Name: Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprenda a otimizar meios de cultivo microbianos usando design experimental baseado em Kriging e tecnologia de microbioreator. Este método iterativo acelera o desenvolvimento de processos de produção de proteínas heterólogas com maior eficiência.

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As atividades científicas do centro de ciência de bioeconomia foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da inovação, ciência e pesquisa no âmbito da BioSC NRW-Strategieprojekt (n º 313/323-400-002-13). Os autores agradecer o Ministério da inovação, ciência e pesquisa do Norte-Vestfália e a Heinrich Heine University Düsseldorf para uma bolsa de estudos para Lars Freier dentro Cluster CLIB-pós-graduação Biotecnologia Industrial. Mais financiamento foi recebido do programa espaços habilitando "Laboratórios de inovação de Helmholtz" da associação alemã de Helmholtz para apoiar o "microbiana Bioprocessos laboratório – A Helmholtz laboratório de inovação".

Os autores não têm nada para divulgar.

A natureza genérica do protocolo apresentado permite várias adaptações, por exemplo, para estudar a expressão microbiana anfitriões9,47,,48,49,50, 51, ou para otimizar a outras propriedades da proteína alvo, como títulos do padrão ou dissulfureto de glicosilação. O protocolo também pode precisar de ser adaptado para o equipamento de laboratório disponíveis. A integração de um sistema MBR permite aumentando o throughput experimental, que permite grande economia no tempo. No entanto, quando substituindo biorreatores totalmente instrumentados e controláveis pelos sistemas MBR, escalabilidade dos resultados deve ser considerada8,37,52,53. O uso de metodologias DOE e modelagem matemática ajuda a maximizar o conteúdo de informação de dados de medição em relação a objetiva estudados54 por eficiente planejamento experimental e de interpretação de dados baseados em modelo15.
Modificações para o método Ao lado de múltiplos propósito e expansível robótico líquido manipulação de sistemas como o usado neste estudo, deve-se mencionar que existem vários líquido menor manipulação sistemas comercialmente disponíveis, que são capazes de executar esta tarefa e podem ser colocados dentro bancada de trabalho de fluxo laminar. Se nenhum sistema automatizado de pipetagem é disponível, composições de meios diferentes de acordo com o plano DOE também podem ser realizadas por pipetagem manual usando pipetas única e/ou multi-canal. Desde a preparação manual é mais propenso a erros e exigirá trabalho altamente concentrado por muito tempo, é aconselhável preparar um número menor de composições diferentes mídias.
Dependendo dos recursos do sistema MBR independente, o protocolo de cultivo correspondente irá variar. Por exemplo, se nenhuma medição on-line de formação de biomassa está disponível, pode ser suficiente medir a concentração de biomassa após a conclusão do experimento crescimento. Em combinação com monitoramento on-line do pH e oxigênio dissolvido, que é implementado em vários sistemas MBR, a saturação de crescimento pode ser determinada com segurança. Em princípio, as experiências de crescimento podem ser conduzidas no MTPs sozinho colocados dentro de incubadoras, sem o uso de um sistema MBR a tremer. Neste caso, as condições de cultivo adequado tem que ser assegurada: cultivos de oxigênio-limitada (1) podem ser evitado pelo uso do MSDN com geometrias adequadas, em combinação com adequada frequências a tremer e tremer diâmetros, por exemplo, quadrado 96 ou 24 profunda placas bem operado a 1.000 rpm em jogar apenas 3 mm ou a 250 rpm em passos de 25 mm, respectivamente. Importante, quanto mais baixo as taxas de transferência de oxigênio máxima atingível, menor a fonte principal de carbono deve ser concentrada. Como mencionado acima, para este estudo, o uso de glicose 10 g/L foi adequado para evitar a limitação de oxigênio para as condições de cultivo empregados; (2) a amostragem das culturas MTP para quantificação de biomassa e o produto deve ser reduzida ao mínimo. Cada vez que o MTP é retirado da incubadora tremendo, transferência de oxigênio será imediatamente avaria que pode resultar em condições desfavoráveis de cultivo; (3) na opinião dos autores, o uso de leitores MTP como dispositivos de cultivo não é recomendado como esses dispositivos não foram desenvolvidos para esta finalidade. Por exemplo, agitação mecânica foram construídas para a mistura ocasionais de microplacas após a adição do reagente e, muitas vezes falta-lhes robustez para corridas longas de duração agitação contínua por dias. Além disso, entrada de alimentação suficiente necessária para cultivos microbianos não pode ser realizada nesses leitores. A integração das leituras de densidade óptica em breve intervalos de tempo requer parada do movimento de agitação, resultando em períodos repetidos de limitação de oxigênio. Além disso, a evaporação em tais sistemas, durante períodos de longo período de cultivo vai distorcer os resultados. Para obter mais detalhes sobre o tema surpreendentemente complexo sobre o uso do MSDN para cultivos microbianos, o leitor é referido a literatura citada22,23,24,25,26 e referências ali.
Considerações adicionais A passos de otimização iterativo de acelerar, é aconselhável selecionar cuidadosamente o método analítico para quantificação do produto. Rápido e simples métodos devem ser preferidos ao custo de precisão e exatidão, como a estratégia de projeto experimental iterativo tolera imprecisão experimental. No entanto, os resultados finais devem ser cotejados com métodos de quantificação do produto suficientemente precisa e exata que pode ser mais complicado. Em geral, cuidadosa avaliação e tomada de decisão sobre os procedimentos de estudo requerem esforço no início do estudo, mas pagam a longo prazo, depois que se estabeleceram métodos de rotina.
É altamente recomendável para definir um experimento de referência é comparado a todas as experiências durante a otimização. Ou seja, as concentrações de componente média aplicada, bem como saída medida é normalizada através de dividindo por valores de referência. Desta forma, cada um aplicado e o valor medido pode ser interpretado como a x-dobra o valor de referência. Para tomar em conta as variações entre as placas, cinco experimentos de referência são executados em cada prato. O valor médio dos resultados medidos é usado para a normalização.
Ele pode geralmente não ser garantido que o médio desenvolvido também é ideal para outras tensões. No entanto, o melhor médio provavelmente também será apropriado para cultivar variedades de expressão com pequenas diferenças genéticas, por exemplo, quando produzir variantes da enzima com substituições de aminoácidos única obtida (estudos de mutagênese Embora ainda única ponto foram descritas mutações para o metabolismo celular de efeito e expressão heteróloga desempenho55,56). Neste caso, o protocolo apresentado pode ser um primeiro passo, seguido por protocolos de expressão do elevado-throughput seleções57. Se o protocolo é usado para o desenvolvimento médio com escala-up subsequente para cultivos alimentados em lotes, o médio otimizado deve ser verificado para as respectivas condições de Bioprocessos, clone rastreio campanhas na microescala identificados diferente top artistas de diferentes estratégias de alimentação e de52,de meios de cultivo58. Além disso, o Danilo introduzido36 geralmente pode contribuir para otimização de Bioprocessos holística melhorada.Apenas recentemente, as capacidades da ferramenta foram estendidas para também oferecer suporte a multi-objetivo de otimização40, que pode ser importante para otimizar os dois processos de upstream e downstream59,60.

Tecnologia moderna genética recombinante permite a ampla utilização de enzimas técnicas para diversas aplicações na indústria farmacêutica, animal, alimentação, química orgânica e1,2,3de processamento de alimentos. A produção de enzimas técnicas em grandes quantidades é um tópico importante para a biotecnologia industrial e para a produção de proteínas recombinantes otimizado e ambos Coe e engenharia de Bioprocessos é necessária. Para a geração de cepas de produção eficientemente projetado, bibliotecas genéticas diferentes estão disponíveis, por exemplo, para a expressão de gene equilibrada4 ou aumento da secreção de eficiência5.
Corynebacterium glutamicum é um importante produtor de aminoácidos em escala industrial6,7 e representa um host atraente expressão não-convencionais para a produção de secreção de proteínas recombinantes8 ,9. O general secretora (Sec) e via de translocação gêmeo-arginina (Tat) estão presentes em c. glutamicum e foram aplicadas com êxito para a secreção de proteína recombinante10. Vasta experiência em engenharia de Bioprocessos em matéria de produção de aminoácidos em escala industrial, bem como a capacidade de secretar proteínas g/L de montantes11 e grande robustez relativa heterogeneidades de Bioprocessos, encontradas em larga escala cultivos12,13, faça glutamicum c. um organismo plataforma promissora para a produção de secreção de proteínas heterólogos em escala industrial.
Otimização de média nutrição é conhecida para melhorar a produção de proteína recombinante com sistemas microbianos14,15,16,17 e consequentemente, o ajustamento de médio composição é um passo gratificante em Bioprocessos desenvolvimento no que diz respeito a produtividade ideal18,19,20,21. Intensas pesquisas sobre a aplicação de placas de microtitulação (MTPs) para cultivo microbiano22,23,24 pavimentaram o caminho para o desenvolvimento e design de MTPs para cultivo microbiano25 ,26 e o desenvolvimento de sistemas baseados em MTP microbioreactor (MBR) com monitoramento on-line e ambiental controle27,28. MBR permite um aumento significativo na produtividade do cultivo experimental. Além disso, sistemas MBR decorrentes de outros tipos de biorreatores, por exemplo, colunas de bolhas ou mexido tanque reatores, estão disponíveis para Bioprocessos microbiana otimização29,30,31, 32.
Em geral, estudos de otimização beneficiam maior throughput experimental, que se torna ainda mais poderoso em combinação com metodologias DOE, como para avaliar as interações entre as variáveis de projeto ou reduzir os espaços de busca de alta dimensão. Consequentemente, o uso combinado de MBR sistemas, automação de laboratório e DOE provou para ser um método poderoso em biotecnologia8,16,33,34,35.
Apresenta-se um protocolo para otimização de mídia combinando a automação de laboratório de estado-da-arte, tecnologia MBR com acompanhamento de processo on-line e análise/experimental design Kriging-base de dados. A metodologia de Kriging é implementada em um Toolbox MATLAB ("KriKit"), que pode ser baixado e usado livre de carga36. Como exemplo de aplicação, maximização da produção de proteína (GFP) secretoras ﬂuorescent verde com c. glutamicum é mostrada através da otimização da composição do meio mínimo de CgXII. Título GFP foi escolhido como o objetivo de otimização, como isso pode ser quantificado facilmente e é aplicado extensamente como proteína de modelo para estudos sobre MBR sistemas37,38,39.
O quadro apresentado é dividido em quatro etapas, que são ilustradas na Figura 1. As etapas são indicadas por quadros de caixa e correspondem às seções do protocolo. A primeira etapa (figura 1A) é definir os objetivos do projeto e para determinar os métodos necessários. A combinação de metodologias DOE, MBR tecnologia e automação de laboratório permite uma maior throughput experimental que exige poderosa de processamento de dados. A segunda etapa (figura 1B) visa detectar variáveis de projeto sensível (isto é, componentes médios) com alta influência sobre o objetivo de otimização. Isto leva a um número reduzido de variáveis de projeto de interesse. A terceira etapa (Figura 1) é composto por uma otimização iterativa para uma investigação mais detalhada da relação funcional entre as restantes variáveis de projeto e o objetivo de interesse. Usando o conjunto de dados sucessivamente estendido, a abordagem de Kriging é aplicada para prever o resultado experimental em locais não mensuráveis. O ciclo iterativo é interrompida assim que o modelo de Kriging prevê um ideal ou um planalto com uma precisão suficiente. Os resultados são verificados na quarta etapa (Figura 1), começando com uma nova análise de sensibilidade em torno do optimum identificado. Se inicialmente, diferenciação de componentes são encontrados para ser insensível também na região ideal, é razoável supor que isto prende verdadeiro durante o procedimento iterativo de otimização na terceira etapa. Depois disso, é aconselhável verificar resultados de otimização da aplicação dos métodos ortogonais, como um ensaio de atividade ou SDS-Page.
A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de escolha, bem como mais Bioprocessos variáveis como a temperatura de pH valor ou cultivo.Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figura 1 : Fluxo de trabalho de estudo de otimização. As caixas de quatro quadros correspondem às seções do protocolo, "Conceber o estudo e definição de métodos" (secção 1), "Análise de sensibilidade" (secção 2), "Optimization iterativo" (secção 3) e "Validação" (secção 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Para cultivo no dispositivo BioLector</td></tr><tr><td>Folha de vedação</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Vedação estéril para Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>Disponível gratuitamente, instalação MATLAB necessária</td></tr><tr><td>Robô de pipetagem Janus</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Inclui instalação do software "WinPrep"</td></tr><tr><td>Microplaca de poço profundo de 12 colunas</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Recipiente para soluções de estoque médio</td></tr><tr><td>96 microplacas de poço, transparente, fundo F</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Para ensaio de proteína Bradford</td></tr><tr><td>&micro; microplacas transparentes de 96 poços, corpo preto, 655087 transparente de fundo F</td><td></td><td></td><td>Para medição de fluorescência em sobrenadantes sem células</td></tr><tr><td>Pesquisa de pipetas&nbsp; além de pipetas multicanais</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Facilita o manuseio manual de líquidos com microplacas</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp; Géis pré-moldados</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Para análise SDS-Page de supernantants livres de células</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Carrega plasmídeo pEKEx2 com fusão do gene GFP e peptídeo sinal PhoD de B.subtilis como inserção de expressão. O plasmídeo fornece resistência à canamicina. Descrito e publicado por Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash; 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de microbioreactor

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Um negócio em biotecnologia industrial usando fábricas de célula de produção microbiana é o processo iterativo de tensão de engenharia e otimização das condições de Bioprocessos. Um aspecto importante é a melhoria do meio de cultivo para fornecer um ambiente ideal para formação microbiana do produto de interesse. É bem aceite que a composição de mídia dramaticamente pode influenciar o desempenho geral de Bioprocessos. Otimização de média nutrição é conhecida por melhorar a proteína recombinante produção com sistemas microbianos e, portanto, este é um gratificante passo no desenvolvimento de Bioprocessos. No entanto, receitas de mídia padrão muitas vezes são tomadas a partir de literatura, desde o design à medida do meio de cultivo é uma tarefa tediosa que exige tecnologia microbioreactor para a taxa de transferência de cultivo suficientes, análise de produto rápido, bem como suporte por robótica de laboratório para permitir confiabilidade nas etapas de manuseio de líquidos. Além disso, métodos matemáticos avançados são necessários para racionalmente analisando dados de medição e projetar eficientemente experiências paralelas tais como conseguir conteúdo de informação ideal.
A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de interesse, bem como parâmetros de Bioprocessos ainda mais. Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização. O Toolbox de Kriging aplicada (KriKit) é uma ferramenta geral para Design de experimentos (DOE) que contribui para a optimização de Bioprocessos holística melhorada. Ele também suporta otimização multi-objetiva que pode ser importante na otimização de processos de upstream e downstream.

O protocolo introduzido foi aplicado para maximização do título do GFP secretado. Especificamente, o título GFP após 17 h de cultivo foi escolhido como o objetivo de otimização. Deteção de fluorescência on-line de GFP permitiu a quantificação simples produto. No entanto, a normalização do sinal GFP com dados de um cultivo de referência é indispensável para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade dos resultados. Uma pré-seleção de componentes de mídia foi realizada em uma base racional conforme descrito na seção 1. Foram realizados experimentos, seguindo as instruções da secção 1: os parâmetros dos procedimentos de laboratório molhado foram definidos para o estudo inteiro garantindo consistência e reprodutibilidade dos resultados.
Conforme descrito na secção 2, realizou-se uma triagem inicial para identificar os componentes relevantes mostrando um impacto significativo sobre o objetivo de otimização para o estudo mais adicional, mais detalhado. O sistema MBR MTP-baseado permite 48 experimentos a ser executadas em paralelo. Tendo em conta o número máximo possível de experiências paralelas em um MTP (48) e o número total de mídia componentes (11) faz o 2IV11-6 fracionário desenha uma escolha apropriada. Este projeto experimental compreende 32 experimentos e permite a estimativa do efeito principal para cada um dos componentes de mídia investigadas. Os restantes poços de cultivo (16) foram usados para múltiplas repetições de experiências com o meio de referência para avaliar a reprodutibilidade e efeitos posicionais. Ou seja, cada experimento é executado uma vez (sem repetições), exceto o experimento de referência (cinco repetições).
A tabela 1 resume os resultados da análise de rastreio. Na faixa de concentração considerada, variando a maioria dos componentes de mídia não mostrou um efeito perceptível sobre o objetivo. Componente de NH4+ mostra um forte efeito negativo, enquanto Ca2 + e Mg2 + mostram a tendência positiva mais forte. O efeito de Mg2 + não é significativo para o intervalo de concentração atual, mas pode ser para uma gama mais ampla de concentração. Consequentemente, decidiu-se omitir o NH4+ do meio e investigar o efeito de Ca2 + e Mg2 + em novas experiências.
Seção 3 descreve o procedimento iterativo de otimização que é usado para maximizar o sinal de fluorescência do GFP enquanto variando as concentrações de Ca2 + e Mg2 +. Na iteração 1, foi testada a hipótese que NH4+ pode ser omitido. O intervalo de concentração de Ca2 + e Mg2 + foi adotado a partir da análise de rastreio. A concentração mínima de NH4+ foi definida como zero e a concentração máxima foi adoptada no experimento de triagem. Nos experimentos seguintes, as concentrações do componente foram distribuídas em um 3 x 3 x 3 grade dentro do intervalo de concentração definida, resultando em 27 experimentos. Durante todos os cultivos, cinco repetições do meio de referência foram incluídas, que serviu como padrão interno e para garantir que não há efeitos posicionais sobre o MTP ocorreram. Para os restantes 16 poços, as concentrações de NH4+, Ca2 +e Mg2 + foram aleatoriamente distribuídas dentro das escalas determinadas.
Figura 5 A visualiza os resultados das primeiras iterações. Rótulos de eixo referem-se as concentrações do componente usadas no meio de referência original, indicado por x Ref. As superfícies de azuis representam as interpolações de krigagem que foram calculadas utilizando o software KriKit. Cada superfície é associado com um nível de concentração relativa de NH4+ (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Esta representação visual revela que é favorável para omitir NH4+. Superfícies de interpolação também mostram os efeitos positivos de Mg2 + e Ca2 +, como todos os aviões ascensão com concentrações crescentes.
Baseado nos resultados da iteração 1, decidiu expandir a concentração gama de Ca2 + e Mg2 + , duplicando as concentrações máximos e deslocando a janela de desenho experimental para o canto superior direito, ver Figura 5 B. dentro deste intervalo, as concentrações foram distribuídas em uma grade 6 x 6. Isso garante uma distribuição uniforme ao longo do intervalo de concentração total, levando a resultados óptimos de interpolação Kriging. Figura 5 B mostra a trama de interpolação Kriging baseada em dados combinados medido em ambas as iterações (pontos vermelhos e amarelos quadrados). Para tanto, Ca2 + e Mg2 +, o efeito positivo de aumentar suas concentrações continua. Consequentemente, o procedimento foi repetido, duplicando a concentração máxima e assim, a janela de desenho experimental foi movida para explorar os limites do canto superior direito.
Figura 6 A dá uma visão geral do processo de otimização restantes. A análise do conjunto de dados recolhido até iteração 3 revelou que uma limitação do efeito positivo de Mg2 +, ou seja, uma concentração óptima gama de Mg2 + foi identificada. Por conseguinte, decidiu expandir ainda mais o intervalo de concentração apenas para Ca2 + (iteração 4). Este procedimento foi repetido duas vezes (iteração 5 e 6) até que uma saturação do sinal de GFP foi encontrada. Esta saturação é explicada pela precipitação de sais de Ca para as concentrações aplicadas de Ca2 +, que não estão disponíveis para as células.
Como resultados experimentais são sempre perturbados pelo barulho, a resultante interpolação Kriging aparece irregular e inspeção visual pode levar a conclusões falsas. No entanto, o intervalo de concentração ideal de componentes de mídia para o sinal GFP saturado pode ser confiantemente identificado com o estatística z -teste, que também é implementado no Danilo. O z -teste usa diretamente a informação estatística intrínseca fornecida pela krigagem método, ou seja, valores de previsão e incertezas de previsão. Figura 6 B mostra o planalto identificado, como determinado e visualizado usando a caixa de ferramentas do Danilo.A caixa de ferramentas do Danilo é livremente disponível36 e vem com um tutorial detalhado que explica como usar seus recursos.
Se mais de dois componentes relevantes são encontrados, 3D-visualização atinge seu limite. Danilo fornece vários outros métodos de representação visual possível, tais como filmes ou "trama de triagem". Se o potencial ideal está dentro do intervalo de concentração definidas, novas experiências são projetadas automaticamente usando a melhoria esperada de40,46. O delineamento experimental baseado na melhoria esperada é integrado na caixa de ferramentas Danilo. Informações mais detalhadas podem ser encontradas na documentação do software.
Após o procedimento iterativo, foi realizada uma verificação dos resultados, conforme descrito na parte D. A validade dos pressupostos iniciais foi verificada através da realização de uma análise de sensibilidade adicional usando a composição ideal média. Ou seja, todos os componentes de mídia inicial de interesse eram variados, mas Ca2 + e Mg2 + foram definidas para seus níveis de concentração ideal. Neste estudo, as concentrações ideais <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref foram escolhidos. A tabela 2 mostra os resultados da análise validação. Semelhante a sensibilidade inicial de triagem (cf. quadro 1), NH4+ ainda tem uma influência negativa significativa e efeitos restantes são ainda insignificantes.
Devido ao fácil acesso, o sinal de fluorescência do GFP da suspensão do cultivo foi utilizado para quantificar o título GFP extracelular durante todos os experimentos. Por razões de verificação, fluorescência de GFP foi validada contra outras medições. Porque GFP é secretada através da via-Tat, o sinal de fluorescência não pode discriminar entre intrae extracelular GFP. Assim, cultivos foram reproduzidos usando o meio de referência e o médio otimizado. Além da medição de fluorescência de sobrenadantes de cultivo sem célula, teor de proteínas foi quantificado pelo ensaio de Bradford e (semi)-melhoria qualitativa de GFP visualizado por SDS-Page15. Toda a medida resultante sinaliza aproximadamente foram dobrados para cultivos com meio otimizado em relação ao meio de referência e validado a cerca de 100% de melhoria do desempenho de secreção de médio otimizado. Por conseguinte, fluorescência específica de GFP de suspensão de cultivo pode ser considerada uma métrica adequada para o objetivo de otimização, ou seja, o título GFP extracelular.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figura 2 : Captura de tela da lista de pipetagem de volume para a análise de sensibilidade. Entradas na primeira coluna atribuir um identificador exclusivo para todos os volumes de uma linha; Esse identificador é o MTP bom número do cultivo alvo MTP o worktable líquido manipulador, cf. Figura 4C. Colunas restantes encode volumes para diferentes soluções ("Sln-01" a "15-Sln") para ser pipetado. O volume acumulado de uma linha corresponde ao volume final de cultivo do bem correspondente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figura 3 : Screenshot do líquido manipulação de software de controle "WinPREP". Esquerda: Linha-ordenou comandos, incluindo um comando de transferência para cada solução a ser pipetado. Antes do comando final para adição do inóculo, um prompt de usuário é inserido para garantir que a cultura de semente é colocada na mesa na hora certa. Direita: Esquema de tabela de trabalho, incluindo a labware fonte para variação de existências (duas placas de poço profundo com 12 poços de coluna-como), a calha de reagente para estoque de descanso, água e inóculo e o cultivo de alvo de preparação de mídia MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figura 4 : Compilação de screenshots detalhados para instalação de pipetagem de uma solução stock. (A) desembrulhou o comando para pipetagem de estoque de Fe. Labware fonte e origem bem dentro são marcadas sobre o worktable pela leitura do quadro e coluna vermelha da placa correspondente de poço profundo. Labware de destino e destino poços dentro são marcados pelo quadro azul ao redor e azuis poços de cultivo o alvo MTP. (B) vista de exemplo detalhado na atribuição de pipetagem volumes para esta etapa (solução estoque de Fe). Número de destinos é ler a lista de pipetagem, que possui 48 linhas. Os volumes de distribuição para todos os poços de destino para solução estoque de Fe encontra-se na coluna 4 na lista de pipetagem. Observe que a primeira coluna na lista de pipetagem contém identificadores e volumes não ser transferido, ver Figura 2. (C) detalhes sobre destino bem numeração. Volumes de escritos na linha #1 da lista correspondente de pipetagem vão ser pipetados em bem marcado como #1 e assim por diante. Poços #01, 08 #, #41 e #48 correspondem aos poços A01, A08, F01 e F08 para a codificação alfa-numérico, que é também impresso em cultivo MTP em si. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figura 5 : Detalhados os resultados da primeira iteração. (A) interpolação Kriging baseado em dados experimentais de iteração 1. Pontos vermelhos indicam o conjunto de dados. Para comparação, todas as superfícies de interpolação três são sobrepostas em uma trama (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Uma representação alternativa dos resultados pode ser encontrada em outros lugares15. (B) interpolação Kriging baseada em experiências realizadas em iteração 1 (pontos vermelhos) e iteração 2 (quadrados amarelos).Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figura 6 : Descrição dos resultados de otimização iterativamente coletados. Kriging Final (A) modelo de previsão. (B) identificação estatística de área ideal (vermelho) baseia-se a estatística z-test, que é fornecido pelo Danilo. Caixas indicam sucessivas etapas de projeto iterativo e execução de experimentos. Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>Valor médio do coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3BO3-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: resultados da análise de sensibilidade. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Para ideais projetos experimentais, como encontrado na literatura padrão e usado aqui, o desvio-padrão representa diretamente a variação experimental devido à replicação do experimento referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0422 para componente Ca2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 0,54 e 0.0226, respectivamente.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>Valor médio do coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3BO3-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: resultados da análise de sensibilidade final. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Como um projeto experimental óptimo foi usado, o desvio padrão só depende a variação experimental usando a composição média otimizada. Variação experimental ligeiramente aumentada em comparação com a variação usando o meio de referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0106 para componente Mn2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 3.63 e 0.0385, respectivamente.

Este manuscrito descreve uma abordagem genérica de design à medida dos meios de cultivo microbiano. Isso é ativado por um fluxo de trabalho iterativo combinando Kriging experimental design e microbioreactor tecnologia para throughput de cultivo suficientes, que é apoiado pela robótica de laboratório para aumentar a confiabilidade e a velocidade em mídia de manuseio de líquidos preparação.

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

O objetivo geral deste fluxo de trabalho iterativo que combina o projeto experimental baseado em Kringing e a tecnologia de microbiorreator para um rendimento de cultivo suficiente é descrever uma abordagem genérica para o projeto personalizado de meios de cultivo microbiano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento de bioprocessos microbianos, como a otimização do meio de cultivo, condições do bioprocesso, bem como a fenotipagem de cepas. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando nos perguntamos se os meios de cultivo otimizados para a produção de pequenos metabólitos também são mais adequados para a produção de proteínas heterólogas.A principal vantagem dessa técnica é que ela acelera os tempos gerais de desenvolvimento por meio da combinação inteligente de experimento e modelagem. Demonstrando este procedimento estará Roman Jansen, um estudante de doutorado do meu laboratório. Comece este procedimento com a concepção do estudo e a definição dos métodos, conforme detalhado no protocolo de texto.Esterilize as placas de poços profundos para armazenamento de solução de estoque em uma mesa de trabalho, limpando as placas com etanol a 70% e, posteriormente, secando-as em uma capela de fluxo laminar. Iniciar a cultura de sementes inoculando 50 mililitros de meio BHI contendo 25 miligramas por litro de canamicina com uma alíquota do banco de células em funcionamento. Coloque todos os materiais de laboratório necessários na mesa de trabalho robótica e despeje as soluções de estoque no material de laboratório correspondente.Em seguida, inicie o fluxo de trabalho robótico para preparação do meio para que a última etapa, que é a inoculação, seja alcançada a tempo do início da cultura de sementes. Colete amostras da cultura de sementes após aproximadamente duas horas para monitorar o crescimento medindo a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD-600. Continue monitorando o crescimento a cada hora.Após aproximadamente cinco horas, a cultura atinge um O-D-600 entre três e quatro, e é usada para inocular as culturas principais. Coloque a cultura de sementes na mesa de trabalho do manipulador de líquidos e continue o protocolo de preparação do meio. Selar as placas de microtitulação de cultura após a inoculação.Em seguida, coloque o cultivo selado MTP no dispositivo Biolector. Em seguida, inicie o protocolo de cultivo predefinido. Descarte as soluções de estoque restantes de acordo com os regulamentos de biossegurança, se necessário.Em seguida, semeie a cultura da mesa de trabalho robótica. Limpe o material de laboratório reutilizável antes de iniciar o protocolo de descontaminação do manipulador de líquidos. Pare a cultura principal após um tempo de execução de 17 horas e processe os dados conforme descrito no protocolo de texto.Para quantificar o título GFP, primeiro transfira as suspensões celulares de todos os poços de cultivo para tubos de reação pré-rotulados. Em seguida, centrifugue as suspensões de células durante 10 minutos à velocidade máxima utilizando uma centrífuga de bancada para obter o sobrenadante sem células. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada sobrenadante livre de células para um MTP preto de 96 poços com fundo transparente.Leia a fluorescência específica GFP em 488 nanômetros para excitação e 520 nanômetros para comprimento de onda de emissão usando um leitor de microplacas apropriado. Depois de medir a fluorescência GFP, a microplaca pode ser usada diretamente para determinar o conteúdo de proteína dos sobrenadantes livres de células com protocolos padrão, como um ensaio de Bradford ou BCA. Por fim, prossiga para a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.O procedimento demonstrado constitui uma rodada de experimentos, os resultados são usados para projetar novas rodadas com a melhoria máxima esperada do sinal GFP. Experimentos de referência são colocados em cada rodada para analisar a variabilidade dos dados e detectar outliers experimentais. Este gráfico de contorno fornece uma visão geral do procedimento de otimização.A análise do conjunto de dados coletados por meio da iteração três revelou uma limitação do efeito positivo do magnésio, identificando uma faixa de concentração ideal. Decidiu-se, portanto, expandir ainda mais a faixa de concentração apenas para o cálcio na iteração quatro. O procedimento foi repetido duas vezes nas iterações cinco e seis até que uma saturação do sinal GFP fosse encontrada.Essa saturação é explicada pela precipitação de sal de cálcio para as concentrações aplicadas de cálcio, que não estão disponíveis para a célula. A sétima iteração foi usada para explorar os limites com mais detalhes. As faixas de concentração ideais dos componentes do meio para o sinal GFP saturado podem ser identificadas de forma confiável com um teste Z estatístico.Ele mostra o platô identificado conforme determinado e visualizado usando a caixa de ferramentas do kit de Kringing. A caixa de ferramentas do kit Kringing está disponível gratuitamente e vem com um tutorial detalhado que explica como usar seus recursos. A natureza genérica do protocolo apresentado permite várias adaptações, como o estudo de outros hospedeiros de expressão microbiana ou a otimização de outras propriedades da proteína alvo, como padrão de glicosilação ou ligações dissulfeto.A integração de um sistema embrion aumenta o rendimento experimental, o que permite grande economia de tempo Ao substituir biorreatores totalmente controláveis e influentes por sistemas amniares, a escalabilidade dos resultados deve ser considerada. A modelagem matemática e o planejamento de experimentos ajudam a maximizar o conteúdo de informações dos dados de medição em relação ao objetivo estudado.

generic-protocol-for-optimization-heterologous-protein-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocolo para Otimização da Produção de Proteínas Heterólogas Utilizando Tecnologia Automatizada de Microbioreator. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra o uso de um microbiorator automatizado para monitorar o crescimento bacteriano e a secreção de proteínas fluorescentes em resposta a diferentes formulações de meio. Uma bactéria geneticamente modificada que expressa uma proteína fluorescente secretora é cultivada sob seleção antibiótica e inoculada em poços...

Monitorando o Crescimento Bacteriano em Diferentes Formulações de Meios com um Microbiorator Automatizado

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda a otimizar meios de cultivo microbianos usando design experimental baseado em Kriging e tecnologia de microbioreator. Este método iterativo acelera o desenvolvimento de processos de produção de proteínas heterólogas com maior eficiência.

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

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