Name: Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a usar ultrassonografia tridimensional de alta frequência para caracterizar gravidez precoce em camundongos sem interromper a gestação. Este método permite coleta longitudinal de dados em biologia reprodutiva.

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Agradecemos muito a ajuda de Rong Zhao Jie Li e Yan Ying.

estes estudos foram conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório publicado pela National Institutes of Health e animais protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Baylor College of Medicine, sob o protocolo número AN-4203.
 1. preparação do Mouse grávida para ultra-som <ol><li>Timed acasalamento <ol><li>lugar a represa com um macho fértil comprovada início da noite de rato depois de 1700. Separe dam e macho por 07: 00 horas (h), independentemente se plug vaginal está presente, para garantir a exata datação da gravidez. 
		Nota: Na manhã seguinte acasalamento é considerado 0,5 dia post coitum (d.p.c).</li>
	</ol></li> <li>Preparação para ecografia <ol><li>Coloque o mouse grávido num recipiente selado anestesia indução.</li>
		<li>Sedar com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min) até que o animal perde o braço endireitante reflex (aproximadamente 1-2 minutos dependendo do tamanho do mouse) e movimentos espontâneos não são observados (além de respiração).</li>
		<li>Lugar sedado o mouse na posição supina no cone de nariz com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min). Aplicar a pomada oftálmica ao animal &#39; olhos de s.</li>
		<li>Com um cotonete, aplicar o creme depilatório todo abdômen, esterno à vagina e lateral para os flancos.</li>
		<li>Permitir creme permanecer por um período máximo de 3 min e então remover o creme e o cabelo com tecido. Garantir a remoção de todo o cabelo, como qualquer cabelo restante irá diminuir a qualidade de imagem.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação da fase ultra-som <ol><li>transformar no transdutor.</li>
	<li>Anexar 3D motor motor fase para o transdutor.
	<ol><li>Plug em 3D motor conectando o cabo do motor 3D ao conector do motor 3D no painel traseiro. Conecte o sistema motor 3D para o sistema de montagem usando o post de liberação rápida na parte superior para se conectar à estação de imagem e a liberação rápida montagem na parte inferior para fixar o grampo do transdutor.</li>
	</ol></li> <li>Anexar a sonda para o grampo do transdutor.</li></ol>
 3. Begin Imaging o Mouse grávida <ol><li>rato de lugar supino na plataforma de monitoramento. O rato recebe continuamente isoflurano anestésico (entre 1,5-2,5%) e oxigênio (1 L/min) através do cone de nariz. Fita com cuidado todas as patas para almofadas na plataforma de controlo do ritmo cardíaco.
	<ol><li>Aplique 1 a 2 mL de gel de transmissão do ultra-som no abdômen.</li>
	</ol></li> <li>Usando o estágio motor manual, posicionar a sonda de ultra-som na parte inferior do abdome.
	<ol><li>Localizar a bexiga, que deve aparecer como um círculo escuro cheio de líquido apenas cefálica à abertura vaginal.</li>
		<li>, Uma vez que a bexiga está localizada, a sonda bem lentamente cefálica para visualizar o útero gestante, que deve aparecer como uma forma cilíndrica com áreas redondas em sites de gravidez. Isto pode ser descrito como parecendo pérolas em uma cadeia de.</li>
		<li>Uma vez que o útero gestante foi identificado, começar a imagem 2-D.</li>
	</ol></li></ol> 4. A ecografia 2D (Figura 1) <ol><li>uma vez que o útero gestante foi identificado, começa no site da gravidez mais próximo à bexiga e lentamente e sequencialmente mover cefálica para determinar o número e localização dos sítios de gravidez.</li>
	<li>Se o rim, baço ou fígado é visualizado, reposicionar a sonda mais caudal (mais perto da bexiga) como o usuário já foi demasiado longe cefálica.</li>
	<li>o corno uterino contralateral da imagem da mesma maneira.</li>
	<li>Congelar a imagem quando o quadro de ultra-som está no centro do site implantação/gravidez para salvar para posterior análise e medições. 
	Nota: Demora menos de um segundo para a imagem a ser congelado e salvos para posterior análise.</li>
	Distância de implantação de <li>medida usando a reação de decidualization hiperecoico como um marcador manualmente clicando sobre o &#34; medida &#34; ferramenta primeiro e em seguida, clicando sobre a localização de um local de implantação. Em seguida, arraste o cursor para o próximo local de implantação e clique para desenhar uma linha que o computador automaticamente irá relatar a sua distância. O software então irá relatar o que é a medição manual. Esta etapa não é informatizada, mas depende do usuário para marcar a distância entre os locais decidualized desenhando uma linha entre os sites decidualized, que o programa irá fornecer uma medida for</li>
	<li>Medir o tamanho do implante, tamanho do saco gestacional e tamanho do polo fetal.</li>
</ol> 5. Ritmo cardíaco fetal Nota: no d.p.c 9.5, o batimento cardíaco fetal deve ser claramente visualizado.
<ol><li>, Mantendo a sonda muito ainda, girar sobre a onda de pulso Doppler e coloque-o sobre o visível heartbeat.</li>
	<li>Registro cardíaco o coração bater pulsações. 
	Nota: Para além do coração, este procedimento também pode gravar pulsações no cordão umbilical.</li>
</ol> 6. aquisição de ultra-som 3D <ol><li>depois que o útero gestante tem sido visualizado na imagem 2-D, posicionar a sonda em uma área que está no ponto médio aproximado a imagem desejada em 3D. Por exemplo, se uma foram de imagem de uma maçã em 3-d, a sonda deve inicialmente ser colocada onde o caroço da maçã está previsto ser localizado (ou seja, meio do objeto).</li>
	<li>Com a sonda em uma posição no meio a imagem desejada, obter uma aquisição em 3D. Fase 3-d motor viajará esta distância através do útero em uma série de passos ou quadros, com a intenção de capturar na totalidade o que o investigador deseja.</li>
	<li>Confirma que o pretendido estruturas completamente são capturadas na digitalização em 3D antes de completar a parte de ultra-som em tempo real. Salve essas informações em 3D para pós-processamento em um momento posterior. O tempo total para a aquisição de 2-D e 3-d ultrasom é aproximadamente 10-20 minutos quando executada por um usuário experiente.</li>
</ol> 7. reconstituição 3D pós-processamento (Figura 2) <ol><li>carregar os dados desejados para o processamento de imagem 3-d.</li>
	<li>Escolher &#34; paralelos e rotacionais métodos &#34;, que irá carregar todos os quadros de imagem 3D em um 3-d &#34; caixa &#34; que o usuário irá então traçar o objeto desejado em, quadro por quadro. Escolha o passo tamanho 0,08 mL. Começa em uma extremidade do bloco de imagem e percorrer para se familiarizar com as imagens que foram capturadas dentro espaço.
	<ol><li>Start em uma extremidade da imagem e manualmente trace o contorno do objeto.</li>
		<li>Rolar a próxima fatia de imagem 2-D ou &#34; quadro &#34; e manualmente, trace o contorno do objeto.</li>
		<li>Continue esse processo até que todos os quadros foram manualmente anotado/traçada pelo usuário.</li>
		<li>Clique &#34; terminar &#34; para obter a imagem em 3D e cálculos de volume total.</li>
	</ol></li> <li>Escolher entre malha e sobreposição de sólido, que é uma seta no canto superior esquerdo.</li>
	<li>Escolher manter ou remover as informações de imagem de ultra-som circundante de clareza. Cada reconstrução 3D pode demorar entre 10 e 20 min.</li>
</ol> 8. Cuidados pós-procedimento <ol><li>quando o ultra-som for concluído, desligue o gás de anestesia, remover o mouse da plataforma e Limpe suavemente e lavar qualquer gel de ultra-som do animal.</li>
	<li>Coloque o mouse volta na gaiola em posição em uma área acolchoada. Monitorar até que o animal está acordado e em movimento espontaneamente.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. No entanto deve notar-se que métodos histológicos ainda seria considerados mais ideais quando caracterização em um nível mais ampliada e mais celular é desejada...

Perda de gravidez precoce recorrente é uma das complicações mais comuns após a concepção e afeta aproximadamente 1% dos casais que tentam engravidar1,2. Os mecanismos subjacentes de perda de gravidez precoce são variados: de anormalidades embrionárias intrínsecas e comorbidades maternas para defeitos na receptividade endometrial1,3,4. Por causa de sua rastreabilidade genética, modelos do rato têm sido amplamente utilizados para investigações de implantação do embrião precoce e gravidez. Além disso, o curto tempo gestacional de mouse e a capacidade de realizar estudos em grande escala têm garantido o utilitário crescente do rato em abordar questões-chave clínicos em medicina reprodutiva humana5. Dito isto, a grande maioria dos projetos experimentais murino exige ainda numerosas barragens para ser sacrificado em dias gestacional sequenciais para quantificar e analisar os padrões de espaçamento, número, tamanho e localização do local de implantação durante a gravidez6, 7,8, impedindo, assim, estudos longitudinais do mesmo animal.
Na clínica, o ultra-som é uma ferramenta confiável e de valor inestimável para monitorar viabilidade fetal humana e desenvolvimento em uma forma não-invasiva9,10,11. Mais recentemente, ultra-som de alta frequência (HFUS) começou a encontrar aplicações limitadas no mouse, como um método para monitoramento da viabilidade fetal e crescimento durante gravidez12,13,14. Os recentes avanços tecnológicos em ultra-sonografia permitiram a aplicação de dados (3D) tridimensionais para reconstrução visual de órgãos animais e posterior acompanhamento de patologias15,16, 17. Utilização desta tecnologia de imagem avançada melhorou acentuadamente o poder de detectar flutuações de menor volume, para reduzir a variabilidade de animal para animal e para monitorar a progressão de uma patologia ou a eficácia de uma intervenção terapêutica17. Enquanto o utilitário principal desta tecnologia tem sido monitorar a progressão da malignidade em oncomouse modelos15,16, imagens 3D de HFUS só recentemente tem sido usada para quantificar e monitorar o crescimento ativo de implantação do embrião e desenvolvimento do feto no útero rato18.
Aqui, vamos demonstrar como executar HFUS imagem para produzir dados 2D e 3D para gerar reconstruções do útero rato grávida cedo. Vamos demonstrar a utilidade desse romance método para detectar esses eventos de implantação embrionária precoce sem a necessidade de cessação da gravidez, permitindo que os pesquisadores coletar dados de forma não-invasiva.

<table><tbody><tr><td>VisualSonics Vevo 2100 Plataforma de imagem de ultrassom / máquina</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Estação de Imagem Vevo</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>SA-11982</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Gel de transmissão de ultrassom</td><td>Parker</td><td>#SKU PLI 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Isotesia) Frasco de 100mL</td><td>Henry Shein</td><td>#29404</td><td></td></tr><tr><td>PuraLubenAnimal Pomada Oftálmica</td><td>Dechra</td><td>#12920060</td><td></td></tr></tbody></table>

um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no mouse

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Ultra-sonografia de alta frequência (HFUS) é um método comum de forma não-invasiva, monitorar em tempo real desenvolvimento do feto humano no útero. O mouse é usado rotineiramente como um modelo in vivo para estudar a implantação do embrião e progressão da gravidez. Infelizmente, tais estudos murino exigem a interrupção da gravidez para permitir o acompanhamento análise fenotípica. Para resolver esse problema, usamos a reconstrução tridimensional (3D), de HFUS imagens, para a detecção precoce e caracterização de locais de implantação do embrião murino e sua progressão no desenvolvimento individual no utero. Combinando HFUS imagem com reconstrução 3D e modelagem, fomos capazes de precisão quantificar o número de local de implantação de embriões, bem como monitorar a progressão do desenvolvimento em ratos grávidas C57BL6J/129S de 5,5 dias pós coito (d.p.c) através de 9,5 d.p.c com o uso de um transdutor. Medições incluídas: número, localização e volume de locais de implantação, bem como espaçamento inter implantação local; viabilidade do embrião foi avaliada pelo monitoramento da atividade cardíaca. O período pós-implantação imediato (5,5 a 8,5 d.p.c), reconstrução 3D do útero gravid em malha e sobreposição sólida formato habilitado uma representação visual das gravidezes em desenvolvimento dentro de cada corno uterino. Como os ratos geneticamente modificados continuam a ser usados para caracterizar fenótipos reprodutivos femininos, derivados de disfunção uterina, este método oferece uma nova abordagem para detectar, quantificar e caracterizar mais cedo implantação eventos na vivo. Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. Aqui usamos um formato de vídeo e texto para descrever como executar com sucesso ultra-sonografias de gravidez precoce de murino para gerar dados confiáveis e reprodutíveis, com reconstrução da forma uterina em malha e imagens 3D sólidas.

Conforme demonstrado na Figura 1, o ultra-som de alta frequência pode detectar a implantação local desenvolvimento começando tão cedo quanto o ponto de tempo 5.5 d.p.c. Usando o isqueiro hiperecoico decidualized endométrio como um marcador de locais de implantação no d.p.c 6.5 permite que o número de locais de implantação e o espaçamento desses sites para ser quantificada. Como a gravidez progride para 7,5 d.p.c, um saco gestacional de mais escuro Hipoecoica ...

Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

O objetivo geral deste procedimento de imagem por ultrassonografia é detectar, monitorar e caracterizar a gravidez precoce no camundongo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia reprodutiva murina e a estabelecer o crescimento, desenvolvimento e viabilidade das gestações precoces em camundongos. A principal vantagem dessa técnica é que essas gestações podem ser caracterizadas e fenotipadas in vivo, sem interrupção da gravidez do camundongo, permitindo a coleta longitudinal de dados.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em manter todas as imagens em um único plano. Isso se deve aos pequenos movimentos incrementais necessários no transdutor de ultrassom. Comece preparando o aparelho de ultrassom.Ligue o transdutor e, em seguida, conecte o estágio motor 3-D ao transdutor. Depois, fixe a sonda no suporte do transdutor. Agora, posicione o camundongo em decúbito dorsal sobre a plataforma de monitoramento.Administre anestésico por meio de cone nasal e fixe suavemente todas as patas nos sensores de monitoramento da frequência cardíaca na plataforma. Em seguida, aplique cerca de um ou dois mililitros de gel de transmissão ultrassono

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Ecocardiografia Fetal murino

Neste vídeo, demonstramos a ultrassonografia de alta frequência para obter imagens de locais de implantação embrionária em um modelo murino prenhe. Esta técnica de imagem detecta com sucesso a gravidez viável e caracteriza os locais de implantação do embrião durante o início da gravidez murina.

Caracterização precoce da gravidez baseada em ultrassonografia de alta frequência: uma técnica para estudar a implantação embrionária e a progressão da gravidez em modelo murino prenhes

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Imagem de ultra-som de alta frequência do mouse fetal melhorou a resolução de imagem e pode fornecer precisa caracterização não-invasivo do desenvolvimento cardíaco e defeitos estruturais. O protocolo descrito neste documento é projetado para executar em tempo real de ratos fetal ecocardiografia na vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Aqui descrevemos a técnica de ultra-som de alta frequência para análise na vivo de fetos em camundongos. Esse método permite o acompanhamento de fetos e a análise dos parâmetros da placenta, bem como o fluxo de sangue materno e fetal durante a gravidez.

Ultra-som de alta frequência para a análise do desenvolvimento Fetal e placentário na Vivo

O ultrassom de alta resolução pode ajudar a agilizar experimentos que requerem camundongos com tempo cronometrado, determinando o estado da gravidez, idade gestacional e perdas de gravidez. Apresentado aqui é um protocolo para ilustrar métodos para avaliar a gravidez do rato, bem como potenciais armadilhas (artefatos de imagem) que podem imitar a gravidez.

Meu rato está grávida? Avaliação de ultrassom de alta frequência

Este protocolo descreve um método para monitorar a progressão das alterações morfológicas ao longo do tempo no útero em um modelo induzível de câncer de endométrio em camundongos usando imagens ultrassonográficas com correlação com alterações macroscópicas e histológicas.

Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos

Este protocolo descreve uma técnica para avaliar alterações na vasculatura materna durante a gravidez em camundongos. Usando métodos estereológicos, o remodelamento das artérias espirais deciduais é avaliado quantitativamente e os resultados confirmados qualitativamente por imuno-histoquímica.

Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

Este trabalho apresenta um novo protocolo de processamento e imagem para análises de seção transversal de tecido grosso e tridimensional que permitem a exploração completa das modalidades de imagem confocal. Este protocolo preserva a antigenicidade e representa um sistema robusto para analisar histologia da pele e potencialmente outros tipos de tecido.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Aprenda a usar ultrassonografia tridimensional de alta frequência para caracterizar gravidez precoce em camundongos sem interromper a gestação. Este método permite coleta longitudinal de dados em biologia reprodutiva.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

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