Name: RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a combinar imagens RGB e hiperespectrais para fenotipagem de raízes em rizoboxes de solo. Este método integrado permite analisar arquitetura radicular e funcionalidade fisiológica em plantas.

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Os autores reconhecem financiamento do austríaco ciência fundo FWF através do projeto número P 25190-B16 (as raízes da resistência à seca). Estabelecimento da infra-estrutura de imagens hiperespectrais foi apoiado financeiramente pela Federal governo da Baixa Áustria (Niederösterreich terra) através do projeto K3-F-282/001-2012. Financiamento adicional para o experimento de beterraba foi recebido da pesquisa AGRANA &#38; GmbH de centro de inovação (ARIC). Os autores agradecer Craig Jackson para suporte técnico durante o experimento e inglês correção do manuscrito. Também reconhecemos Markus Freudhofmaier que contribuíram para o estabelecimento da configuração de imagem RGB e Josef Schodl para construção de montagem rhizobox.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os protocolos fornecem duas abordagens complementares para o solo cultivado de imagem de sistema radicular. Um passo crítico para resultados experimentais confiáveis está enchendo do rhizoboxes que tem que garantir uma camada homogênea e até mesmo substrato no vidro da frente para proporcionar contato solo-raiz apertado a janela de observação e evitar lacunas de ar. Esta é a principal razão para usar o solo peneirado comparativamente fino de &#60; 2 mm: agregados maiores resultam em morfologia de superfície superior a janela de observação com vazios entre os agregados. Além de um maior risco de desidratação de dica de raiz, isso também requer mais complexas técnicas de processamento de imagem para mapeamento de água31.
Modificações do protocolo, portanto, focar melhor e rápido enchimento de rhizoboxes. Tempo de enchimento atualmente é cerca de 30 minutos pela caixa. Além do uso de rhizoboxes com duas janelas de vidro para a imagem latente de ambos os lados e modificações para otimizar a homogeneidade de iluminação para imagens RGB melhores são testados. Nova prorrogação de hardware também pode considerar a integração de planar optodes32 , bem como da capacidade de imagem33 no sistema rhizobox. No entanto, esta é além de atividades de atualização atuais.
Modificações de software focar o registo automático da imagem para fundir a parte superior e inferior RBG fotos34. Para hiperespectrais extração de recurso sem supervisão avançado de imagem aproxima-se28 , bem como métodos de deteção de destino supervisionados mais sensíveis tais como SVMs35 são testados. Assim, os dados hiperespectrais potencialmente permitem a avaliação de múltiplas Propriedades rizosfera, solo e raiz36. Além disso pretende-se desenvolver um (semi) automatizados software para rhizobox raiz imagens com base em uma versão modificada do sistema radicular Analyzer37 quantificar morfológica (comprimento, diâmetro, superfície), bem como traços arquitectónicos (frequência de ramificação, ângulos de ramificação).
A principal limitação do protocolo em comparação com abordagens de imagem 3D é a restrição à superfície visível raiz e propriedades da rizosfera. No entanto foi demonstrado que os traços visíveis de raiz são um proxy confiável para o sistema inteiro da raiz21. A técnica de rhizobox é facilmente combinada com tradicional amostragem destrutiva (lavagem) no final do crescimento dinâmico da imagem latente para validar a relação de visível vs traços do sistema total da raiz. Como esta relação pode variar entre espécies21, amostragem destrutiva é recomendada para assegurar uma conclusão confiável de traços visíveis para qualquer nova série fenotipagem com uma espécie de diferentes culturas.
A principal vantagem do protocolo aqui apresentado é a combinação de condições de crescimento realistas (solo), relativamente alto rendimento potencial para a imagem RGB temporalmente resolvido e inferência na funcionalidade de raiz (por exemplo, absorção de água) via os dados de raiz e rizosfera quimiométricas de imagens hiperespectrais. Desse modo, os métodos supera restrições de inferência em plântulas de alto rendimento e raiz não-solo de imagem métodos14, enquanto parcialmente permite insights profundos fenotipagem em processos de funcionais com complexidade menos experimental e maior rendimento em comparação com métodos avançados de 3D15.
Nas próximas experiências o protocolo será usado para estudar o efeito de micorriza no desenvolvimento do sistema radicular e a funcionalidade de leguminosas, bem como para as características de raiz de fenotipagem de espécie de cultura de cobertura em relação à estrutura do solo, nitrogênio e carbono ciclismo.

Raízes fornecem várias funções essenciais para as plantas tais como armazenamento de assimila, fixação de plantas terrestres no solo e a absorção e o transporte de água e nutrientes1. Do ponto de vista evolutivo, a formação dos eixos de raiz é considerada uma condição fundamental para a origem da terra plantas2. Apesar deste importante papel, historicamente raízes ocuparam apenas uma posição marginal na pesquisa biológica. Em tempos mais recentes, no entanto, existe uma crescente interesse científico em sistemas de raiz de planta como evidenciado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg"> 
Figura 1: Relevância de estudos de raiz em Ciências de planta. Número de raiz relacionados com estudos como uma porcentagem de todos os estudos de planta publicada em revistas do SCI nas últimas décadas. Pesquisar resultado da Scopus usando palavras-chave "planta" e "planta e raiz". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dois principais motivos podem ser a hipótese de fundamentam os recentes avanços na pesquisa de raiz. Vegetação terrestre, primeira é exposta a estresses ambientais mais frequentes, como resultado da mudança global3. No contexto da produção de culturas agrícolas estima-se que globalmente cerca de 30% da área agrícola são limitados por água e fósforo4,5. Redução do estresse de colheitas são uma razão principal para rendimento significativas lacunas que são estimados globalmente em menor 50% da produtividade potencial de sequeiro agro-ecossistemas6. Além de disponibilidade de recursos baixos, isso também está relacionado à eficiência de uso recurso pobre, ou seja, insuficiente capacidade de uma planta para explorar os recursos disponíveis7. Isso resulta em perdas de recursos móveis, tais como o nitrato, que pode afetar negativamente a outros ecossistemas. Por exemplo, a eficiência de uso de nitrogênio global atual é estimada em 47%8. Usar o recurso melhor eficiência através de métodos de melhoria da gestão e cultivares, portanto, de grande importância para ambos sustentado crescimento dos produtos agrícolas, bem como para a sustentabilidade ambiental. Nesta fábrica de contexto raízes são consideradas para ser um alvo chave para melhoria de culturas e cultivo sistemas9,10.
Um segundo fundo importante para o interesse recente em raízes de plantas é o avanço tecnológico nos métodos de medição. Métodos raiz tempo tem sido restrito pelos dois principais desafios: para medição de raízes de plantas que crescem no solo, eles tiveram que ser isolados para quantificação, principalmente lavando11, perturbando o arranjo arquitectónico dos eixos de raiz. Observação de raiz in situ utilizando escavação métodos, conservando assim a localização natural das raízes no solo, têm sido utilizados para descrição botânica12. Ainda são muito demorados e, portanto, não atende aos requisitos de taxa de transferência de análise comparativa estrutural-funcional sistema de raiz. Por outro lado elevado-throughput métodos para medição de arquitectura de raiz foram feitos principalmente em meios artificiais e para mudas de plantas13 onde a extrapolação para o ambiente natural de crescimento das plantas é questionável14.
O crescimento recente da investigação de raiz é fortemente ligado ao avanço em métodos15por imagens. Abordagens em estudos de raiz de imagem aproximadamente pode ser agrupado em três tipos. Primeiro, existem métodos 3D de alta resolução como CT e MRI16. Esses métodos são mais adequados para estudar processos de interação das raízes de plantas com o solo, tais como secas induzidas pelo xilema embolia17. Normalmente são aplicados à comparativamente pequenas amostras onde eles permitem observações detalhadas. Uma comparação de CT e MRI para potes de diferente tamanhos e raiz fina imagem é fornecida em18. Em segundo lugar, há elevado-produção de imagem métodos19,20. Esses métodos são na maior parte com base em comum 2D RGB imagens de raízes crescendo em meios artificiais (gel, papel de germinação) onde o alto contraste permite comparativamente simples dissecação entre raízes e plano de fundo. Eles são adequados para a comparação de alta taxa de transferência entre os traços de raiz de mudas de genótipos diferentes culturas sob padronizada artificial crescente condições13. Entre essas duas abordagens são métodos rhizobox: eles usam imagens 2D de raízes crescendo no solo por longo período de tempo e tem taxa de transferência média21,22. Um desafio recente para imagem (2D) raiz é capturar também indicadores de funcionalidade de raiz, além da descrição da estrutura23.
No presente trabalho, apresentamos os protocolos experimentais para rhizobox crescido sistemas de raiz, usando (i) uma barata e simples feito por RGB de imagem (ii) um mais complexo NIR imagem instalação e imagem. Resultados de exemplo obtidos a partir destas duas configurações são mostrados e discutidos no contexto da planta fenotipagem e Plante a pesquisa fisiológica.

<table><tbody><tr><td>Rhizobox</td><td>Technisches B&uuml; ro f&uuml; r Bodenkultur</td><td>Construtor</td><td></td>experimental</tr><tr><td>Lâmpadas LED ATUM HORTI 600</td><td>Klutronic</td><td>AHI10600F</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de luz fluorescente HiLite T5 Day</td><td>Juwel Aquarium</td><td>86324</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de luz UV Eurolite 45cm slim 15 W</td><td>Conrad</td><td>593384 - 62</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D</td><td>Canon Austria GmbH</td><td>8035B024</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Versão estendida 12.0 x 32</td><td>Adobe Systems Software Irlanda Ltda.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinRhizo Pro v. 2013</td><td>Regent Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera Xeva-1.7-320 SWIR</td><td>Xenics</td><td>XEN-000105</td><td></td></tr><tr><td>Espectrógrafo Imspector N25E</td><td>Espécime Scanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de imagem hiperespectral</td><td>Carinthian Tech Research AG</td><td>Construtor experimental</td><td>Projeto e montagem de scanner de imagem hiperespectral e software</td></tr><tr><td>Matlab R2106a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Incluindo Caixas de Ferramentas para Processamento de Imagens, Processamento de Sinais e Estatística e Aprendizado de Máquina</td></tr><tr><td>AP4 Poromoeter</td><td>Delta-T-Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-3100C Medidor de Área</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BASF Folhas de poliestireno de estireno</td><td>Obi Baumarkt</td><td>9706318</td><td>Diferentes tipos de folhas de poliestireno ou outro material que separa o solo úmido de forma diferente podem ser usados</td></tr></tbody></table>

rgb e raiz spectral imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação experimental imagem e protocolos

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Melhor entendimento da dinâmica de raiz da planta é essencial para melhorar a eficiência de utilização de recursos de sistemas agrícolas e aumentar a resistência das cultivares safra contra estresses ambientais. Um protocolo experimental é apresentado para RGB e imagem hiperespectral de sistemas da raiz. A abordagem utiliza rhizoboxes, onde plantas crescem no solo natural ao longo de um tempo maior para observar sistemas totalmente desenvolvidos de raiz. Configurações experimentais são exemplificadas pela avaliação rhizobox plantas sob estresse hídrico e estudar o papel das raízes. Uma configuração de imagem RGB é descrita para a quantificação de barata e rápida de desenvolvimento radicular ao longo do tempo. Imagens hiperespectrais melhora a segmentação de raiz do fundo solo comparado a limiarização de cor com base em RGB. A força especial de imagens hiperespectrais é a aquisição de quimiométricas informações sobre o sistema de raiz-solo para entendimento funcional. Isso é demonstrado com mapeamento conteúdo de água de alta resolução. Imagem espectral, no entanto, é mais complexa na aquisição de imagens, processamento e análise em comparação com a abordagem RGB. Uma combinação de ambos os métodos pode otimizar uma avaliação abrangente do sistema raiz. Exemplos de aplicações, integração de raiz e características na superfície são dadas para o contexto da pesquisa fisiológica fenotipagem e planta de planta. Reforço da imagem latente de raiz pode ser obtido através da otimização de qualidade de imagem RGB com melhor iluminação usando diferentes fontes de luz e, por extensão, dos métodos de análise de imagem para inferir sobre propriedades de zona raiz de dados espectrais.

Um protocolo experimental é apresentado para avaliação do solo cultivado sistemas de raiz de planta com RGB e geração de imagens hiperespectrais. Combinação de tempo de imagem RGB série com informações quimiométricas de hiperespectrais verifica otimiza insights sobre a dinâmica de raiz da planta.

RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

O objetivo geral deste procedimento é obter informações abrangentes sobre raízes de plantas crescendo em rizocaixas preenchidas com solo, combinando diferentes métodos de imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de fenotipagem e melhoramento de plantas, como a contribuição de diferentes arquiteturas radiculares para uma melhor resistência ao estresse abiótico. A principal vantagem desta abordagem é que ela combina imagem RGB para arquitetura radicular e imagem hiperspectral para funcionalidade radicular.O potencial do uso da imagem hiperspectral para raízes se estende a uma ampla gama de parâmetros do rizosfera, pois as informações espectrais podem revelar alterações físico-químicas em pequena escala introduzidas pelas raízes das plantas. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de preenchimento da caixa-radicular precisam ser realizados com cuidado. Caso contrário, o crescimento das raízes e a sua visibilidade serão negativamente afetados.Inicie este procedimento com o preparo das caixas radiculares para preenchimento do substrato conforme detalhado no protocolo textual. Umidifique o solo seco até uma umidade gravimétrica de 0,108 grama por grama, adicionando 400 gramas de água a 3.705 gramas de solo seco. Misture suavemente o solo e a água para obter uma distribuição homogênea da umidade.Desagregue manualmente os agregados maiores para manter o tamanho das partículas menor ou igual a dois milímetros. É fundamental obter uma camada homogênea de solo junto à janela de observação de gás, evitando bolsas de ar. As pontas das raízes das plantas desidratam rapidamente ao crescerem em bolsas de ar.A qualidade da imagem espectral para mapeamento de água também é negativamente afetada. Preencha as caixas de rizosfera com o solo pré-umedecido e compacte-o suavemente usando uma folha de poliestireno para cobrir o volume interno da caixa, obtendo assim uma densidade aparente homogênea de 1,3 gramas por centímetro cúbico. Adicione a quantidade restante de água para atingir o teor de água alvo de 0,31 centímetro cúbico por centímetro cúbico, pulverizando-a sobre a superfície com um borrifador.Garanta um tamanho pequeno das gotas para evitar a degradação da estrutura da superfície, bem como um molhamento homogêneo. Mantenha a caixa sobre uma balança durante a pulverização para monitorar a quantidade de água realmente adicionada ao substrato. Deixe a água se redistribuir por 10 minutos e, em seguida, pressione o vidro contra a superfície e fixe-o com os trilhos metálicos laterais.O peso final médio dos caixotes radiculares com substrato umedecido foi de 17.818 ± 68 gramas. Equipe o cômodo climatizado com oito lâmpadas de LED que forneçam iluminação homogênea de 450 micromoles por metro quadrado por segundo, com picos espectrais em 440 e 660 nanômetros, para crescimento vegetal ótimo. Após ajustar os parâmetros ambientais de acordo com as necessidades da planta e do experimento, cubra a janela de vidro com uma placa de madeira para manter a zona radicular no escuro e evitar o crescimento de algas devido à penetração de luz através da superfície de vidro.Em seguida, posicione as caixas de raiz em uma inclinação de 45 graus utilizando uma estrutura metálica adequada. Isso maximiza o crescimento radicular em direção à superfície de vidro devido à gravitropismo. Para a imagem radicular RGB, ilumine a caixa de raiz utilizando quatro lâmpadas fluorescentes de 24 watts fixadas a uma distância de 80 centímetros da caixa de raiz.Além disso, instale quatro tubos UV de 15 watts a 20 centímetros do sistema de iluminação alternativa da caixa de raiz, utilizando a autofluorescência da raiz em caso de baixo contraste entre a raiz e o fundo do substrato de cor clara. Ligue as lâmpadas UV e, em seguida, posicione a caixa de raiz a ser imageada no suporte da câmara de imagem. Em seguida, capture duas imagens para cobrir a metade superior e inferior de uma caixa de raiz, com uma sobreposição de cerca de três centímetros.Adquira e processe as imagens RGB conforme detalhado no protocolo textual. Por fim, execute a análise das imagens de raiz RGB adquiridas e posteriormente verifique se existem regiões que não correspondem. Nesse caso, defina uma região de exclusão e reinicie a análise.Para raízes não classificadas, adicione classes de cores adicionais e reinicie a análise. Para elementos classificados incorretamente como raízes, ative ou aumente as opções de filtragem de detritos e bordas irregulares. Realize a aquisição de imagens determinando primeiro os tempos de integração da câmera para a varredura do rizocaixa e do padrão branco no software da câmera.Para tanto, abra a interface gráfica de imagem e mova a câmera para uma posição da caixa radicular onde haja raízes presentes. Ajuste o tempo de integração da câmera, direcionando-a a um objeto iluminado, de modo que aproximadamente 85% da faixa dinâmica total da câmera seja utilizada no histograma exibido pelo software. O ajuste correto do tempo de integração para diferentes substratos e tecidos radiculares é essencial para aproveitar plenamente a faixa dinâmica da câmera de infravermelho, evitando perda de informação por exceder seu limite.Repita o processo para o padrão branco movendo o sistema de posicionamento da câmera para mirar no padrão branco antes de fechar o software da câmera. Em seguida, abra a interface gráfica de imagens do Matlab e insira todas as configurações da digitalização atual da caixa radicular. Adquira os padrões escuro e branco antes de cada série de imagens, uma vez ao dia.O padrão escuro representa o ruído da câmera, enquanto o padrão branco fornece a refletividade máxima. Esses dados são necessários para a normalização da imagem durante o pré-processamento. Defina se toda a caixa radicular ou apenas parte dela será escaneada.No caso atual, são obtidas imagens de rizocaixas inteiras. Em seguida, inicie a varredura. Para a medição baseada em espectro do teor de água, é necessária uma rizocaixa de calibração.Subdivida uma caixa de rizosfera em compartimentos de cinco centímetros usando folhas de poliestireno para preenchê-los com solo em diferentes teores de água. Escaneie a caixa de rizosfera de calibração com as mesmas configurações utilizadas para as caixas de rizosfera plantadas. Como exemplo, para combinar características de raiz e partes aéreas, obtenha o porômetro de folha para a medição da condutância estomática.Equilibre o dispositivo em condições ambientes por pelo menos uma hora na câmara climática. Realize medições em pelo menos três folhas por planta. Uma imagem representativa do crescimento radicular da cultivar de beterraba Ferrara, com base em imagem RGB, é mostrada aqui.35 dias após a semeadura, as raízes das plantas alongaram-se até atingir a base da caixa de rizosfera. Alguns eixos radiculares na parte superior da caixa de rizosfera não puderam ser segmentados a partir das imagens RGB. A senescência das raízes basais mais velhas altera sua coloração para marrom.Portanto, a separação entre essas raízes e o fundo do solo com base em um limiar de cor falha. Utilizando imagens hiperspectrais, a segmentação é baseada em diferentes características espectrais entre o primeiro plano das raízes e o fundo do solo. Isso melhora o resultado da segmentação.As diferenças no comprimento da raiz medido em relação a uma imagem de referência rastreada manualmente são de apenas 1,5%. Além disso, a imagem espectral permite o mapeamento detalhado do teor de água ao redor da raiz para inferir a absorção de água. Aqui, o esqueleto da raiz é mostrado em preto. As áreas mais claras indicam regiões de maior esgotamento de água próximas aos eixos da raiz.Embora áreas mais escuras em azul representem regiões com maior teor de água no solo fora do alcance das raízes. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como encher corretamente os caixotes radiculares para garantir um crescimento e uma visualização adequados das raízes. Esta é a base para a obtenção posterior de imagens e resultados representativos de fenotipagem radicular.Após este procedimento, outros métodos de classificação espectral, como agrupamento K-médias ou máquinas de vetores de suporte, podem ser realizados para obter informações detalhadas sobre propriedades da raiz e da rizosfera, como senescência e decomposição radicular. Uma vez estabelecida, esta técnica permite fenotipar de forma abrangente sistemas radiculares e a resposta ao estresse abiótico. Um conjunto de 10 cultivares pode ser caracterizado com uma duração experimental total inferior a três meses.

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Environment

Ambiente

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