Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência

Um problema comum na microscopia de imunofluorescência é a presença de fluorescência de fundo endógena que pode interferir no seu sinal. Em muitos casos, essa autofluorescência pode tornar seus resultados ininterpretáveis. Neste protocolo, demonstraremos como remover a autofluorescência de amostras de tecido cerebral humano usando fotobranqueamento com uma lâmpada de mesa LED comercial.

As principais vantagens deste método são a economia significativa de custos em relação às técnicas atuais sem sacrificar a eficácia e que nenhum composto exógeno é introduzido na amostra. Antes de começar, prepare soluções de estoque de solução salina tamponada com tris, TBS e azida de sódio a 10%. Para cada três lâminas de microscópio de tamanho padrão que você gostaria de processar, você precisará de uma única placa de Petri quadrada de 100 milímetros por 100 milímetros como uma câmara de lâminas.

Para cada câmara de deslizamento, prepare 50 mililitros de 05% de azida em TBS adicionando 25 mililitros de azida de sódio a 10% a 50 mililitros de uma vez TBS. Crie um andaime para elevar sua câmara de deslizamento de forma que uma cabeça de lâmpada possa caber embaixo. Para uma placa de Petri quadrada de 100 milímetros, um recipiente de plástico para alimentos de tamanho semelhante pode ser cortado em forma.

Qualquer coisa que possa elevar com segurança a câmara deslizante sem impedir que a luz atinja as amostras pode ser usada. Adquira uma lâmpada de mesa LED de fósforo branco e remova quaisquer difusores ou plástico opaco que cubra a fonte de luz. Oriente o conjunto de LEDs para cima.

Para este fim, recomenda-se uma lâmpada com gargalo flexível. Construa uma cobertura de cúpula reflexiva para o aparelho iluminando o interior de uma caixa grande o suficiente para cobrir as câmaras deslizantes e o andaime com papel alumínio. Para uma única câmara, uma caixa de ponteira de pipeta de um milímetro pode ser usada.

Para este vídeo, o tecido cerebral giroso frontal orbital FTLD-T humano fixado em formalina foi submetido ao pré-tratamento de fotobranqueamento. Os procedimentos de preparação de tecido e coloração de aminoácidos podem variar de acordo com a fonte, fixação e incorporação de suas seções de tecido. Em uma câmara fria de quatro graus Celsius, armário frio ou geladeira, coloque a lâmpada sob o andaime e a câmara de amostra em cima do andaime.

Encha a câmara de amostra com 50 mililitros de azida TBS. Mergulhe seções de tecido de 10 micrômetros de espessura montadas em lâminas de microscópio de vidro padrão na câmara de amostra usando uma pinça limpa. Cubra o aparelho com a cúpula reflexiva e acenda a lâmpada LED.

Deixe as amostras fotobranquearem por 48 horas. Este tempo de incubação pode variar, dependendo da intensidade da lâmpada e da quantidade de material autofluorescente no tecido. Após o pré-tratamento de fotobranqueamento, as lâminas podem ser imunomarcadas com um protocolo padrão para seu tecido específico e proteínas de interesse.

Para fins de demonstração, o tecido cerebral FTLD-T foi corado para tau fosforilada usando anticorpos secundários conjugados a Alexa 488 e Texas Red. DAPI foi usado como contracoloração nuclear. Prepare 500 mililitros de tampão de recuperação de antígeno, 500 mililitros de 0,025% Triton X-100 em TBS, 10 mililitros de albumina de soro bovino a 1%, BSA, em TBS e dois mililitros de solução de bloqueio, consistindo de soro de cabra adicionado a BSA TBS.

Execute a recuperação de antígenos submergindo as lâminas fotobranqueadas em um tampão de recuperação de antígeno em um coletor de lâminas. Aqueça o coletor a 90 graus Celsius por 30 minutos. Uma vez que o coletor tenha sido removido do tratamento térmico, é importante permitir que a câmara esfrie em temperatura ambiente por 30 minutos.

A remoção imediata das lâminas fará com que as seções sequem. Prepare sua mistura de anticorpos primários de acordo com as recomendações do fabricante. Nesse caso, o anticorpo antifosfo PHF tau p-serina 202 mais treonina 205 AT8 foi diluído um em 100 com BSA TBS e deixado no gelo.

São necessários 150 microlitros de mistura de anticorpos por seção. Depois que as seções esfriarem por 30 minutos, transfira as lâminas do coletor de recuperação de antígeno para um frasco de coloração cheio de TBS Triton. Lave as lâminas nesta solução por cinco minutos com agitação suave.

Esvazie e substitua o TBS Triton para repetir esta etapa de lavagem uma segunda vez. Após a lavagem, remova as lâminas do frasco de coloração e remova o excesso de tampão. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um contorno ao redor do tecido.

Isso impedirá que suas soluções sejam executadas fora do slide. Tome cuidado para não deixar os slides secarem. Bloqueie o tecido pipetando 200 microlitros de solução de bloqueio nas lâminas e coloque-as dentro de uma câmara umidificada.

Esta câmara pode ser algo tão simples quanto um rack de slides dentro de uma caixa de pontas de pipeta contendo uma toalha de papel molhada. Certifique-se de que toda a amostra de tecido esteja coberta com solução de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante duas horas.

Remova a solução bloqueada com aspirador ou pipeta. Pipete 100 a 150 microlitros de mistura de anticorpos primários nas lâminas. Certifique-se de que toda a amostra seja coberta com solução de anticorpos e que as seções sejam mantidas em uma superfície nivelada para evitar o acúmulo desigual de anticorpos.

Incubar com anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite em uma câmara umidificada. No dia seguinte, prepare a mistura de anticorpos secundários. Neste caso, o anti-rato de cabra Alexa 488 e o anti-rato de cabra Texas Red foram diluídos um em 100 usando BSA TBS.

Recupere as seções de tecido e remova a solução primária de anticorpos por aspirador ou pipeta. Lave as lâminas duas vezes de maneira semelhante à anterior, usando um frasco de coloração cheio de TBS Triton por cinco minutos a cada lavagem. Após a lavagem, retire o excesso de tampão.

Pipetar 100 a 150 microlitros de solução de anticorpo secundário, garantindo mais uma vez que a amostra de tecido esteja completamente coberta. Incube por duas horas em temperatura ambiente na câmara umidificada no escuro. Prepare a contracoloração DAPI de 0,1 micrograma por mililitro em TBS de acordo com as recomendações do fabricante ou diluição seriada.

Certifique-se de misturar bem a solução estoque DAPI devido à possível insolubilidade. Recupere as lâminas e remova a mistura de anticorpos secundários. Lave as amostras duas vezes, mas em vez de usar TBS Triton, use TBS simples.

Aspire ou pipete a solução de lavagem restante e pipete de 100 a 150 microlitros de coloração DAPI em suas seções de tecido. Incube no escuro em temperatura ambiente por 10 minutos. Recupere as amostras e lave três vezes com TBS simples em vez de duas.

Após a lavagem, remova cuidadosamente a solução de lavagem restante. Aplique o meio de montagem. Complete a montagem da corrediça cobrindo as amostras com lamínulas de vidro.

Evite bolhas colocando uma borda da lamínula para baixo e abaixando muito lentamente a borda oposta usando uma pinça. Deixe a mídia de montagem secar antes de armazená-la a quatro graus Celsius no escuro. Os slides agora estão prontos para serem visualizados.

As configurações para a microscopia de fluorescência variam dependendo dos fluoróforos usados para coloração e do microscópio. Ligue a lâmpada de fluorescência, o microscópio e o computador e deixe a lâmpada aquecer por 15 minutos. Coloque as lâminas de tecido corado no microscópio de fluorescência.

Use o campo claro para localizar o tecido com ampliação de 10 vezes. Uma vez localizada uma região adequada do tecido, adicione uma gota de água em cima da lamínula da amostra. Mude para uma lente de imersão em água 20 vezes maior.

Selecione os comprimentos de onda de excitação e emissão do laser apropriados para cada fluoróforo em faixas separadas para obter o melhor sinal. Mais detalhes sobre as configurações e comprimentos de onda usados podem ser encontrados no manuscrito anexo. Ajuste as configurações de potência e ganho do laser para otimizar a intensidade do sinal para cada faixa.

Assim que as configurações apropriadas e o campo de visão forem encontrados, salve uma imagem composta contendo os dados de fluorescência de cada trilha. Para visualização da intensidade de fluorescência em cada canal, instale a macro RGB Profile Tools para ImageJ. Abra o arquivo de imagem confocal lsm no ImageJ e converta as imagens compostas das três pilhas para RGB acessando a ferramenta Image, Color, Channel.

Selecione Composto e verifique todos os três canais. Em seguida, vá para Imagem, Tipo e Cor RGB. Selecione o ícone Ferramentas de perfil RGB e desenhe uma linha na seção da imagem a ser perfilada.

Neste vídeo, foram descritas as etapas para realizar um pré-tratamento de fotobranqueamento de amostras de tecido para produzir fluorescência de fundo. Este procedimento pode ser adicionado a qualquer protocolo padrão de fluorescência de aminoácidos antes da recuperação do antígeno e da coloração de aminoácidos. O aparelho usado para fotobranqueamento é barato e facilmente obtido, consistindo em componentes prontos para uso.

Os LEDs de fósforo branco emitem luz em um amplo espectro de comprimentos de onda, o que os torna altamente adequados para fotobranqueamento de ampla faixa. Usando uma lâmpada de mesa LED prontamente disponível, amostras de tecido cerebral FTLD-T humano não corado foram fotobranqueadas e fotografadas usando os comprimentos de onda que seriam apropriados se essas amostras fossem coradas com Texas Red e Alexa 488. As amostras não tratadas exibiram grandes quantidades de autofluorescência.

Em contraste, o fotobranqueamento resultou em intensidade significativamente reduzida de manchas de autofluorescência que se assemelhavam à lipofuscina, bem como fluorescência geral de fundo. Para posterior validação desta técnica, amostras de tecido cerebral FTLD-T foram coradas para tau hiperfosforilada, uma proteína que se dobra incorretamente e se acumula nesta doença como corpos de inclusão distintos. Dois anticorpos secundários diferentes foram aplicados para melhor distinguir entre marcação de tau e fluorescência não específica.

Nessas imagens compostas, a colocalização de Alexa 488 e Texas Red é mostrada em amarelo, que representa a proteína tau corada corretamente. O aparecimento de regiões vermelhas ou verdes indica fluorescência não específica ou extinção de um dos cromóforos. Na amostra de controle não tratada, um sinal significativo de fundo e inespecífico pode ser visto, particularmente no canal Texas Red.

Tanto o pré-tratamento de fotobranqueamento quanto a aplicação de um extintor químico resultam em um sinal de fundo altamente reduzido. Se dividirmos os canais de fluorescência e olharmos para as imagens com maior ampliação, observações mais detalhadas podem ser feitas. O controle não tratado possui fluorescência de fundo em todos os canais, bem como características não específicas, principalmente no canal Texas Red, que têm intensidade semelhante à marcação específica da tau.

Se os corpos de inclusão de tau não tivessem morfologia distinta e previsível, esses resultados do Texas Red poderiam ter sido mal interpretados devido à presença dessas características autofluorescentes. O pré-tratamento de fotobranqueamento abole completamente essas características não específicas do Texas Red, preservando a maioria dos sinais específicos do Texas Red e Alexa 488 específicos da tau. O fotobranqueamento, no entanto, parece ter pouco efeito na fluorescência de fundo DAPI.

O quencher químico reduziu a fluorescência de fundo no canal Alexa 488 com a mesma eficácia que o fotobranqueamento. No entanto, também reduziu as intensidades de fluorescência do DAPI e do Texas Red, sugerindo a presença de alguma têmpera contraproducente. A quantificação desses efeitos pode ser vista nos perfis de sinal.

Como você pode ver, esse método produz imagens limpas e livres de recursos confusos. Este pré-tratamento de fotobranqueamento pode ser incorporado em qualquer protocolo padrão de fluorescência de aminoácidos para remover a autofluorescência e gerar resultados inequívocos e de alta qualidade.