Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

O objetivo geral deste procedimento é regenerar placas eletrônicas comerciais equipadas para um Analisador de Células em Tempo Real, ou RTCA. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da regeneração de chips descartáveis à base de ouro, incluindo a regeneração de placas eletrônicas utilizadas no RTCA. A principal vantagem desta técnica é que o procedimento de regeneração pode ser realizado utilizando reagentes laboratoriais brandos, facilmente disponíveis e de baixa toxicidade.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando começamos a usar o Analisador de Células em Tempo Real, que possui chips baseados em ouro, cujo custo é elevado. Inicie este procedimento com a incubação e proliferação de células A549 em uma placa de cultivo celular, conforme descrito no protocolo textual. Adicione 150 microlitros de meio celular a cada poço de incubação da placa eletrônica L8. Deixe a placa por 30 minutos na cabine de segurança biológica para equilibrar.

Após 30 minutos, insira manualmente a placa eletrônica L8 no Analisador de Células em Tempo Real dentro da incubadora de CO₂ a 37 graus Celsius. Em seguida, inicie o programa de operação do Analisador de Células em Tempo Real no computador. Na página padrão de configuração do experimento, selecione Modelo do Experimento e nomeie o ensaio em andamento.

Na sua página de layout, selecione as placas correspondentes incluídas no experimento e insira as informações, como tipo e número de células e nomes dos fármacos, nos campos de edição. Na sua página de agendamento, adicione as etapas experimentais e selecione o tempo de duração de cada etapa e o intervalo de aquisição de dados em tempo real. Clique em iniciar para medir a impedância de fundo do meio.

O arquivo do experimento será salvo. Os dados resultantes serão subtraídos automaticamente. Na página do gráfico, adicione poços e o gráfico de tempo-índice celular será exibido.

Para o experimento de proliferação celular, primeiro clique no botão de pausa para interromper o programa. Em seguida, retire a placa eletrônica e adicione 100 microlitros de tampão de suspensão de células A549 por poço à temperatura ambiente. Deixe a placa por 30 minutos na câmara de segurança biológica para permitir que as células sedimentem no fundo dos poços de incubação.

Insira manualmente a placa eletrônica na estação do analisador celular em tempo real. Em seguida, clique no botão iniciar para continuar o experimento. Na página do gráfico, o analisador registra continuamente os valores do índice celular, ou curvas, durante todo o experimento.

Quando o experimento estiver concluído, acesse a página do gráfico e abra o arquivo do experimento. Em seguida, selecione todas as poças de incubação testadas e as curvas resultantes de índice celular que podem ser médias ou normalizadas pela última vez antes da adição de fármacos ou da troca do meio, para reduzir as variações entre os ensaios. Na página de análise de dados, pode-se calcular a CE50 ou a CI50.

Após realizar a avaliação de citotoxicidade do fármaco anticâncer conforme descrito no protocolo do texto, retire a placa eletrônica contendo as células da estação de Analisador de Células em Tempo Real. Coloque a placa eletrônica usada em uma capela de biossegurança estéril à temperatura ambiente e misture bem o meio de cultura utilizando uma pipeta. Em seguida, utilize uma pipeta para aspirar todo o meio.

Lave as placas eletrônicas com 200 microlitros de água deionizada por três vezes à temperatura ambiente. Degrade as células remanescentes nas placas eletrônicas com tripsina recém-preparada a 0,25% por uma a duas horas em uma incubadora a 37 graus Celsius. Quando a digestão for concluída, trabalhe na câmara de segurança biológica à temperatura ambiente para misturar a solução de incubação de cinco a dez vezes usando uma pipeta e, em seguida, remova a solução.

Lave as placas eletrônicas com 200 microlitros de água desionizada duas vezes. Em seguida, lave com 200 microlitros de etanol a 100% duas vezes, seguido do mesmo volume de etanol a 75% duas vezes. Por fim, enxágue com mais 200 microlitros de água desionizada duas vezes.

Inverta a placa eletrônica sobre uma gaze estéril ou papel de tecido para decantar a água remanescente à temperatura ambiente. Em seguida, realize a esterilização por ultravioleta na placa eletrônica regenerada por uma a duas horas na cabine de segurança biológica à temperatura ambiente. Após utilizar as placas para a entrega de fármacos usando material mesoporoso conforme descrito no protocolo do texto, digira as células remanescentes com tripsina como anteriormente.

Como a pipeta é frequentemente usada nos experimentos, a pessoa deve prestar atenção para evitar riscar a ponta e a superfície dos microchips. Enxágue os microchips com 200 microlitros de água desionizada uma vez na cabine de segurança biológica à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue os microchips com 200 microlitros de etanol absoluto duas vezes à temperatura ambiente.

Em seguida, lave os microchips com 200 microlitros de etanol 75% uma vez à temperatura ambiente. Adicione 250 microlitros de etanol 75% em cada poço e feche a placa eletrônica com filme selante à temperatura ambiente. Após centrifugar a placa eletrônica a 114 ×g por dois minutos, esvazie a placa.

Inverta a placa eletrônica sobre uma gaze estéril ou papel toalha para decantar o líquido remanescente à temperatura ambiente. Repita as lavagens com etanol 75%, seguidas pela centrifugação. Em seguida, realize a esterilização por ultravioleta na placa eletrônica regenerada por uma a duas horas na câmara de segurança biológica à temperatura ambiente.

Avalie as características ópticas da superfície do placa eletrônica regenerada desmontando primeiro a parte inferior do poço de incubação conforme descrito no protocolo textual. Para avaliar a viabilidade de células aderidas após a captação de fármacos anticancerígenos em placas eletrônicas novas e regeneradas, utilize um microscópio confocal de varredura a laser para monitorar a fluorescência espontânea das moléculas de DOX absorvidas por células A549. Para registrar a fluorescência espontânea do DOX absorvido pelas células, utilize um objetivo de imersão em óleo de 63 vezes e 485 nanômetros como comprimento de onda de excitação.

Em seguida, avalie os comportamentos eletroquímicos dos eletrodos regenerados, primeiro polindo o eletrodo de ouro e o eletrodo de carbono vítreo até uma superfície espelhada com uma pasta de alumina em um pano de polimento. Em seguida, sonique os eletrodos em água para remover quaisquer partículas. Ative então o eletrodo de ouro em ácido sulfúrico 0,5-molar.

Obtenha dados de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica, ou EIS, do eletrodo de ouro exposto e do eletrodo de carbono vítreo em uma solução eletrolítica de cloreto de potássio 10 milimolar, contendo ferrocianeto de potássio 1 milimolar. Em seguida, adicione 10 microlitros de uma suspensão celular sobre a superfície do eletrodo de ouro no GCE. Após a adição das células, incube o eletrodo de ouro no GCE em uma estufa a 37 graus Celsius por três horas antes de obter os dados de EIS dos eletrodos modificados com células, conforme descrito no protocolo textual.

Para regenerar os eletrodos, imergir o eletrodo de ouro no GCE modificado com células em tripsina 0,25% por 0,5 a duas horas. Enxaguar ambos os eletrodos suavemente com água quatro vezes. Em seguida, enxaguar os eletrodos suavemente com etanol absoluto quatro vezes.

Em seguida, imergir o eletrodo de ouro no GCE em etanol 75% por aproximadamente cinco minutos. Após cinco minutos, lavar suavemente o chip com etanol 75% quatro vezes antes de obter os dados de EIS dos eletrodos regenerados, conforme descrito no protocolo textual. Para avaliar a eficiência de regeneração da placa eletrônica de ouro em matriz, foram realizadas observações microscópicas em placas eletrônicas novas e tratadas.

Nenhuma diferença significativa nas propriedades ópticas da superfície do microchip foi encontrada. A fluorescência das moléculas de doxorrubicina é utilizada para avaliar o estado celular nos microchips de ouro antes e após a regeneração. A homogeneidade semelhante e a morfologia celular bem definida demonstraram a reutilização dos chips.

O protocolo de regeneração é aplicado para o teste real de proliferação celular. As curvas de crescimento obtidas a partir de múltiplas poças de incubação de uma placa eletrônica testada mostram boa consistência, indicando a regeneração bem-sucedida do chip comercial. Aqui, a placa eletrônica regenerada L8 foi testada para avaliação de citotoxicidade utilizando materiais de sílica mesoporosa.

O índice celular da amostra tratada com materiais mesoporosos diminuiu em comparação com o controle, indicando uma leve citotoxicidade dos materiais. A encapsulação e liberação adicionais do fármaco anticâncer doxorrubicina por materiais mesoporosos provocaram uma diminuição acentuada na curva de crescimento de células A549. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o tempo de digestão do tipo de afundamento pode variar de chip para chip. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal de varredura a laser ou mesmo espectroscopia, espectroscopia de impedância eletroquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a avaliação do efeito de regeneração.