Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor
15 de dezembro de 2017
Este manuscrito descreve uma abordagem genérica de design à medida dos meios de cultivo microbiano. Isso é ativado por um fluxo de trabalho iterativo combinando Kriging experimental design e microbioreactor tecnologia para throughput de cultivo suficientes, que é apoiado pela robótica de laboratório para aumentar a confiabilidade e a velocidade em mídia de manuseio de líquidos preparação.
O objetivo geral deste fluxo de trabalho iterativo que combina o projeto experimental baseado em Kringing e a tecnologia de microbiorreator para um rendimento de cultivo suficiente é descrever uma abordagem genérica para o projeto personalizado de meios de cultivo microbiano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento de bioprocessos microbianos, como a otimização do meio de cultivo, condições do bioprocesso, bem como a fenotipagem de cepas. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando nos perguntamos se os meios de cultivo otimizados para a produção de pequenos metabólitos também são mais adequados para a produção de proteínas heterólogas.
A principal vantagem dessa técnica é que ela acelera os tempos gerais de desenvolvimento por meio da combinação inteligente de experimento e modelagem. Demonstrando este procedimento estará Roman Jansen, um estudante de doutorado do meu laboratório. Comece este procedimento com a concepção do estudo e a definição dos métodos, conforme detalhado no protocolo de texto.
Esterilize as placas de poços profundos para armazenamento de solução de estoque em uma mesa de trabalho, limpando as placas com etanol a 70% e, posteriormente, secando-as em uma capela de fluxo laminar. Iniciar a cultura de sementes inoculando 50 mililitros de meio BHI contendo 25 miligramas por litro de canamicina com uma alíquota do banco de células em funcionamento. Coloque todos os materiais de laboratório necessários na mesa de trabalho robótica e despeje as soluções de estoque no material de laboratório correspondente.
Em seguida, inicie o fluxo de trabalho robótico para preparação do meio para que a última etapa, que é a inoculação, seja alcançada a tempo do início da cultura de sementes. Colete amostras da cultura de sementes após aproximadamente duas horas para monitorar o crescimento medindo a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD-600. Continue monitorando o crescimento a cada hora.
Após aproximadamente cinco horas, a cultura atinge um O-D-600 entre três e quatro, e é usada para inocular as culturas principais. Coloque a cultura de sementes na mesa de trabalho do manipulador de líquidos e continue o protocolo de preparação do meio. Selar as placas de microtitulação de cultura após a inoculação.
Em seguida, coloque o cultivo selado MTP no dispositivo Biolector. Em seguida, inicie o protocolo de cultivo predefinido. Descarte as soluções de estoque restantes de acordo com os regulamentos de biossegurança, se necessário.
Em seguida, semeie a cultura da mesa de trabalho robótica. Limpe o material de laboratório reutilizável antes de iniciar o protocolo de descontaminação do manipulador de líquidos. Pare a cultura principal após um tempo de execução de 17 horas e processe os dados conforme descrito no protocolo de texto.
Para quantificar o título GFP, primeiro transfira as suspensões celulares de todos os poços de cultivo para tubos de reação pré-rotulados. Em seguida, centrifugue as suspensões de células durante 10 minutos à velocidade máxima utilizando uma centrífuga de bancada para obter o sobrenadante sem células. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada sobrenadante livre de células para um MTP preto de 96 poços com fundo transparente.
Leia a fluorescência específica GFP em 488 nanômetros para excitação e 520 nanômetros para comprimento de onda de emissão usando um leitor de microplacas apropriado. Depois de medir a fluorescência GFP, a microplaca pode ser usada diretamente para determinar o conteúdo de proteína dos sobrenadantes livres de células com protocolos padrão, como um ensaio de Bradford ou BCA. Por fim, prossiga para a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.
O procedimento demonstrado constitui uma rodada de experimentos, os resultados são usados para projetar novas rodadas com a melhoria máxima esperada do sinal GFP. Experimentos de referência são colocados em cada rodada para analisar a variabilidade dos dados e detectar outliers experimentais. Este gráfico de contorno fornece uma visão geral do procedimento de otimização.
A análise do conjunto de dados coletados por meio da iteração três revelou uma limitação do efeito positivo do magnésio, identificando uma faixa de concentração ideal. Decidiu-se, portanto, expandir ainda mais a faixa de concentração apenas para o cálcio na iteração quatro. O procedimento foi repetido duas vezes nas iterações cinco e seis até que uma saturação do sinal GFP fosse encontrada.
Essa saturação é explicada pela precipitação de sal de cálcio para as concentrações aplicadas de cálcio, que não estão disponíveis para a célula. A sétima iteração foi usada para explorar os limites com mais detalhes. As faixas de concentração ideais dos componentes do meio para o sinal GFP saturado podem ser identificadas de forma confiável com um teste Z estatístico.
Ele mostra o platô identificado conforme determinado e visualizado usando a caixa de ferramentas do kit de Kringing. A caixa de ferramentas do kit Kringing está disponível gratuitamente e vem com um tutorial detalhado que explica como usar seus recursos. A natureza genérica do protocolo apresentado permite várias adaptações, como o estudo de outros hospedeiros de expressão microbiana ou a otimização de outras propriedades da proteína alvo, como padrão de glicosilação ou ligações dissulfeto.
A integração de um sistema embrion aumenta o rendimento experimental, o que permite grande economia de tempo Ao substituir biorreatores totalmente controláveis e influentes por sistemas amniares, a escalabilidade dos resultados deve ser considerada. A modelagem matemática e o planejamento de experimentos ajudam a maximizar o conteúdo de informações dos dados de medição em relação ao objetivo estudado.
Visão Geral
Este manuscrito descreve uma abordagem genérica para o projeto sob medida de meios de cultivo microbiano utilizando um fluxo de trabalho iterativo. Este método combina o planejamento experimental baseado em Kriging e a tecnologia de microbioreatores para aumentar a produtividade e a confiabilidade do cultivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Desenvolvimento de bioprocessos microbianos
- Planejamento experimental
- Tecnologia de biorreatores em miniatura
Contexto
- A otimização do meio de cultivo é crucial para processos microbianos.
- A produção de metabólitos pequenos e a produção de proteínas heterólogas requerem meios personalizados.
- A combinação de experimentos com modelagem pode acelerar os tempos de desenvolvimento.
- Sistemas robóticos aumentam a eficiência do manuseio de líquidos na preparação de meios.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para otimizar meios de cultivo microbianos.
- Explorar a relação entre a composição do meio e a produção de proteínas.
- Demonstrar o fluxo de trabalho iterativo para o design de meios.
Métodos Utilizados
- Utilização do delineamento experimental baseado em krigagem.
- Implementação da tecnologia de microbiorreator para o cultivo.
- Manuseio robótico de líquidos para o preparo do meio.
- Análise estatística para identificar as concentrações ótimas dos componentes do meio.
Resultados Principais
- Identificação de faixas de concentração ideais para componentes do meio.
- Demonstração do processo iterativo que leva à melhoria do sinal de P-F-G.
- Validação dos resultados por meio de testes estatísticos Z.
- Adaptabilidade do protocolo para diversos hospedeiros microbianos de expressão.
Conclusões
- O método apresentado aprimora significativamente o design de meios de cultivo microbiano.
- A integração de robótica aumenta a produtividade e a eficiência.
- Os resultados podem ser ampliados e adaptados para diferentes aplicações na pesquisa microbiana.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda o desafio da biofármaca de otimizar meios de cultivo microbianos para a produção de proteínas heterólogas, uma etapa crítica no desenvolvimento de cepas e na eficiência de bioprocessos. Ao integrar o planejamento experimental baseado em Kriging com tecnologia de microbioreatores e manipulação robótica de líquidos, o método acelera os ciclos de otimização de meios e melhora a confiança preditiva na formulação dos meios. O fluxo de trabalho genérico e adaptável apoia decisões iniciais de descoberta ao permitir a identificação rápida e baseada em dados das condições nutricionais ideais que aumentam o rendimento de proteínas recombinantes e a robustez do processo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os efeitos dos componentes do meio sobre a produção de proteínas, esclarecendo os requisitos biológicos para expressão heteróloga.
- Valor Operacional: Permite a triagem rápida de formulações de meio para reduzir os riscos à viabilidade do alvo antes da ampliação de escala.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de título de GFP como leitura reprodutível da eficiência de produção proteica em diferentes condições de meio.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de cultivo e detecção por meio da automação, melhorando a reprodutibilidade e a produtividade do ensaio.
- Valor Estratégico: Prepara condições de meio validadas para campanhas de triagem posteriores, reduzindo a variabilidade na avaliação de compostos ou cepas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Estabelece uma estrutura transponível para a otimização de hospedeiros microbianos utilizados na produção pré-clínica de proteínas, apoiando a consistência entre as fases de desenvolvimento.
- Valor Operacional: Facilita a transferência contínua de meios otimizados dos estudos de descoberta para fluxos de trabalho pré-clínicos por meio de protocolos padronizados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai da engenharia de cepas à identificação de compostos líderes, onde a otimização do meio influencia diretamente os níveis de expressão proteica e a viabilidade dos processos subsequentes.
- Biologia de Descoberta: Testa hipóteses sobre os impactos de nutrientes na produção de proteínas, permitindo a eliminação de riscos mecanicistas em sistemas de expressão.
- Triagem: Fornece resultados padronizados e reprodutíveis de cultivo adequados para plataformas de triagem de alto rendimento.
- Análises: Fornece medições de fluorescência da GFP e de concentração proteica que permitem comparação quantitativa de formulações de meio.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade ao definir condições de meio que podem ser reproduzidas em modelos pré-clínicos de maior escala.
- Reutilização Corporativa: Oferece um protocolo modular e adaptável aplicável em múltiplos projetos, hospedeiros e alvos proteicos, reduzindo esforços redundantes de desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no design de meios por meio de experimentação iterativa orientada por modelagem.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio da integração de manipulação robótica de líquidos e microbioreatores.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao vincular a composição do meio à produção proteica, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de cepas e condições de meio com base em resultados de otimização orientados por dados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em design experimental, operação de microbioreatores e sistemas robóticos de manipulação líquida.
- Depende do acesso a plataformas de microbioreatores (por exemplo, Biolector), leitores de placas e equipamentos de centrifugação para o processamento de sobrenadantes.
- Necessita alinhamento entre equipes quanto à coleta de dados, padrões de medição de GFP e protocolos de análise estatística (por exemplo, teste Z).
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o protocolo para diferentes hospedeiros microbianos ou alvos proteicos (por exemplo, proteínas dependentes de glicosilação ou de ligações dissulfeto).
- As limitações práticas incluem a necessidade de experimentos de referência em cada iteração para detectar valores aberrantes e garantir a confiabilidade dos dados, conforme observado no fluxo de trabalho iterativo.
