Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência

Um problema comum na microscopia de imunofluorescência é a presença de fluorescência de fundo endógena que pode interferir com o seu sinal. Em muitos casos, essa autofluorescência pode tornar os seus resultados ininterpretáveis. Neste protocolo, demonstraremos como remover a autofluorescência de amostras de tecido cerebral humano utilizando fotobranqueamento com uma lâmpada de LED comercial de mesa.

As principais vantagens deste método são as economias significativas de custo em comparação com as técnicas atuais, sem comprometer a eficácia, e o fato de que nenhum composto exógeno é introduzido na amostra. Antes de começar, prepare soluções estoque de tampão salino tris uma vez, TBS, e azida de sódio a 10%. Para cada três lâminas de microscópio de tamanho padrão que você deseja processar, será necessário um único recipiente de Petri quadrado de 100 milímetros por 100 milímetros como câmara para lâminas.

Para cada câmara de lâmina, prepare 50 mililitros de azida 0,5% em TBS adicionando 25 mililitros de azida de sódio 10% a 50 mililitros de TBS 1x. Crie uma estrutura para elevar sua câmara de lâmina de forma que uma cabeça de lâmpada possa ser posicionada abaixo. Para uma placa de Petri quadrada de 100 milímetros, um recipiente plástico de alimentos de tamanho semelhante pode ser cortado na forma desejada.

Tudo o que puder elevar com segurança a câmara de lâmina sem obstruir a luz que atinge as amostras pode ser utilizado. Adquira uma luminária de mesa com LED de fósforo branco e remova quaisquer difusores ou plásticos opacos que cubram a fonte de luz. Oriente a matriz de LED para cima.

Para essa finalidade, recomenda-se uma lâmpada com pescoço flexível. Construa uma cobertura em forma de cúpula refletora para o aparelho iluminando o interior de uma caixa grande o suficiente para cobrir as câmaras de lâmina e a estrutura com papel alumínio. Para uma única câmara, pode-se utilizar uma caixa de ponteiras de pipeta de um milímetro.

Para este vídeo, tecido cerebral do giro frontal orbital humano com FTLD-T fixado em formalina foi submetido ao pré-tratamento de fotobranqueamento. Os procedimentos de preparação do tecido e coloração por aminoácidos podem variar conforme a origem, fixação e inclusão de suas seções de tecido. Em uma câmara fria a quatro graus Celsius, armário refrigerado ou geladeira, posicione a lâmpada sob o suporte e a câmara de amostra sobre o suporte.

Encha a câmara de amostra com 50 mililitros de TBS azida. Mergulhe cortes de tecido com 10 micrômetros de espessura montados em lâminas de microscópio de vidro padrão na câmara de amostra usando pinças limpas. Cubra o aparelho com a cúpula refletora e ligue a lâmpada de LED.

Deixe as amostras sofrerem fotobranqueamento por 48 horas. Esse tempo de incubação pode variar, dependendo da intensidade da lâmpada e da quantidade de material autofluorescente no tecido. Após o pré-tratamento com fotobranqueamento, as lâminas podem ser imunomarcadas com um protocolo padrão para o seu tecido e proteínas de interesse específicos.

Para fins de demonstração, o tecido cerebral de FTLD-T foi corado para tau fosforilada utilizando anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 e Texas Red. DAPI foi usado como contracorante nuclear. Prepare 500 mililitros de tampão de recuperação de antígeno, 500 mililitros de Triton X-100 0,025% em TBS, 10 mililitros de albúmina sérica bovina a 1%, BSA, em TBS e dois mililitros de solução bloqueadora, consistindo de soro de cabra adicionado ao TBS com BSA.

Realize a recuperação de antígeno submergindo as lâminas fotodescoloridas em tampão de recuperação de antígeno em um coletor de lâminas. Aqueça o coletor a 90 graus Celsius por 30 minutos. Após a remoção do coletor do tratamento térmico, é importante permitir que a câmara esfrie à temperatura ambiente por 30 minutos.

Remover as lâminas imediatamente fará com que as seções sequem. Prepare a mistura do anticorpo primário de acordo com as recomendações do fabricante. Neste caso, o anticorpo anti-fosfo PHF tau p-serina 202 mais treonina 205 AT8 foi diluído na proporção de um para 100 em BSA TBS e mantido no gelo.

São necessários 150 microlitros de mistura de anticorpos por seção. Após as seções terem esfriado por 30 minutos, transfira as lâminas do recipiente de recuperação de antígeno para um frasco de coloração contendo TBS Triton. Lave as lâminas nesta solução por cinco minutos com agitação suave.

Esvazie e substitua o Triton em TBS para repetir este passo de lavagem pela segunda vez. Após a lavagem, remova as lâminas do frasco de coloração e absorva qualquer tampão em excesso. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um contorno ao redor do tecido.

Isso impedirá que suas soluções escorram da lâmina. Tenha cuidado para não deixar as lâminas secarem. Bloqueie o tecido pipetando 200 microlitros de solução bloqueadora sobre as lâminas e coloque-as dentro de uma câmara umidificada.

Esta câmara pode ser algo tão simples quanto uma grade para lâminas dentro de uma caixa de ponteiras de pipeta contendo um papel-toalha úmido. Certifique-se de que toda a amostra de tecido esteja coberta com a solução bloqueadora. Incube à temperatura ambiente por duas horas.

Remova a solução bloqueadora com aspirador ou pipeta. Adicione 100 a 150 microlitros da mistura de anticorpo primário sobre as lâminas. Certifique-se de que toda a amostra esteja coberta pela solução de anticorpo e de que as seções permaneçam sobre uma superfície nivelada para evitar acúmulo desigual de anticorpo.

Incube com o anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite em uma câmara umidificada. No dia seguinte, prepare a mistura de anticorpo secundário. Neste caso, os anticorpos secundários caprinos anti-murinos Alexa 488 e Texas Red foram diluídos na proporção de um para 100 usando BSA em TBS.

Retire as seções de tecido e remova a solução de anticorpo primário por aspiração ou pipetagem. Lave as lâminas duas vezes de maneira semelhante à anterior, utilizando um frasco de coloração preenchido com TBS Triton, durante cinco minutos cada lavagem. Após a lavagem, remova qualquer excesso de tampão com papel absorvente.

Pipete de 100 a 150 microlitros da solução de anticorpo secundário, garantindo novamente que a amostra de tecido esteja completamente coberta. Incube por duas horas à temperatura ambiente na câmara umidificada e no escuro. Prepare a coloração contrastante com DAPI a 0,1 micrograma por mililitro em TBS, conforme recomendações do fabricante ou por diluição seriada.

Certifique-se de misturar bem a solução estoque de DAPI devido à possível insolubilidade. Retire os lâminas e remova a mistura do anticorpo secundário. Lave as amostras duas vezes, mas em vez de usar TBS Triton, utilize TBS puro.

Aspire ou pipete a solução de lavagem remanescente e adicione 100 a 150 microlitros de corante DAPI sobre suas seções de tecido. Incube no escuro, à temperatura ambiente, por 10 minutos. Recupere as amostras e lave três vezes com TBS simples em vez de duas.

Após a lavagem, remova cuidadosamente a solução remanescente. Aplique o meio de montagem. Conclua a montagem da lâmina cobrindo as amostras com lamínulas de vidro.

Evite bolhas colocando uma borda da lamínula para baixo e abaixando muito lentamente a borda oposta usando pinças. Deixe o meio de montagem secar antes de armazenar a quatro graus Celsius no escuro. Os lâminas agora estão prontos para serem visualizados.

As configurações para a microscopia de fluorescência variarão conforme os fluoróforos utilizados para coloração e o microscópio. Ligue a lâmpada de fluorescência, o microscópio e o computador, e aguarde 15 minutos para que a lâmpada aqueça. Coloque as lâminas de tecido coradas no microscópio de fluorescência.

Utilize o campo claro para localizar o tecido em uma ampliação de 10 vezes. Após identificar uma região adequada do tecido, adicione uma gota de água sobre a lamínula da amostra. Troque para uma lente de imersão em água de 20 vezes.

Selecione comprimentos de onda de excitação a laser e de emissão apropriados para cada fluoróforo em faixas separadas para obter o melhor sinal. Mais detalhes sobre as configurações e comprimentos de onda utilizados podem ser encontrados no manuscrito suplementar. Ajuste a potência do laser e as configurações de ganho para otimizar a intensidade do sinal em cada faixa.

Uma vez encontradas as configurações apropriadas e o campo de visão, salve uma imagem composta contendo os dados de fluorescência de cada pista. Para visualização da intensidade de fluorescência em cada canal, instale a macro RGB Profile Tools para o ImageJ. Abra o arquivo de imagem confocal lsm no ImageJ e converta as imagens compostas das três pilhas em RGB acessando Imagem, Cor, Ferramenta de Canais.

Selecione Composto e marque os três canais. Em seguida, vá até Imagem, Tipo e Cor RGB. Selecione o ícone Ferramentas de Perfil RGB e trace uma linha através da seção da imagem a ser perfilada.

Neste vídeo, foram descritas as etapas para realizar um pré-tratamento de fotobranqueamento em amostras de tecido com o objetivo de produzir fluorescência de fundo. Este procedimento pode ser acrescentado a qualquer protocolo padrão de fluorescência aminada antes da recuperação de antígenos e da coloração aminada. O aparelho utilizado para o fotobranqueamento é de baixo custo e facilmente obtido, sendo composto por componentes comerciais.

Os LEDs com fósforo branco emitem luz ao longo de um amplo espectro de comprimentos de onda, o que os torna altamente adequados para fotobranqueamento em larga escala. Utilizando uma luminária de LED de mesa facilmente disponível, amostras de tecido cerebral humano com FTLD-T não coradas foram submetidas a fotobranqueamento e imagens foram obtidas usando os comprimentos de onda apropriados caso essas amostras tivessem sido coradas com Texas Red e Alexa 488. As amostras não tratadas exibiram grandes quantidades de autofluorescência.

Em contraste, o fotobranqueamento resultou em redução significativa da intensidade dos pontos de autofluorescência que se assemelhavam à lipofuscina, bem como da fluorescência de fundo geral. Para validação adicional desta técnica, amostras de tecido cerebral de FTLD-T foram coradas para tau hiperfosforilada, uma proteína que sofre desdobramento incorreto e se acumula nesta doença na forma de corpos de inclusão distintos. Dois anticorpos secundários diferentes foram aplicados para melhor distinguir entre a marcação de tau e a fluorescência não específica.

Nestas imagens compostas, a colocalização de Alexa 488 e Texas Red é mostrada em amarelo, o que representa a proteína tau corretamente corada. A presença de regiões vermelhas ou verdes indica fluorescência não específica ou extinção de um dos cromóforos. Na amostra controle não tratada, pode-se observar um fundo significativo e sinal não específico, particularmente no canal Texas Red.

Tanto o pré-tratamento com fotobranqueamento quanto a aplicação de um quencher químico resultam em sinal de fundo altamente reduzido. Se separarmos os canais de fluorescência e observarmos as imagens com maior magnificação, poderão ser feitas observações mais detalhadas. O controle não tratado apresenta fluorescência de fundo em todos os canais, bem como características inespecíficas, principalmente no canal Texas Red, que possuem intensidade semelhante à marcação específica de tau.

Se os corpos de inclusão de tau não tivessem uma morfologia distinta e previsível, esses resultados com Texas Red poderiam ter sido mal interpretados devido à presença dessas características autofluorescentes. O pré-tratamento com fotobranqueamento elimina completamente essas características inespecíficas do Texas Red, preservando a maioria dos sinais específicos de tau com Texas Red e Alexa 488. O fotobranqueamento, no entanto, parece ter pouco efeito na fluorescência de fundo do DAPI.

O quenching químico reduziu a fluorescência de fundo no canal Alexa 488 tão eficazmente quanto o fotobranqueamento. No entanto, também reduziu as intensidades de fluorescência de ambos DAPI e Texas Red, sugerindo a presença de algum quenching contraproducente. A quantificação desses efeitos pode ser observada nos perfis de sinal.

Como você pode ver, este método produz imagens limpas, livres de características confundíveis. Este pré-tratamento com fotobranqueamento pode ser incorporado a qualquer protocolo padrão de fluorescência aminada para remover a autofluorescência e gerar resultados de alta qualidade e inequívocos.