Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é regenerar placas eletrônicas comerciais equipadas para um Analisador de Células em Tempo Real, ou RTCA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regeneração do campo de chips descartáveis à base de ouro, incluindo a regeneração de planos eletrônicos usados no RTCA. A principal vantagem dessa técnica é que o procedimento de regeneração pode ser realizado usando reagentes de laboratório leves e prontamente disponíveis com baixa toxicidade.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a usar o Real-Time Cell Analyzer, que custava chips à base de ouro. Comece este procedimento com incubação e proliferação de células A549 em placa de cultura de células, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 150 microlitros de meio celular a cada poço de incubação da placa eletrônica L8. Deixe a placa por 30 minutos na capa de biossegurança para equilibrar.

Após 30 minutos, insira manualmente a placa eletrônica L8 no Analisador de Células em Tempo Real na incubadora de CO2 a 37 graus Celsius. Em seguida, inicie o programa de operação do Real-Time Cell Analyzer no computador. Na página de configuração do padrão de experimento, selecione Modelo de experimento e nomeie o ensaio em execução.

Em sua página de layout, selecione os poços correspondentes incluídos no experimento e insira as informações como tipo de célula, número e nomes de medicamentos nas caixas de edição. Em sua página de agendamento, adicione as etapas experimentais e selecione o tempo de execução de cada etapa e o intervalo de aquisição de dados em tempo real. Clique em iniciar para medir a impedância de fundo da mídia.

O arquivo do experimento será salvo. Os dados resultantes serão subtraídos automaticamente. Na página de plotagem, adicione poços e o gráfico do índice da célula de tempo será mostrado.

Para o experimento de proliferação celular, primeiro clique no botão de pausa para pausar o programa. Em seguida, retire a placa eletrônica e adicione 100 microlitros de tampão de suspensão de célula A549 por poço à temperatura ambiente. Deixe a placa por 30 minutos na capa de biossegurança para permitir que as células se depositem no fundo dos poços de incubação.

Insira manualmente a placa eletrônica na estação do analisador de células em tempo real. Em seguida, clique no botão Iniciar para continuar o experimento. Na página de plotagem, o analisador registra continuamente os valores do índice da célula, ou curvas, ao longo do experimento.

Quando o experimento for concluído, entre na página de plotagem e abra o arquivo de experimento. Em seguida, selecione todos os poços de incubação testados e as curvas de índice celular resultantes que podem ser calculadas ou normalizadas pela última vez antes de adicionar medicamentos farmacêuticos ou mudar de meio para reduzir as variações entre os ensaios. Na página de análise de dados, EC50 ou IC50 podem ser calculados.

Depois de realizar a avaliação da citotoxicidade do medicamento anticancerígeno conforme descrito no protocolo de texto, retire a placa eletrônica contendo as células da estação Real-Time Cell Analyzer. Coloque a placa eletrônica usada em uma capa de biossegurança estéril em temperatura ambiente e misture bem o meio de cultura usando uma pipeta. Em seguida, use uma pipeta para aspirar todo o meio.

Enxágue as placas eletrônicas com 200 microlitros de água deionizada por três vezes em temperatura ambiente. Digerir as células restantes nas placas eletrônicas com 0,25% de tripsina recém-preparada por uma a duas horas em uma incubadora a 37 graus Celsius. Quando a digestão estiver concluída, trabalhe na coifa de biossegurança à temperatura ambiente para misturar a solução de incubação cinco a 10 vezes usando uma pipeta e, em seguida, remova a solução.

Enxágue as placas eletrônicas com 200 microlitros de água deionizada duas vezes. Em seguida, lave com 200 microlitros de etanol 100% duas vezes, seguido pelo mesmo volume de etanol 75% duas vezes. Por fim, enxágue com mais 200 microlitros de água deionizada duas vezes.

Inverta a placa eletrônica em uma gaze estéril ou lenço de papel para decantar a água restante em temperatura ambiente. Em seguida, realize a esterilização ultravioleta na placa eletrônica regenerada por uma a duas horas na coifa de biossegurança à temperatura ambiente. Depois de usar as placas para administração de medicamentos usando material mesoporoso, conforme descrito no protocolo de texto, digerir as células restantes com tripsina como antes.

Como a pipeta é frequentemente usada nos experimentos, deve-se ter atenção da pessoa para evitar arranhões na ponta e na superfície dos microchips. Enxágue os microchips com 200 microlitros de água deionizada uma vez na coifa de biossegurança em temperatura ambiente. Em seguida, aumente os microchips com 200 microlitros de etanol absoluto duas vezes à temperatura ambiente.

Em seguida, enxágue os microchips com 200 microlitros de etanol a 75% uma vez em temperatura ambiente. Adicione 250 microlitros de etanol 75% em cada poço e sele a placa eletrônica com o filme de vedação à temperatura ambiente. Depois de girar a placa eletrônica a 114 vezes G por dois minutos, esvazie a placa.

Inverta a placa eletrônica em uma gaze estéril ou lenço de papel para decantar o líquido restante em temperatura ambiente. Repita os enxágues com etanol a 75% seguidos da centrifugação. Em seguida, realize a esterilização ultravioleta na placa eletrônica regenerada por uma a duas horas na coifa de biossegurança à temperatura ambiente.

Avalie as características ópticas da superfície da placa eletrônica regenerada desmontando primeiro a parte inferior da incubação, conforme descrito no protocolo de texto. Para avaliar a viabilidade das células anexadas após a absorção de drogas anticancerígenas nas placas eletrônicas frescas e regeneradas, use um microscópio confocal de varredura a laser para monitorar a fluorescência espontânea das moléculas DOX absorvidas pelas células A549. Para registrar a fluorescência espontânea do DOX absorvido pelas células, use uma objetiva de óleo de 63 vezes e 485 nanômetros como comprimento de onda de excitação.

Em seguida, avalie os comportamentos eletroquímicos dos eletrodos regenerados polindo primeiro o eletrodo de ouro e o eletrodo de carbono vítreo em uma superfície espelhada com uma pasta de iluminação em um pano de polimento. Em seguida, sonice os eletrodos em água para remover quaisquer partículas. Em seguida, ative o eletrodo de ouro em ácido sulfúrico 0,5 molar.

Obtenha dados de espectroscopia de impedância eletroquímica, ou EIS, do eletrodo de ouro nu e do eletrodo de carbono vítreo em solução eletrolítica de cloreto de potássio de 10 milimolares, contendo um feracianeto de potássio milimolar. Agora, coloque 10 microlitros de uma suspensão celular na superfície do eletrodo de ouro no GCE. Após a adição das células, incubar o eletrodo de ouro no GCE em uma incubadora de 37 graus Celsius por três horas antes de obter os dados EIS dos eletrodos modificados com as células, conforme descrito no protocolo de texto.

Para regenerar os eletrodos, mergulhe o eletrodo de ouro no GCE modificado com células em 0,25% de tripsina por 0,5 a duas horas. Enxágue os dois eletrodos suavemente com água quatro vezes. Em seguida, enxágue os eletrodos suavemente com etanol absoluto quatro vezes.

Em seguida, mergulhe o eletrodo de ouro no GCE em etanol a 75% por aproximadamente cinco minutos. Após cinco minutos, enxágue o chip suavemente com etanol 75% quatro vezes antes de obter os dados EIS dos eletrodos regenerados, conforme descrito no protocolo de texto. Para avaliar a eficiência de regeneração da placa eletrônica de ouro disposta, foram feitas observações microscópicas para placas eletrônicas frescas e tratadas.

Nenhuma diferença virtual nas propriedades ópticas da superfície do microchip foi encontrada. A troescência de moléculas de doxorrubicina é usada para avaliar o estado celular nos microchips de ouro antes e depois da regeneração. A homogeneidade semelhante e a morfologia celular bem definida demonstraram a reutilização dos chips.

O protocolo de regeneração é aplicado para o teste real de proliferação celular. As curvas de crescimento obtidas de múltiplos poços de incubação de uma placa eletrônica testada apresentam boa consistência, indicando a regeneração bem-sucedida do chip comercial. Mostrado aqui, a placa eletrônica regenerada L8 foi testada para avaliação de citotoxicidade usando materiais de sílica mesoporosa.

O índice celular da amostra tratada com materiais mesoporosos diminuiu em comparação com o controle, indicando uma leve citotoxicidade dos materiais. O encapsulamento e a liberação adicionais da droga anticancerígena doxorrubicina por materiais mesoporosos causaram uma diminuição dramática na curva de crescimento das células A549. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tempo de digestão do tipo de dissipador pode diferir de chip para chip. Após este procedimento, outros métodos como microscopia confocal de varredura a laser, ou mesmo espectroscopia, espectroscopia de impedância eletroquímica podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como avaliação do efeito de regeneração.