Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

O objetivo geral deste protocolo é purificar e isolar as células endoteliais primárias do cérebro suíno, a fim de estabelecer um modelo de barreira hematoencefálica in vitro apertado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da barreira hematoencefálica, como administração de medicamentos, permeabilidade, tráfego de receptores, bem como a rigidez e polaridade do BB. A principal vantagem deste modelo é o alto rendimento de células endoteliais cerebrais primárias que podem ser usadas para criar um modelo de barreira hematoencefálica in vitro com alto TEER e baixa permeabilidade. Para iniciar este procedimento, coloque os cérebros em uma bancada de fluxo estéril e lave-os suavemente com um litro de PBS em um copo colocado no gelo.

Em seguida, remova cuidadosamente as meninges de cada cérebro usando uma pinça de ponta fina. Usando um bisturi, raspe a massa cinzenta do cérebro, uma de cada vez, e transfira o material isolado para placas de Petri contendo 20 mililitros de DMEM / F-12 colocados no gelo. Para a fragmentação inicial, passe o material de substância cinzenta por uma seringa de 50 mililitros sem a agulha.

Repita o procedimento para todos os cérebros e agrupe o material de matéria cinzenta coletado. Transfira o material isolado de substância cinzenta com meio DMEM/F-12 para o tubo triturador de um homogeneizador de tecidos portátil. Homogeneizar o material fazendo oito movimentos para cima e para baixo com um pilão solto, seguidos por oito movimentos para cima e para baixo com um pilão apertado.

Em seguida, isole os capilares filtrando o homogeneizado usando um frasco de tampa azul de 500 mililitros com porta-filtro e malha de filtro de 140 mícrons. Coloque os filtros capilares em placas de Petri com uma solução de digestão. Em seguida, incubar as placas de Petri a 37 graus Celsius durante uma hora num agitador orbital a 180 RPM ou agitá-las suavemente a cada 10 minutos.

Após uma hora, lave os capilares dos filtros com suspensão da placa de Petri. Em seguida, divida a suspensão dos três pratos em dois tubos de 50 mililitros e interrompa a digestão adicionando 10 mililitros de DMEM/F-12 a cada tubo de 50 mililitros. Centrifugue as suspensões celulares a 250 vezes g, quatro graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, aspirar os sobrenadantes e ressuspender cada pellet em 10 mililitros de DMEM/F-12. Em seguida, adicione mais 20 mililitros de DMEM/F-12 a cada tubo. Para otimizar as condições de fixação dos PBECs, adicionar solução de revestimento ao frasco T-75, resultando nas concentrações finais de colágeno quatro a 150 microgramas por mililitro e fibronectina a 50 microgramas por mililitro e por água destilada, certificando-se de que a solução cubra toda a superfície.

Em seguida, descongele os capilares em banho-maria de 37 graus Celsius. Para remover o meio de congelamento, gire os capilares para baixo a 250 vezes g, quatro graus Celsius, por sete minutos. Depois disso, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um a dois mililitros da alíquota de 10 mililitros.

Em seguida, transferir a suspensão capilar para o balão T-75 revestido e inclinar suavemente o balão para assegurar uma distribuição uniforme sobre a superfície. Colocar o balão T-75 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação durante a noite, preparar 10 mililitros de meio de crescimento PBEC, suplementado com puromicina a quatro microgramas por mililitro para um balão T-75 e efectuar uma mudança de meio.

Em seguida, prepare as inserções de membrana permeável para semeadura de PBEC, revestindo-as com colágeno IV a 500 microgramas por mililitro e fibronectina a 100 microgramas por mililitro e com água destilada. Tripsinizar as células adicionando dois mililitros de solução de tripsina-EDTA ao frasco T-75 e colocá-lo a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por cinco a sete minutos. Para separar as células endoteliais cerebrais, bata suavemente na lateral do frasco T-75 com a ponta dos dedos.

Em seguida, transfira a solução celular para um tubo de 15 mililitros e gire as células endoteliais cerebrais por centrifugação a 250 vezes g, quatro graus Celsius, por sete minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio. Em seguida, adicione mais dois mililitros de meio para trazer o volume total para três mililitros.

Conte o número de células manualmente usando uma câmara de contagem de células ou um sistema automático de contagem de células. Para cocultura sem contato, transfira as inserções para os poços que possuem astrócitos, que foram atualizados com meio de crescimento de astrócitos no dia anterior. No dia seguinte, substitua o meio nas inserções de membrana permeável contendo PBECs.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio dos poços e adicione 750 microlitros de meio de diferenciação a cada poço. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio das inserções e adicione 500 microlitros de meio de diferenciação por inserção. Em seguida, adicione os 750 microlitros restantes de meio de diferenciação a cada poço de astrócitos.

Depois disso, incubar as células com meio de diferenciação a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, até o dia seguinte. No dia seguinte à estimulação das células com meio de diferenciação, prepare o sistema da câmara de medição da resistência tecidual para medições TEER enxaguando a câmara duas vezes com água bidestila, uma vez com etanol a 70% por cinco minutos e mais duas vezes com água bidestilada Em seguida, conecte a câmara ao sistema, adicione quatro mililitros de DMEM/F-12 à câmara de medição da resistência do tecido e deixe-a permanecer em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos.

Depois disso, execute as medições TEER colocando cuidadosamente as inserções na câmara de medição de resistência do tecido. Aqui estão as imagens de microscopia de contraste de fase de PBECs, culturas e astrócitos vistos ao longo de cinco dias. Os fragmentos capilares purificados no primeiro dia do cultivo inicial mostraram presença de ambos os capilares e células contaminantes, que após a mudança do meio no segundo dia e um dia adicional de crescimento, apresentaram seleção para PBECs, iniciando seu crescimento a partir dos fragmentos capilares.

Monocamadas confluentes de PBECs foram geralmente alcançadas no quarto ao sexto dia, momento em que os PBECs mostraram morfologia fusiforme e foram alinhados longitudinalmente. Os astrócitos de ratos semeados nos poços de fundo normalmente proliferaram em camadas confluentes em cinco dias e foram usados para modelos de cocultura sem contato após duas semanas de crescimento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a entrega de medicamentos e o tráfego de receptores em células endoteliais cerebrais compactas e polarizadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo de barreira hematoencefálica in vitro que pode ser usado para novos estudos que não podem ser realizados in vivo.