RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

O objetivo geral deste procedimento é obter informações abrangentes sobre raízes de plantas crescendo em rizocaixas preenchidas com solo, combinando diferentes métodos de imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de fenotipagem e melhoramento de plantas, como a contribuição de diferentes arquiteturas radiculares para uma melhor resistência ao estresse abiótico. A principal vantagem desta abordagem é que ela combina imagem RGB para arquitetura radicular e imagem hiperspectral para funcionalidade radicular.

O potencial do uso da imagem hiperspectral para raízes se estende a uma ampla gama de parâmetros do rizosfera, pois as informações espectrais podem revelar alterações físico-químicas em pequena escala introduzidas pelas raízes das plantas. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de preenchimento da caixa-radicular precisam ser realizados com cuidado. Caso contrário, o crescimento das raízes e a sua visibilidade serão negativamente afetados.

Inicie este procedimento com o preparo das caixas radiculares para preenchimento do substrato conforme detalhado no protocolo textual. Umidifique o solo seco até uma umidade gravimétrica de 0,108 grama por grama, adicionando 400 gramas de água a 3.705 gramas de solo seco. Misture suavemente o solo e a água para obter uma distribuição homogênea da umidade.

Desagregue manualmente os agregados maiores para manter o tamanho das partículas menor ou igual a dois milímetros. É fundamental obter uma camada homogênea de solo junto à janela de observação de gás, evitando bolsas de ar. As pontas das raízes das plantas desidratam rapidamente ao crescerem em bolsas de ar.

A qualidade da imagem espectral para mapeamento de água também é negativamente afetada. Preencha as caixas de rizosfera com o solo pré-umedecido e compacte-o suavemente usando uma folha de poliestireno para cobrir o volume interno da caixa, obtendo assim uma densidade aparente homogênea de 1,3 gramas por centímetro cúbico. Adicione a quantidade restante de água para atingir o teor de água alvo de 0,31 centímetro cúbico por centímetro cúbico, pulverizando-a sobre a superfície com um borrifador.

Garanta um tamanho pequeno das gotas para evitar a degradação da estrutura da superfície, bem como um molhamento homogêneo. Mantenha a caixa sobre uma balança durante a pulverização para monitorar a quantidade de água realmente adicionada ao substrato. Deixe a água se redistribuir por 10 minutos e, em seguida, pressione o vidro contra a superfície e fixe-o com os trilhos metálicos laterais.

O peso final médio dos caixotes radiculares com substrato umedecido foi de 17.818 ± 68 gramas. Equipe o cômodo climatizado com oito lâmpadas de LED que forneçam iluminação homogênea de 450 micromoles por metro quadrado por segundo, com picos espectrais em 440 e 660 nanômetros, para crescimento vegetal ótimo. Após ajustar os parâmetros ambientais de acordo com as necessidades da planta e do experimento, cubra a janela de vidro com uma placa de madeira para manter a zona radicular no escuro e evitar o crescimento de algas devido à penetração de luz através da superfície de vidro.

Em seguida, posicione as caixas de raiz em uma inclinação de 45 graus utilizando uma estrutura metálica adequada. Isso maximiza o crescimento radicular em direção à superfície de vidro devido à gravitropismo. Para a imagem radicular RGB, ilumine a caixa de raiz utilizando quatro lâmpadas fluorescentes de 24 watts fixadas a uma distância de 80 centímetros da caixa de raiz.

Além disso, instale quatro tubos UV de 15 watts a 20 centímetros do sistema de iluminação alternativa da caixa de raiz, utilizando a autofluorescência da raiz em caso de baixo contraste entre a raiz e o fundo do substrato de cor clara. Ligue as lâmpadas UV e, em seguida, posicione a caixa de raiz a ser imageada no suporte da câmara de imagem. Em seguida, capture duas imagens para cobrir a metade superior e inferior de uma caixa de raiz, com uma sobreposição de cerca de três centímetros.

Adquira e processe as imagens RGB conforme detalhado no protocolo textual. Por fim, execute a análise das imagens de raiz RGB adquiridas e posteriormente verifique se existem regiões que não correspondem. Nesse caso, defina uma região de exclusão e reinicie a análise.

Para raízes não classificadas, adicione classes de cores adicionais e reinicie a análise. Para elementos classificados incorretamente como raízes, ative ou aumente as opções de filtragem de detritos e bordas irregulares. Realize a aquisição de imagens determinando primeiro os tempos de integração da câmera para a varredura do rizocaixa e do padrão branco no software da câmera.

Para tanto, abra a interface gráfica de imagem e mova a câmera para uma posição da caixa radicular onde haja raízes presentes. Ajuste o tempo de integração da câmera, direcionando-a a um objeto iluminado, de modo que aproximadamente 85% da faixa dinâmica total da câmera seja utilizada no histograma exibido pelo software. O ajuste correto do tempo de integração para diferentes substratos e tecidos radiculares é essencial para aproveitar plenamente a faixa dinâmica da câmera de infravermelho, evitando perda de informação por exceder seu limite.

Repita o processo para o padrão branco movendo o sistema de posicionamento da câmera para mirar no padrão branco antes de fechar o software da câmera. Em seguida, abra a interface gráfica de imagens do Matlab e insira todas as configurações da digitalização atual da caixa radicular. Adquira os padrões escuro e branco antes de cada série de imagens, uma vez ao dia.

O padrão escuro representa o ruído da câmera, enquanto o padrão branco fornece a refletividade máxima. Esses dados são necessários para a normalização da imagem durante o pré-processamento. Defina se toda a caixa radicular ou apenas parte dela será escaneada.

No caso atual, são obtidas imagens de rizocaixas inteiras. Em seguida, inicie a varredura. Para a medição baseada em espectro do teor de água, é necessária uma rizocaixa de calibração.

Subdivida uma caixa de rizosfera em compartimentos de cinco centímetros usando folhas de poliestireno para preenchê-los com solo em diferentes teores de água. Escaneie a caixa de rizosfera de calibração com as mesmas configurações utilizadas para as caixas de rizosfera plantadas. Como exemplo, para combinar características de raiz e partes aéreas, obtenha o porômetro de folha para a medição da condutância estomática.

Equilibre o dispositivo em condições ambientes por pelo menos uma hora na câmara climática. Realize medições em pelo menos três folhas por planta. Uma imagem representativa do crescimento radicular da cultivar de beterraba Ferrara, com base em imagem RGB, é mostrada aqui.

35 dias após a semeadura, as raízes das plantas alongaram-se até atingir a base da caixa de rizosfera. Alguns eixos radiculares na parte superior da caixa de rizosfera não puderam ser segmentados a partir das imagens RGB. A senescência das raízes basais mais velhas altera sua coloração para marrom.

Portanto, a separação entre essas raízes e o fundo do solo com base em um limiar de cor falha. Utilizando imagens hiperspectrais, a segmentação é baseada em diferentes características espectrais entre o primeiro plano das raízes e o fundo do solo. Isso melhora o resultado da segmentação.

As diferenças no comprimento da raiz medido em relação a uma imagem de referência rastreada manualmente são de apenas 1,5%. Além disso, a imagem espectral permite o mapeamento detalhado do teor de água ao redor da raiz para inferir a absorção de água. Aqui, o esqueleto da raiz é mostrado em preto. As áreas mais claras indicam regiões de maior esgotamento de água próximas aos eixos da raiz.

Embora áreas mais escuras em azul representem regiões com maior teor de água no solo fora do alcance das raízes. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como encher corretamente os caixotes radiculares para garantir um crescimento e uma visualização adequados das raízes. Esta é a base para a obtenção posterior de imagens e resultados representativos de fenotipagem radicular.

Após este procedimento, outros métodos de classificação espectral, como agrupamento K-médias ou máquinas de vetores de suporte, podem ser realizados para obter informações detalhadas sobre propriedades da raiz e da rizosfera, como senescência e decomposição radicular. Uma vez estabelecida, esta técnica permite fenotipar de forma abrangente sistemas radiculares e a resposta ao estresse abiótico. Um conjunto de 10 cultivares pode ser caracterizado com uma duração experimental total inferior a três meses.