Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

O objetivo geral deste procedimento experimental é delinear uma abordagem fundamental em metodologia detalhada para medir a heterogeneidade genética no local alvo de maneira confiável e robusta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da edição de genes, como como a mutagênese no local pode ser analisada e medida. A principal vantagem desta técnica é que é uma metodologia padronizada para reparo dirigido por homologia ou correção gênica usando oligonucleotídeos de fita simples.

Para iniciar o protocolo, cultive HTT11619 células em 25 mililitros de meio previamente preparado para a cultura de células HTT116 em um frasco T-175. Aspire o meio e lave as células com solução salina tamponada com fosfato de dulbecco ou PBS, sem cálcio e magnésio, depois aspire o PBS. Em seguida, adicione tripsina gota a gota ao frasco T-175, usando uma pipeta de cinco mililitros.

Deixe as células se soltarem em uma incubadora. Bata no frasco para desalojar as células e, em seguida, tempere as células com os oito mililitros de meio completo em toda a superfície do frasco. Em seguida, pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes para quebrar os aglomerados de células e transferir as células para um tubo cônico de 15 mililitros.

Antes de girar as células para baixo, pegue 10 microlitros do tubo cônico de 15 mililitros e combine-o com 10 microlitros de azul de tripano para contar as células e, em seguida, peletize as células. Transfira 10 microlitros das células misturadas com azul de tripano para o hemocitômetro e conte as quatro grades ao redor do lado de fora. Para cada placa de 10 centímetros de células a serem sincronizadas, adicione cinco mililitros de meio completo e seis micromolares de afidicolina.

Em seguida, transfira 100 microlitros do pellet de célula ressuspensa para cada placa centimétrica e gire a placa suavemente para misturar. Incube as placas para sincronizar as células na borda G1S. Quatro horas antes da segmentação, aspire o meio, lave com PBS.

Aspire o PBS e adicione cinco mililitros de meio completo. Coloque a placa de volta na incubadora por quatro horas. Insira a sequência do gene EGFP mutante no gerador online Zane Labs e escolha as sequências guia CRISPR que se ligam com proximidade ao local alvo.

Misture o RNA em concentrações molares iguais a 45 micromolares. Adicione 6,75 microlitros de um estoque de 200 micromolares de RNA CR e 6,75 microlitros de um estoque de 200 micromolares de RNA traçador a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Em seguida, adicione 16,50 microlitros de tampão IDT para fazer um volume final de 30 microlitros.

Em seguida, aqueça a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos, em uma máquina de PCR. Deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente. Para cada amostra, diluir 2,22 microlitros de RNA CR para complexo de RNA traçador e 2,78 microlitros de tampão IDT para um volume final de cinco microlitros.

Diluir 1,67 microlitros de proteína Cas9 de um estoque de 60 micromolares em 3,33 microlitros de meio de soro baixo, até um volume final de cinco microlitros. Misture cinco microlitros de proteína Cas9 com cinco microlitros de RNA complexo. Aspire o meio, lave com cinco mililitros de PBS.

Aspire o PBS e adicione um mililitro de tripsina pré-aquecida a cada placa de 10 centímetros. Coloque as placas na incubadora. Em seguida, bata na placa de 10 centímetros para certificar-se de que todas as células estão desalojadas e, em seguida, tempere-as com quatro mililitros de meio completo, dispersando-o por toda a superfície da placa.

Pipete para cima e para baixo várias vezes para quebrar os aglomerados de células e transferir as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Separe 10 microlitros do tubo cônico de 15 mililitros e combine-o com 10 microlitros de azul de tripano para contar as células. Pulverize as células girando por cinco minutos a 125 x G à temperatura ambiente.

Aspire o meio e lave com cinco mililitros de PBS. Esfole as células girando 125 x G por cinco minutos em temperatura ambiente. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para cada cubeta de eletroporação com intervalo de quatro milímetros.

Adicione 10 microlitros do complexo RNP a 100 microlitros de células, a uma densidade de 5 x 10 elevado à quinta célula. Adicionar dois ODN micromolares a cada amostra. Em seguida, leve o rack para uma máquina de eletroporação.

Agite levemente cada uma das amostras e coloque-as na câmara. Coloque o rack de volta no capô e transfira cada amostra para um poço contendo dois mililitros de meio completo em uma placa de seis poços. Incube a placa antes de verificar os níveis de correção.

Aspire o meio e lave as células com dois mililitros de PBS. Substitua o PBS por 500 microlitros de tripsina pré-aquecida para cada poço da placa de seis poços. Coloque as placas na incubadora.

Em seguida, bata na placa para certificar-se de que todas as células estejam desalojadas e, em seguida, tempere com um mililitro de meio completo, dispersando-o por toda a superfície do poço. Passe as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e pellet. Depois de peletizar as células, aspirar o meio e, em seguida, ressuspender o pellet celular em 500 microlitros de tampão FACS.

Eletroporar as células HTT11619 sincronizadas e liberadas na concentração de 5 x 10 para as quintas células por 100 microlitros, com o complexo RNP a 100 picomoles e 100 picomoles de 72 NTODN a 2,0 micromolar. Transfira as células para uma placa de seis poços e deixe-as se recuperar por 72 horas. Em seguida, classifique as células individualmente em placas de 96 poços, usando um classificador fac com um laser de 488 nanômetros para EGFP mais menos.

Dos poços que têm crescimento, isole o gDNA celular usando um kit de isolamento de DNA disponível comercialmente. Amplificar as regiões ao redor da base alvo via PCR. Por fim, realize a análise de sequenciamento de DNA nas amostras.

72 horas após a análise da citometria de fluxo de incubação, confirme o reparo funcional da proteína fluorescente verde. Uma resposta gradual à dose foi observada à medida que os níveis coordenados de RNP e 72NT aumentam. Uma reação de edição de genes na ausência da partícula RNP, corrigiu aproximadamente 1% das células-alvo quando uma concentração 10 vezes maior do oligonucleotídeo 72NT é usada na reação de edição de genes de agente único.

Foram selecionados 16 clones das amostras positivas para EGFP e a integridade genética ao redor do sítio alvo foi analisada por sequenciador de DNA. Todas as 16 células positivas para EGFP continham a troca de nucleotídeos prevista no local alvo. 15 isolados clonais não verdes foram analisados quanto à heterogeneidade no local alvo.

Nenhuma troca de bases de DNA foi observada em aproximadamente metade das amostras. O restante das expansões clonais examinadas exibiu uma população heterogênea de mutações de deleção. O tamanho da deleção variou de uma base a 19 bases.

CRISPR, Cas9 e moléculas de DNA de doadores de oligonucleotídeos de fita simples trabalhando em conjunto podem levar ao reparo preciso da mutação pontual no gene EGFP, conforme demonstrado neste novo modelo para o reparo de mutações pontuais, uma via molecular, na qual o DNA do doador acessa o modelo de replicação para o reparo da base mutante. Um processo que denominamos ExACT. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da edição de genes explorarem o grau de heterogeneidade no local alvo, como resultado da atividade de edição de genes em linhagens celulares.