Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9
8 de novembro de 2017
Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.
O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de pegadas, ou IPSCs, a partir de células pancreáticas humanas em condições livres de células de apoio, em seguida editar as células utilizando ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 e, finalmente, caracterizar os clones monoclonais modificados. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de edição do genoma de células-tronco humanas, como a geração de IPSCs livres de pegadas e a edição com ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9. A principal vantagem desta técnica é que linhagens clonais de IPSCs editadas podem ser geradas com alta confiabilidade e não há evidência de mosaicismo.
Após revestir uma placa de seis poços com colágeno frio, plaque células pancreáticas primárias humanas de passagem inicial em meio Prigrow III no dia 2 para atingir aproximadamente 2,5 x 10⁵ células ou pelo menos 60% de confluência por poço no dia da transdução, ou dia zero. No dia da transdução, após colher e contar as células conforme o protocolo descrito no texto, descongele em gelo um conjunto de tubos de vetor Sendai e adicione cuidadosamente os volumes calculados de cada tubo a 1 mL de meio Prigrow III pré-aquecido. Pipete suavemente para misturar a solução.
Aspire o Prigrow III das células e adicione lentamente a mistura de vírus de reprogramação aos poços. Em seguida, incube as células em uma estufa a 37 graus Celsius durante a noite. Vinte e quatro horas após a transdução, descarte cuidadosamente a mistura de vírus sobre as células e substitua por meio fresco de Prigrow III.
No sexto dia, adicione 1 mL de solução de desanexação celular às células e incube-as por 10 minutos. Em seguida, usando Prigrow III com inibidor de rock, plaque todas as células em placas de MEFs preparadas no dia anterior. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite.
Observe regularmente as placas quanto ao surgimento de aglomerados ou colônias celulares indicativas de células reprogramadas, que formarão agregados clonais com morfologia de pavimentação e núcleo grande com nucléolos proeminentes. Marque as colônias prováveis de iPSCs e verifique regularmente seu crescimento. Quase quatro semanas após a transdução, após o preparo das placas de MEF de 24 poços, prepare a membrana matricial aliquotando-a com base no fator de diluição indicado no certificado de análise.
Escolha 24 a 48 colônias e transfira-as para placas de 24 poços revestidas com membrana matriz e meio mTeSR1. Incube as placas por 24 horas e troque o meio diariamente. Consulte o protocolo descrito no texto para obter detalhes adicionais.
Adicione 500 mcL de dispase para destacar as colônias robustas cultivadas na membrana da matriz. Após incubar as células por 20 minutos, plante-as novamente em placas de 12 poços revestidas com membrana da matriz. Expanda e caracterize os clones utilizando coloração de fosfatase alcalina, imunocoloração e análise por FACS de acordo com o protocolo descrito no texto.
Para transfectar as HIPSCs após a síntese de SGRNAs de acordo com o protocolo descrito, prepare a mistura mestra de nucleofecção para cada amostra combinando 0,5 mcg de proteína Cas9 e 0,5 mcg de cada SGRNA em um volume de reação de 22 mcL. Após aspirar o meio contendo o inibidor de rock, use 2 mL de RTPBS para lavar cada poço das ISPCs. Em seguida, aspire o PBS e adicione 1 mL de solução de desanexação celular.
Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. Resuspenda as células em 3 mL de meio mTeSR1 e pipete suavemente para cima e para baixo para gerar uma suspensão de células individuais. Transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio mTeSR1.
À mistura mestra de nucleofecção, adicione 16,4 µL do suplemento para células primárias P3 e 3,6 µL do suplemento um do kit Nucleofector. Após contar e centrifugar as células, re-suspenda cada unidade de 0,5 x 10⁶ células em 22 µL da mistura mestra de transfeção previamente preparada. Transfira rapidamente as células para a câmara central de uma das cavidades de uma fita Nucleocuvette.
Em seguida, coloque a tira em um dispositivo Nucleofector e realize a nucleofecção das células utilizando o programa CB150. Após a nucleofecção, adicione rapidamente 80 mcL de meio mTeSR1 pré-aquecido contendo inibidor de rock a 10 micromolar a cada poço das células nucleofectadas. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
Transfira suavemente as células da tira para os poços da placa de 12 poços com membrana matriz pré-revestida, contendo meio mTeSR1 com inibidor de ROCK. No segundo dia de incubação após o preparo das placas de MEF, substitua o meio dos HIPSCs de mTeSR1 por mTeSR1 suplementado com SMC4 1X por pelo menos duas horas antes da triagem de célula única. Aspire o meio dos HIPSCs e use PBS para lavar suavemente as células.
Em seguida, adicione 500 mcL de solução de desanexação celular em cada poço e incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Gere uma suspensão de células individuais adicionando 1 mL de mTeSR1 em cada poço e pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Separe as células individuais em poços individuais de uma placa de 96 poços previamente preparada.
Quatro dias após a classificação, a formação de colônias deverá ser aparente. Nesse momento, substitua o meio de cultura por meio HESC suplementado com SMC4 1X. Após extrair e amplificar o DNA alvo de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize um kit analisador de fragmentos para analisar a região genômica alvo amplificada por PCR de todos os clones na mistura de corante para gel, conforme instruções do fabricante.
Confirme clones de iPSCs pluripotentes de acordo com o protocolo descrito no texto. Antes da transdução com o vírus Sendai, as células pancreáticas apresentam morfologia típica em forma de fuso. Pequenas colônias compactas aparecem sobre MEFs no dia 12, semelhantes às colônias de células pluripotentes humanas.
Normalmente, as colônias de IPSCs humanos totalmente reprogramados apresentam limites muito definidos e podem ser isoladas entre os dias 23 e 30. Uma colônia dissociada no dia 23 é mostrada aqui. Apresenta-se aqui uma imagem típica em contraste de fase de uma colônia de IPSC após o isolamento e cultivo em condições livres de camada de sustentação, após a reprogramação de células pancreáticas por vírus Sendai.
As colônias de IPSC coradas em vermelho pela fosfatase alcalina estão à direita. As IPSCs foram confirmadas por imunomarcação para os marcadores de pluripotência OCT4 e NANOG, conforme visto nestes painéis. Neste experimento, as IPSCs foram marcadas com marcadores de superfície celular e a análise por FACS foi realizada em uma suspensão de células isoladas.
O pico verde representa as CIPs pancreáticas, e o pico roxo contém células negativas para CIPs. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter condições assépticas ou estéreis para a separação celular e o cultivo celular. Após este procedimento, outros métodos, como o direcionamento gênico em CIPs e CEs, podem ser realizados, e perguntas adicionais podem ser respondidas mediante modificações genéticas precisas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar de forma confiável IPSCs livres de pegadas e livres de células de apoio, além de realizar edição genômica em alelos bialélicos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) livres de pegadas genéticas a partir de células pancreáticas humanas em condições livres de células de apoio, seguida por edição utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 e caracterização dos clones monoclonais modificados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Engenharia Genética
- Técnicas de Cultura Celular
Antecedentes
- As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são valiosas para pesquisa e terapia.
- As iPSCs livres de pegadas evitam problemas de integração associados aos métodos tradicionais.
- A tecnologia CRISPR/Cas9 permite edição precisa do genoma.
- A caracterização de clones modificados é essencial para validar alterações genéticas.
Objetivo do Estudo
- Gerar iPSCs livres de pegadas a partir de células pancreáticas humanas.
- Utilizar CRISPR/Cas9 para editar essas células.
- Caracterizar os clones monoclonais modificados resultantes.
Métodos Utilizados
- Revestimento de placas de seis poços com colágeno frio.
- Plaqueamento de células pancreáticas primárias humanas de passagem inicial em meio Prigrow III.
- Transdução com tubos de vetor Sendai para edição do genoma.
- Caracterização de clones de iPSC editados quanto à confiabilidade e mosaicismo.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de iPSCs livres de pegadas genéticas.
- Alta confiabilidade na geração de linhagens clonais de iPSCs editadas.
- Sem evidência de mosaicismo nas linhagens modificadas.
- Validação da eficácia de ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para gerar e editar iPSCs.
- iPSCs livres de vestígios podem ser usadas em diversas aplicações na pesquisa.
- Ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 são eficazes para edição precisa do genoma.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a geração confiável de iPSCs livres de pegadas genéticas a partir de células pancreáticas humanas em condições livres de camada de sustentação, apoiando a modelagem de doenças e o desenvolvimento terapêutico em diabetes e medicina regenerativa. Ao combinar a reprogramação com vetor Sendai à edição com RNP CRISPR-Cas9, o método produz linhagens clonais e livres de mosaicismo com alta eficiência, reduzindo a perda em fluxos de trabalho de validação de alvos e identificação de compostos promissores. A abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer sistemas celulares humanos geneticamente definidos e escalonáveis para desvio de riscos mecanicistas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas na linhagem pancreática humana por meio da edição genômica precisa de iPSCs.
- Valor Operacional: Produz iPSCs clonais e livres de vestígios, sem mosaicismo, garantindo um background genético limpo para a validação de alvos.
- Valor Preditivo: Oferece confiança preditiva ao gerar controles isogênicos para esclarecimento de vias e triagem fenotípica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera células pancreáticas derivadas de iPSCs validadas, adequadas para o desenvolvimento de ensaios na triagem de alvos relacionados ao diabetes.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável e reprodutível de clones de iPSCs editados para avaliação de compostos em formatos de 96 poços.
- Prontidão para Ensaios: Fornece iPSCs modificadas geneticamente e separadas em nível de célula única, com edições definidas, para triagem downstream consistente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece modelos de iPSC pancreáticas humanas relevantes para doenças, para validação pré-clínica de alvos genéticos.
- Desvio Mecanístico de Riscos: Facilita a edição de locos associados a doenças para avaliar a modulação de alvos e o direcionamento de vias em células humanas.
- Modelo Pré-clínico: Apoia o avanço ajustado ao risco mediante a geração de linhagens clonais de iPSC com edições no alvo validadas e sem integração fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, permitindo uma transição contínua da edição genética para a avaliação funcional em modelos celulares humanos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da edição precisa com CRISPR-Cas9 de iPSCs derivadas de células pancreáticas humanas para esclarecer a função gênica em vias de doenças.
- Triagem: Permite populações clonais de iPSCs prontas para ensaios com genótipos definidos, para triagem reprodutível de compostos e estudos de interação com alvos.
- Análises: Fornece resultados genotípicos quantitativos por meio de análise de fragmentos de regiões-alvo amplificadas por PCR, permitindo a comparação entre clones editados e selvagens.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta ao trabalho pré-clínico, fornecendo iPSCs humanas geneticamente modificadas com fenótipo pancreático relevante para doenças, para validação de alvos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para gerar e editar iPSCs livres de pegadas em múltiplos alvos e projetos, reduzindo o desenvolvimento redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva por meio de iPSCs clonais e livres de mosaico, com edições bialélicas precisas, para validação confiável de alvos.
- Valor Operacional: Garante padronização e escalabilidade por meio de fluxos de trabalho livres de camada de alimentação e com classificação de células individuais, compatíveis com edição de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados por meio da desmistificação mecanicista precoce em células humanas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao fornecer clones de iPSC geneticamente validados para decisões de avanço em pipelines de medicina regenerativa.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, nucleofecção e separação de células individuais para geração e edição bem-sucedidas de iPSCs.
- Depende de equipamento Nucleofector, complexos RNP CRISPR-Cas9 e placas revestidas com membrana matricial para entrega eficiente e expansão clonal.
- Necessita padronização entre equipes de cultura celular, biologia molecular e análise para caracterização consistente dos clones.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a outros tipos celulares além de células pancreáticas humanas, incluindo a otimização da eficiência de reprogramação e edição.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de técnica asséptica durante a separação e cultura para manter a integridade do clone e prevenir contaminação.
