Name: Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo único usando eletroforese em gel de acrilamida e imagem infravermelha fluorescente. Este método permite observar mudanças precisas na síntese de DNA.

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Este trabalho foi financiado pela corporação de pesquisa para o avanço científico (Cottrell faculdade Scholar Award #22548) e por TriLink biotecnologias (ResearchReward Grant #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
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<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
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<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
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<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
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<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um ensaio para caracterizar a síntese de DNA polimerase-mediada de M-DNA. Usando primers de DNA etiquetadas infravermelha, e usando a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação para resolver oligonucleotides diferente tamanhos, podemos obter resolução de nucleotídeo único no oligonucleotides, permitindo uma medição precisa da síntese. Estas abordagens podem ser usadas para medir também a actividade global da enzima (seção 2.1) ou para medir os parâmetros de Michaelis-Menten de etapas individuais...

As polimerases de DNA realizar preciso e eficiente síntese de DNA e são essenciais para a manutenção da integridade do genoma. A capacidade de sintetizar centenas de nucleotídeos por segundo sem cometer erros também faz ferramentas essenciais de polimerases de DNA na biologia molecular e biotecnologia. No entanto, essas propriedades também limitam as aplicações para substratos de M-DNA; de um modo geral, as polimerases de DNA naturais não podem sintetizar muitos substratos potencialmente valiosos de M-DNA, provavelmente devido à alta pressão seletiva contra o uso de substratos padronizado na vivo. Muitos grupos desenvolveram abordagens evolução dirigida para gerar as polimerases de DNA mutantes capazes de M-DNA síntese1um,2,3,4,5; Estes esforços têm se expandido o utilitário biotecnológico de DNA6,7,8.
Para avaliar a capacidade de polimerases de DNA mutantes de sintetizar DNA-M, nós9,10e outros11,12,13 normalmente usar medições em vitro de DNA atividade de polimerase, que são descritos neste manuscrito. Nesses experimentos, polimerases de DNA são co incubadas com um primer/modelo rotulado frente e verso e substratos de trifosfato de nucleósido; os produtos são avaliados por eletroforese em gel. Dependendo da pergunta específica experimental, polimerases de DNA mutantes, primers modificados, modelos modificados, ou trifosfatos de nucleósidos modificados podem ser usados, permitindo a avaliação sistemática e bioquímica da atividade da enzima mutante.
Historicamente, estes ensaios têm contado com um marcador radioativo 5' para controlar a síntese de DNA; mais comumente, 32P e 33P têm sido utilizados; Normalmente, rotulagem é conseguido usando T4 polinucleotídicas quinase11. No entanto, devido ao tempo de vida finito e custo relativamente alto de rótulos radioativos e sua eliminação segura, nosso grupo, em vez disso usa um sintético 5' infravermelha fluoróforo rotulado de DNA. Usando um gerador de imagens de custo relativamente baixo de gel de infravermelho próximo, temos observado semelhante limites de detecção para estudos prévios, usando rótulos radioativos (resultados não publicados). Podemos ter reproduzido com sucesso observações9, e não observamos nenhuma grande diferença quantitativa com constantes de velocidade medidos anteriormente (resultados não publicados).
Para analisar o tamanho do DNA e, portanto, a extensão da síntese de DNA, contamos com métodos de eletroforese de gel de poliacrilamida originalmente desenvolvidos por Sanger sequenciamento14 antes do advento da eletroforese capilar15. A distância de separação ou mobilidade pode ser usada como uma medida de peso molecular; grande formato, géis de poliacrilamida verticais poderão obter uma resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação quantitativa de oligonucleotídeos de DNA de diferentes comprimentos.
Coletivamente, estas experiências são um método robusto para caracterização de polimerase. Devido ao tempo de natureza sensível das reações, preparação e cuidado é necessária para atingir resultados reprodutíveis. Além disso, enquanto o gel do acrilamido é uma forma extremamente eficaz de medir a síntese do ADN, bem como numerosos outras DNA modificando as reações, com resolução de nucleotídeo único, pode ser tecnicamente desafiador. O protocolo aqui Espero que permitirá aos usuários realizar estas experiências, evitando os erros mais comuns.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA acetilado</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (ou seja, DTT)</td> <td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (ou seja, EDTA) (solução 0,5M)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (todos os outros NTPs modificados)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>primer sortido</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Sínteses</td> <td>PersonalizadasUsamos o corante IR700 que pode ser adquirido como uma síntese personalizada. Normalmente compramos os oligonucleotídeos purificados por HPLC. A sequência é 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>modelo 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Sínteses personalizadas</td><td>Normalmente compramos os oligonucleotídeos purificados por HPLC. A sequência é 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67% de acrilamida e 1,33% de bis-acrilamida</td></tr><tr><td>Tris / Borato / EDTA (TBE) sólido</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Ureia ultrapura</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Fita de gel</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Grande braçadeira de mola branca</td><td>polipropileno CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>espaçadores de 0,75 mm</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Conjunto de placas de vidro entalhado</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Separador de placa de cunha</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Comb para eletroforese em gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de eletroforese em gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td> ultrapura <td>usamos um sistema Milli-Q de</td></tr><tr><td>polimerases</td><td></td><td></td> <td>de DNA MilliporeNós os preparamos em nosso laboratório usando protocolos publicados.</td></tr></tbody></table>

ensaio da atividade de dna polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado dna visualizado pela electroforese do gel do acrilamido

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Para qualquer enzima, métodos quantitativos, robustos são necessários para a caracterização das enzimas nativas e engenharia. Para as polimerases de DNA, síntese de DNA pode ser caracterizado usando um em vitro DNA síntese ensaio seguido por eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo deste ensaio é quantificar a síntese de DNA natural e DNA modificado (M-DNA). Essas abordagens são particularmente úteis para a resolução de oligonucleotídeos com resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação dos passos individuais durante a síntese do oligonucleotide enzimática. Esses métodos foram aplicados à avaliação de uma matriz de propriedades bioquímicas e biofísicas tais como a medição das constantes de velocidade de estado estacionário de etapas individuais da síntese de DNA, a taxa de erro de síntese de DNA e afinidade de ligação do DNA. Usando modificado componentes incluindo, mas não limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-DNA, e/ou mutante DNA polimerase, a utilidade relativa de substrato-DNA polimerase pares podem ser efetivamente avaliados. Aqui, detalhamos o ensaio em si, incluindo as alterações que devem ser feitas para acomodar a primeira demão não tradicionais DNA rotulagem estratégias tais como infravermelha fluorescente etiquetado DNA. Além disso, temos detalhados etapas técnicas cruciais para gel do acrilamido derramando e execução, que pode muitas vezes ser tecnicamente desafiador.

Uma análise do gel de polyacrylamide bem sucedida de uma caracterização qualitativa da atividade global (descrito na seção 2.1, Figura 1) e da cinética do estado estacionário (descrito na observação na conclusão da seção 2.1, Figura 2) são mostrados. Uma análise do gel de polyacrylamide vencida também é mostrada (Figura 3).
Observe que não ...

Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo individual. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da DNA polimerase, como quais etapas específicas da síntese de DNA são limitadas por modificações no DNA. A principal vantagem desta técnica é que permite observar alterações em nucleotídeos individuais, possibilitando uma observação precisa da atividade da polimerase.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de planejar com antecedência. Muitas das etapas são sensíveis ao tempo. Para iniciar este procedimento, prepare primeiro os tampões, a mistura de dupla hélice de DNA e a diluição da proteína conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, ajuste a temperatura de um banho seco para 50 graus Celsius. Adicione 24 microlitros da mistura de duplex enovelado a um tubo de microcentrifugação contendo 25 microlitros de dNTPs 2X. Após isso, transfira 9,8 microlitros dessa mistura para um tubo de microcentrifugação contendo 20 microlitros de tampão de quenching laranja para preparar o controle sem enzima.Em seguida, adicione 0,8 microlitros da enzima 50X à mistura de dNTPs dupla. Utilize uma pipeta de grande volume para misturar completamente a solução. Incube no banho seco.Interrompa a reação removendo 10 microlitros de cada mistura de reação e adicionando-os a um tubo de microcentrífuga contendo 20 microlitros de tampão de interrupção laranja. Prepare a mistura de acrilamida para eletroforese em gel conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, lave duas placas de gel de 33 centímetros por 42 centímetros cuidadosamente com sabão e água.Seque cada face da placa com toalhas de papel e, em seguida, use lenços de tarefa delicados para secar as áreas restantes. Enxágue as placas secas com etanol 70% e limpe cada uma novamente com lenços de tarefa. Depois disso, passe a mão com luva sob água desionizada e, usando os dedos umedecidos, umedeça suavemente alguns espaçadores de 0,75 milímetro.Coloque as calços ao longo da borda da placa entalhada. Utilize lenços descartíveis para limpar qualquer água que possa ter respingado nas placas. Junte as placas e, em seguida, use fita de gel para cobrir a parte inferior e os lados, deixando a parte superior sem fita.Certifique-se de que a fita está alinhada uniformemente e selada firmemente. Com uma lâmina, corte as extremidades da fita. Em seguida, adicione uma camada adicional de fita na parte inferior do gel.Após preparar os reagentes, obtenha um frasco com bico e remova o funil pontiagudo. Usando um cilindro graduado, adicione 125 mililitros de água. Em seguida, use uma caneta permanente para marcar o nível da água na parte externa do frasco.Descarte a água. Em seguida, monte os anéis de rolha e o "sanduíche" de placas ao lado de uma pia conforme descrito no protocolo textual. Coloque o frasco de água destilada vazio e as soluções preparadas de APS e TEMED no outro lado da pia.Coloque um pente de poços com o número desejado de poços e quatro grampos por perto. Em seguida, adicione a solução de gel de acrilamida 20% ao frasco com bico até atingir o nível marcado. Simultaneamente, adicione 120 microlitros de TEMED e 600 microlitros de APS à solução de gel de poliacrilamida.Adicione rapidamente mais 600 microlitros de APS. Tampe imediatamente o frasco com bico e misture girando suavemente. Em seguida, coloque o conjunto de placas na pia.Comece a despejar, aplicando pressão lenta e constante na garrafa para garantir que a solução do gel escoe de forma contínua. Despeje até que o gel atinja a área entalhada e transborde levemente pela borda entalhada. Incline as placas para remover quaisquer bolhas de ar.Em seguida, adicione o pente ao sanduíche de placa. Posicione as grampos no pente de modo que pressionem para baixo, permitindo uma distribuição uniforme dos poços. Descarte rapidamente qualquer solução de gel restante na garrafa de lavagem em um recipiente apropriado para resíduos.Enxágue com água desionizada três vezes através do bico do frasco de lavagem para limpar o frasco. Para iniciar, remova todos os clipes de papel da sanduíche de placas. Usando uma lâmina, corte e remova a fita adesiva da borda do gel.Limpe as superfícies de vidro com toalhas de papel e água para remover o máximo possível de resíduo de gel polimerizado. Use uma lâmina nas bordas para raspar qualquer gel remanescente. Em seguida, empurre uniformemente o pente de poços em ambos os lados para removê-lo.Usando uma lâmina de barbear, corte qualquer gel em excesso ao longo da parte superior do sanduíche de placas. Em seguida, corte ao longo da borda entalhada da placa. Usando uma seringa e água desionizada, enxágue os poços para remover qualquer resíduo.Certifique-se de que cada poço possa ser preenchido com água e não esteja obstruído por excesso de gel polimerizado. Em seguida, coloque o sanduíche de placas no aparelho de modo que a placa mais longa fique voltada para fora, enquanto o espaço entalhado fica voltado para dentro. Prenda o sanduíche de placas e a placa de alumínio juntos ao aparelho.Adicione clipes adicionais na parte externa da placa para promover uma corrida uniforme. Adicione o tampão TBE usando apenas o suficiente para cobrir as ranhuras da base e os poços no topo. Execute a eletroforese em gel a 50 watts por 20 minutos para aquecer as placas.Após isso, utilize uma seringa e tampão TBE para limpar os poços. Repita a lavagem com a seringa várias vezes para garantir que todos os sais residuais do tampão tenham sido removidos dos poços. Em seguida, prepare as faixas mais externas de cada lado conforme descrito no protocolo textual.Adicione três microlitros de formamida a 95% com azul de bromofenol aos poços apropriados do gel. Carregue todas as amostras e deixe-as assentar por um minuto. Após conectar o aparelho e a fonte de energia, ajuste a potência entre 50 e 55 watts.Execute o gel por aproximadamente três horas ou até que a frente do corante azul de bromofenol tenha percorrido pelo menos dois terços do caminho pelo gel. Após isso, visualize o gel conforme descrito no protocolo textual. Neste estudo, um ensaio é desenvolvido para caracterizar a síntese mediada por DNA polimerase de DNA modificado.Uma caracterização qualitativa bem-sucedida da atividade geral mostra bandas individuais bem definidas e regulares. A atividade é avaliada tanto pelo comprimento dos produtos quanto pela porção do iniciador marcado que é convertida em produtos maiores. Como pode ser observado, E6 e E5 são as enzimas mais ativas, enquanto E4 e E1 são as menos ativas.Uma análise quantitativa utilizando cinética no estado estacionário também pode ser realizada usando estes métodos. Como apenas os produtos N e N+1 são sintetizados, o evento singular pode ser quantificado com sucesso. A metodologia básica descrita aqui também pode ser utilizada para estudar diversas outras enzimas que modificam DNA ou RNA, além das polimerases.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

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Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.

Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Este protocolo descreve um ensaio de replicação de DNA de molécula única baseado em microscopia de fluorescência, permitindo a visualização em tempo real das interações entre DNA polimerases e obstáculos como estruturas G-quadruplex.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Aprenda a analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo único usando eletroforese em gel de acrilamida e imagem infravermelha fluorescente. Este método permite observar mudanças precisas na síntese de DNA.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

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