Name: Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo único usando eletroforese em gel de acrilamida e imagem infravermelha fluorescente. Este método permite observar mudanças precisas na síntese de DNA.

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Este trabalho foi financiado pela corporação de pesquisa para o avanço científico (Cottrell faculdade Scholar Award #22548) e por TriLink biotecnologias (ResearchReward Grant #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um ensaio para caracterizar a síntese de DNA polimerase-mediada de M-DNA. Usando primers de DNA etiquetadas infravermelha, e usando a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação para resolver oligonucleotides diferente tamanhos, podemos obter resolução de nucleotídeo único no oligonucleotides, permitindo uma medição precisa da síntese. Estas abordagens podem ser usadas para medir também a actividade global da enzima (seção 2.1) ou para medir os parâmetros de Michaelis-Menten de etapas individuais...

As polimerases de DNA realizar preciso e eficiente síntese de DNA e são essenciais para a manutenção da integridade do genoma. A capacidade de sintetizar centenas de nucleotídeos por segundo sem cometer erros também faz ferramentas essenciais de polimerases de DNA na biologia molecular e biotecnologia. No entanto, essas propriedades também limitam as aplicações para substratos de M-DNA; de um modo geral, as polimerases de DNA naturais não podem sintetizar muitos substratos potencialmente valiosos de M-DNA, provavelmente devido à alta pressão seletiva contra o uso de substratos padronizado na vivo. Muitos grupos desenvolveram abordagens evolução dirigida para gerar as polimerases de DNA mutantes capazes de M-DNA síntese1um,2,3,4,5; Estes esforços têm se expandido o utilitário biotecnológico de DNA6,7,8.
Para avaliar a capacidade de polimerases de DNA mutantes de sintetizar DNA-M, nós9,10e outros11,12,13 normalmente usar medições em vitro de DNA atividade de polimerase, que são descritos neste manuscrito. Nesses experimentos, polimerases de DNA são co incubadas com um primer/modelo rotulado frente e verso e substratos de trifosfato de nucleósido; os produtos são avaliados por eletroforese em gel. Dependendo da pergunta específica experimental, polimerases de DNA mutantes, primers modificados, modelos modificados, ou trifosfatos de nucleósidos modificados podem ser usados, permitindo a avaliação sistemática e bioquímica da atividade da enzima mutante.
Historicamente, estes ensaios têm contado com um marcador radioativo 5' para controlar a síntese de DNA; mais comumente, 32P e 33P têm sido utilizados; Normalmente, rotulagem é conseguido usando T4 polinucleotídicas quinase11. No entanto, devido ao tempo de vida finito e custo relativamente alto de rótulos radioativos e sua eliminação segura, nosso grupo, em vez disso usa um sintético 5' infravermelha fluoróforo rotulado de DNA. Usando um gerador de imagens de custo relativamente baixo de gel de infravermelho próximo, temos observado semelhante limites de detecção para estudos prévios, usando rótulos radioativos (resultados não publicados). Podemos ter reproduzido com sucesso observações9, e não observamos nenhuma grande diferença quantitativa com constantes de velocidade medidos anteriormente (resultados não publicados).
Para analisar o tamanho do DNA e, portanto, a extensão da síntese de DNA, contamos com métodos de eletroforese de gel de poliacrilamida originalmente desenvolvidos por Sanger sequenciamento14 antes do advento da eletroforese capilar15. A distância de separação ou mobilidade pode ser usada como uma medida de peso molecular; grande formato, géis de poliacrilamida verticais poderão obter uma resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação quantitativa de oligonucleotídeos de DNA de diferentes comprimentos.
Coletivamente, estas experiências são um método robusto para caracterização de polimerase. Devido ao tempo de natureza sensível das reações, preparação e cuidado é necessária para atingir resultados reprodutíveis. Além disso, enquanto o gel do acrilamido é uma forma extremamente eficaz de medir a síntese do ADN, bem como numerosos outras DNA modificando as reações, com resolução de nucleotídeo único, pode ser tecnicamente desafiador. O protocolo aqui Espero que permitirá aos usuários realizar estas experiências, evitando os erros mais comuns.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA acetilado</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (ou seja, DTT)</td> <td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (ou seja, EDTA) (solução 0,5M)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (todos os outros NTPs modificados)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>primer sortido</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Sínteses</td> <td>PersonalizadasUsamos o corante IR700 que pode ser adquirido como uma síntese personalizada. Normalmente compramos os oligonucleotídeos purificados por HPLC. A sequência é 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>modelo 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Sínteses personalizadas</td><td>Normalmente compramos os oligonucleotídeos purificados por HPLC. A sequência é 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67% de acrilamida e 1,33% de bis-acrilamida</td></tr><tr><td>Tris / Borato / EDTA (TBE) sólido</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Ureia ultrapura</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Fita de gel</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Grande braçadeira de mola branca</td><td>polipropileno CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>espaçadores de 0,75 mm</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Conjunto de placas de vidro entalhado</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Separador de placa de cunha</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Comb para eletroforese em gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de eletroforese em gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td> ultrapura <td>usamos um sistema Milli-Q de</td></tr><tr><td>polimerases</td><td></td><td></td> <td>de DNA MilliporeNós os preparamos em nosso laboratório usando protocolos publicados.</td></tr></tbody></table>

ensaio da atividade de dna polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado dna visualizado pela electroforese do gel do acrilamido

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Para qualquer enzima, métodos quantitativos, robustos são necessários para a caracterização das enzimas nativas e engenharia. Para as polimerases de DNA, síntese de DNA pode ser caracterizado usando um em vitro DNA síntese ensaio seguido por eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo deste ensaio é quantificar a síntese de DNA natural e DNA modificado (M-DNA). Essas abordagens são particularmente úteis para a resolução de oligonucleotídeos com resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação dos passos individuais durante a síntese do oligonucleotide enzimática. Esses métodos foram aplicados à avaliação de uma matriz de propriedades bioquímicas e biofísicas tais como a medição das constantes de velocidade de estado estacionário de etapas individuais da síntese de DNA, a taxa de erro de síntese de DNA e afinidade de ligação do DNA. Usando modificado componentes incluindo, mas não limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-DNA, e/ou mutante DNA polimerase, a utilidade relativa de substrato-DNA polimerase pares podem ser efetivamente avaliados. Aqui, detalhamos o ensaio em si, incluindo as alterações que devem ser feitas para acomodar a primeira demão não tradicionais DNA rotulagem estratégias tais como infravermelha fluorescente etiquetado DNA. Além disso, temos detalhados etapas técnicas cruciais para gel do acrilamido derramando e execução, que pode muitas vezes ser tecnicamente desafiador.

Uma análise do gel de polyacrylamide bem sucedida de uma caracterização qualitativa da atividade global (descrito na seção 2.1, Figura 1) e da cinética do estado estacionário (descrito na observação na conclusão da seção 2.1, Figura 2) são mostrados. Uma análise do gel de polyacrylamide vencida também é mostrada (Figura 3).
Observe que não ...

Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo individual. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da DNA polimerase, como quais etapas específicas da síntese de DNA são limitadas por modificações no DNA. A principal vantagem desta técnica é que permite observar alterações em nucleotídeos individuais, possibilitando uma observação precisa da atividade da polimerase.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de planejar com antecedência. Muitas das etapas são sensíveis ao tempo. Para iniciar este procedimento, prepare primeiro os tampões, a mistura de dupla hélice de DNA e a diluição da proteína conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, ajuste a temperatura de um banho seco para 50 graus Celsius. Adicione 24 microlitros da mistura de duplex enovelado a um tubo de microcentrifugação contendo 25 microlitros de dNTPs 2X. Após isso, transfira 9,8 microlitros dessa mistura para um tubo de microcentrifugação contendo 20 microlitros de tampão de quenching laranja para preparar o controle sem enzima.Em seguida, adicione 0,8 microlitros da enzima 50X à mistura de dNTPs dupla. Utilize uma pipet

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Bioquímica

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Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

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Aprenda a analisar a atividade da DNA polimerase em nível de nucleotídeo único usando eletroforese em gel de acrilamida e imagem infravermelha fluorescente. Este método permite observar mudanças precisas na síntese de DNA.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

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