Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas sem pegadas ou IPSCs a partir de células pancreáticas humanas em condições livres de alimentador, editar as células usando ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 e, finalmente, caracterizar os clones de células únicas modificados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de edição do genoma de células-tronco humanas, como geração de IPSCs sem pegadas e edição com ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9. A principal vantagem dessa técnica é que linhas clonais de IPSCs editadas podem ser geradas com alta confiabilidade e não há evidências de mosaicismo.

Depois de revestir uma placa de seis poços com colágeno frio, coloque células pancreáticas primárias humanas de passagem precoce em meio Prigrow III no dia 2 para atingir aproximadamente 2,5 x 10 para as 5 células ou pelo menos 60% de confluência por poço no dia da transdução ou dia zero. No dia da transdução, após a colheita e contagem das células de acordo com o protocolo de texto, descongele no gelo um conjunto de tubos vetoriais Sendai e adicione cuidadosamente os volumes calculados de cada tubo a 1 mL de meio Prigrow III pré-aquecido. Pipete suavemente para misturar a solução.

Aspire o Prigrow III das células e adicione lentamente a mistura de vírus de reprogramação aos poços. Em seguida, incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. Vinte e quatro horas após a transdução, descartar cuidadosamente a mistura de vírus nas células e substituí-la por meio Prigrow III fresco.

No sexto dia, adicione 1 mL de solução de descolamento celular às células e incube-as por 10 minutos. Em seguida, usando Prigrow III com inibidor de rocha, coloque todas as células em placas de MEFs preparadas no dia anterior. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite.

Observe as placas regularmente quanto ao surgimento de aglomerados ou colônias celulares indicativos de células reprogramadas que formarão agregados clonais com morfologia de paralelepípedos e um grande núcleo e nucléolos. Marque as prováveis colônias IPSC e verifique-as regularmente quanto ao crescimento. Quase quatro semanas após a transdução, após a preparação de placas MEF de 24 poços, prepare a membrana da matriz aliquotando-a com base no fator de diluição no certificado de análise.

Escolha 24-48 colônias e transfira-as para placas de 24 poços revestidas com membrana de matriz com mTeSR1. Incube as placas por 24 horas e troque o meio todos os dias. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais.

Adicione 500 mcL de dispersão para separar as colônias robustas revestidas na membrana da matriz. Depois de incubar as células por 20 minutos, coloque-as novamente em placas de 12 poços revestidas com membrana de matriz. Expandir e caracterizar os clones usando coloração de fosfatase alcalina, imunocoloração e análise FACS de acordo com o protocolo de texto.

Para transfectar HIPSCs após sintetizar SGRNAs de acordo com o protocolo de texto, prepare o master mix de nucleofação para cada amostra combinando 0,5 mcg de proteína Cas9 e 0,5 mcg de cada SGRNA em um volume de reação de 22 mcL. Depois de aspirar o meio contendo inibidor de rocha, use 2 mL de RTPBS para lavar cada poço de ISPCs. Em seguida, aspire o PBS e adicione 1 mL de solução de descolamento de células.

Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. Ressuspenda as células em 3 mL de meio mTeSR1 e pipete suavemente para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular. Transfira as células dissociadas para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de meio mTeSR1.

Para a mistura mestre de nucleofecção, adicione 16,4 mcL de suplemento de células primárias P3 e 3,6 mcL de suplemento um do kit Nucleofector. Depois de contar e girar as células, ressuspenda cada unidade de 0,5 x 10 para as 6ª células em 22 mcL da mistura mestre de transfecção previamente preparada. Transfira rapidamente as células para a câmara central de um poço de uma tira de nucleocubeta.

Em seguida, coloque a tira em um dispositivo Nucleofector e nucleofecte as células usando o programa CB150. Após a nucleofecção, adicione rapidamente 80 mcL de meio mTeSR1 pré-aquecido contendo 10 inibidores de rocha micromolar a cada poço das células nucleofecadas. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.

Transfira suavemente as células da tira para os poços da placa de 12 poços pré-revestida com membrana da matriz contendo meio mTeSR1 com inibidor de rocha. No segundo dia de incubação após a preparação das placas MEF, substitua o meio nas HIPSCs de mTeSR1 para mTeSR1 suplementado com 1XSMC4 por pelo menos duas horas antes da classificação de célula única. Aspire o meio de HIPSCs e use PBS para lavar suavemente as células.

Em seguida, adicione 500 mcL de solução de descolamento de células em cada poço e incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Gere uma suspensão de célula única adicionando 1 mL de mTeSR1 a cada poço e pipete suavemente para cima e para baixo várias vezes. Classifique as células individuais em poços individuais de uma placa de 96 poços previamente preparada.

Quatro dias após a classificação, a formação de colônias deve ser aparente. Neste ponto, substitua o meio de cultura por meio HESC suplementado com 1X SMC4. Depois de extrair e expandir o DNA alvo de acordo com o protocolo de texto, use um kit analisador de fragmentos para executar a região genômica alvo amplificada por PCR de todos os clones através da mistura de corante em gel de acordo com as instruções do fabricante.

Confirmar os clones de IPSC pluripotentes de acordo com o protocolo de texto. Antes da transdução do vírus de Sendai, as células pancreáticas mostram morfologia típica de fuso. Pequenas colônias apertadas aparecem nos MEFs no dia 12, assemelhando-se a colônias de células pluripotentes humanas.

Normalmente, as colônias de IPSC humanas totalmente reprogramadas têm limites muito claros e podem ser captadas nos dias 23 a 30. Uma colônia dissociada no dia 23 é mostrada aqui. Apresentamos aqui uma imagem típica de contraste de fase de uma colônia IPSC após a colheita e cultura em condições livres de alimentador após a reprogramação do vírus Sendai de células pancreáticas.

As colônias de IPSC vermelhas coradas com fosfatase alcalina estão à direita. As IPSCs foram confirmadas por imunocoloração para os marcadores de pluripotência OCT4 e NANOG, como visto nesses painéis. Neste experimento, as IPSCs foram coradas com marcadores de superfície celular e a análise FACS foi realizada em uma única suspensão celular.

O pico verde representa IPSCs pancreáticos e o pico roxo contém células IPSC negativas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter condições assépticas ou estéreis para classificação e cultura de células. Após este procedimento, outros métodos, como direcionamento de genes em IPSCs e ESCs, podem ser realizados, e perguntas adicionais podem ser respondidas realizando modificações genéticas precisas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar IPSCs sem pegadas e alimentadores de forma confiável e realizar a edição do genoma bialelicamente.