete a pele borrifando com etanol 70%. Para dissecar o coração, faça uma incisão de quatro centímetros na linha média do rato com auxílio de tesouras de dissecação para expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente a caixa torácica e os pulmões para expor o coração. Remova o coração com um par de tesouras afiadas.Armazene o coração dissecado em tampão de lavagem gelado até que todas as dissecações macroscópicas dos ratos estejam concluídas. Para microdissecar cada coração, transfira o coração dissecado para uma placa de Petri coberta com tampão de lavagem. Corte o músculo cardíaco com uma tesoura reta de mola, deixando apenas uma pequena área ao redor da aorta ascendente e da raiz aórtica.Usando a mesma tesoura cirúrgica reta, corte cuidadosamente a aorta ascendente em direção ao ventrículo esquerdo e exponha as cúspides da valva aórtica. Em seguida, transfira a aorta aberta para uma nova placa de Petri estéril contendo solução salina balanceada de Hank. Disseque as cúspides da valva aórtica, identificadas pela sua forma única em U na base da aorta, utilizando uma tesoura de Vannas.Armazene todas as cúspides em um mililitro de tampão de lavagem gelado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro até que todas as dissecações estejam concluídas. Após a coleta de todas as cúspides, centrifugue-as a 100g durante um minuto a quatro graus Celsius para remover o tampão de lavagem. Para remover as células endoteliais valvares ou VECs, digira as cúspides em 100 microlitros de 425 unidades por mililitro de Colagenase II durante cinco minutos a 37 graus Celsius.Interrompa a digestão pipetando suavemente para cima e para baixo com uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. Centrifugue a 100g durante 30 segundos para sedimentar as lâminas foliares. Após descartar cuidadosamente o sobrenadante, lave as lâminas com 500 microlitros de tampão de lavagem e re-sedimente as células por centrifugação a 100g durante 30 segundos.Para colher os VICs dos folhetos, digerir com 100 microlitros da Colagenase II por 1,5 a duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, liberar os VICs pipetando suavemente para cima e para baixo com uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. Diluir a Colagenase II em 19 mililitros de meio de cultura e centrifugar a 670g por cinco minutos para obter o pellet dos VICs e dos resíduos remanescentes do folheto valvar.Após descartar o sobrenadante, transfira as cúspides e as CIVs para placas ou frascos de cultura. Incube as CIVs por cinco a sete dias em meio de cultura até atingir confluência a 37 graus Celsius na presença de 5%CO2, trocando o meio após 72 horas. Para preparar CIVs primárias de rato para experimentos de calcificação in vitro, semeie as células numa densidade de 150.000 células por poço em placas de seis poços.Mantenha as células no meio de cultura até atingirem confluência superior a 90%. Trate os VICs com meio de calcificação ou meio controle e incube a 37 graus Celsius na presença de 5% de CO2 por mais 72 horas. Para estudar os VICs primários calcificados para análises downstream subsequentes, remova o meio de calcificação ou o meio controle.Lave as monocamadas com tamp&atilde;o de lavagem para remover &iacute;ons de c&aacute;lcio e fosfato n&atilde;o ligados antes de realizar a caracteriza&ccedil;&atilde;o de VIC de rato conforme detalhado no protocolo textual. Para estudos de calcifica&ccedil;&atilde;o de VIC de rato, cora as monocamadas celulares com solu&ccedil;&atilde;o de Alizarina Vermelha S a 5%, agitando suavemente em um agitador durante 20 minutos. Posteriormente, lave tr&ecirc;s vezes com &aacute;gua destilada por cinco minutos cada vez.Para quantificar a deposição de cálcio, utilize um kit de ensaio bioquímico para cálcio. Extraia os íons de cálcio usando ácido clorídrico 0,6 molar durante 24 horas a quatro graus Celsius com agitação suave. Recolha o sobrenadante e meça a concentração de cálcio utilizando um kit de ensaio para cálcio, seguindo as orientações do fabricante.Por fim, calcule a concentração de cálcio como fração da proteína celular total conforme descrito no protocolo textual. O fenótipo de CIV das células isoladas foi confirmado por imunofluorescência, com detecção dos marcadores de CIV, vimentina e actina alfa do músculo liso. Além disso, a expressão do regulador do crescimento de CIV, fator de crescimento tecidual beta-1 e 2, foi confirmada utilizando análise por PCR.Realizou-se também análise por Western blot para verificar se as CIVs de rato eram negativas para o marcador de células endoteliais CD 31, utilizando CVEs mitrais de cão como controle positivo. As CIVs de rato foram expostas a níveis elevados de cálcio e fosfato, que simulam condições patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia. O tratamento das CIVs com cálcio e fosfato induziu calcificação, conforme determinado pela coloração com Alizarina Vermelha para detecção de depósitos de cálcio e pela determinação colorimétrica dos níveis de cálcio após lixiviação com ácido clorídrico.O tratamento de CIVs com cálcio e fosfato induziu um aumento significativo na expressão de mRNA dos marcadores osteogênicos MSX2, ALPL e PHOSPHO1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma a duas horas, excluindo a digestão de 18 folhetos valvares. Ao realizar este procedimento, é importante garantir a esterilidade durante a dissecação e a digestão.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar CIVs primários de rato e utilizá-los para investigar os mecanismos subjacentes à calcificação das CIVs. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo e análise por microscopia, podem ser realizados para estudar a fisiologia e o comportamento das CIVs. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de pesquisa cardiovascular explorarem os mecanismos das classificações das valvas aórticas em humanos utilizando o modelo de rato.

isolation-characterization-primary-rat-valve-interstitial-cells-new

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

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