Name: Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a estababelecer um modelo in vitro da barreira hematoencefálica usando células endoteliais cerebrais de suínos. Este método otimizado oferece alta reprodutibilidade e baixa permeabilidade para estudos de descoberta de fármacos.

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Os autores gostaria de reconhecer Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen para assistência técnica, e a Fundação Lundbeck conceder número 14113-R155-2013.

Os autores não relatam nenhum conflito de interesses.

Purificação e proliferação de pBEC
Durante o processo de purificação, passos críticos incluem remoção rápida e eficaz das meninges e separação da matéria branca e cinza, que é importante para o rendimento de purificação e a pureza e para o estabelecimento adequado do modelo. Para o apresentado em vitro BBB modelo usando pBECs, nós temos melhorado e simplificado de um processo de purificação, com base na homogeneização mecânica de matéria cinzenta isolada, tamanho-seletiva de filtragem pa...

A estrutura celular e função da barreira sangue - cérebro
Na interface do sistema nervoso central e circulatório (CNS), o BBB atua como um site chave reguladora para controle homeostáticos do microambiente do CNS, que é essencial para o bom funcionamento e proteção do sistema nervoso. O site do BBB é as células endoteliais que revestem o lúmen do vaso sanguíneo. Nos capilares do cérebro, as células endoteliais formam complexas intercelulares junções apertadas e testes padrões da expressão fortemente polarizada de transportadores de influxo e efluxo particulares assegurar transporte molecular altamente específica entre o sangue e o cérebro 1. Os componentes estruturais dos complexos junção apertada incluem proteínas da família occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin e associado a moléculas de adesão (compotas). Claudin 5 é particularmente importante na restrição paracellular juncional. Indução e manutenção deste fenótipo endotelial do BBB característico envolvem interações dinâmicas com células circundantes, incluindo pericitos, astrócitos, neurônios e as membranas do porão, que, juntamente com o cérebro endotelial, células de forma a neurovascular unidade (NVU)2,3. Os mecanismos envolvidos nessas interações não são compreendidos ainda inteiramente, mas incluem a troca de sinais químicos entre as células, que permite a modulação da permeabilidade do BBB a curto prazo e induz a longo prazo BBB características4. Astrócitos, especialmente, são conhecidos por contribuir para o fenótipo de células endoteliais do cérebro e são uma fonte de fatores regulatórios como gliais-derivado neurotrophic factor (afetando cAMP intracelular)5, de fator de crescimento fibroblástico básico6, Hidrocortisona7e transformadora fator de crescimento β (TGF-β)8. O efeito de TGF-β, no entanto, tem sido debatida9.
In Vivo em Vitro BBB
Estudos in vivo continuam a fornecer informações valiosas sobre a biologia do BBB. No entanto, modelos de cultura celular podem fornecer insights adicionais e constituem ferramentas úteis para a compreensão de aspectos moleculares e funcionais detalhados do BBB na saúde e na doença. Embora as interações complexas entre os tipos de células e constituintes do BBB são difíceis de alcançar plenamente em modelos em vitro , tem havido, desde a primeira purificação de células endoteliais do cérebro e aplicação destes em mono-culturas 10 , 11 , 12, o desenvolvimento extensivo dos processos de purificação e condições de crescimento do BBB celulares modelos de cultura, resultando em maior semelhança com a barreira na vivo . Os modelos usados em vitro BBB baseiam-se em células primárias de roedor, suínos e bovina de origem e em linhas celulares imortalizado. Cada modelo tem diferentes vantagens e desvantagens. Para a escolha do modelo e comparação, marcadores de validação como expressão de enzimas, transportadores, receptores e proteínas estruturais BBB são usados para criar visões gerais do atual estabelecido modelos1.
O protocolo
Uma característica importante do BBB é tensão de barreira e TEER alta, ainda um grande número de modelos disponíveis não refletem bem os níveis na vivo . Incorporando contribuições de desenvolvimento e otimização de vários laboratórios, o objectivo do presente protocolo é apresentar um método para estabelecer um alta TEER em vitro BBB modelo baseado na pBECs primária no MC com ou sem ACM, ou no NCC com primário astrócitos de ratos ou de origem porcina. Os procedimentos aplicados e o estabelecimento do modelo incluem esforços para eliminar as células contaminantes e melhorar a diferenciação de pBECs em um fenótipo BBB. Este trabalho resultou na criação de modelos TEER confiáveis e de alta com paracellular baixa permeabilidade e boa expressão funcional de proteínas juncionais apertadas chaves, transportadores e receptores. No entanto, como os astrócitos são um fator contribuinte para o fenótipo de células endoteliais do cérebro, as três condições diferentes da cultura representam três diferentes fenótipos das células endoteliais do cérebro. O modelo NCC é especificamente útil para estudos de determinados mecanismos especializados envolvidos na descoberta de medicamentos, estudos de transporte e o tráfico intracelular, bem como para a investigação das interações célula-célula, onde é a máxima expressão de características BBB vantajoso.
Origem e história do protocolo
O modelo de pBEC descrito aqui baseia-se em grande parte no modelo porcino desenvolvido nos laboratórios Eisai (Londres) por Dr. Louise Morgan e seus colegas, que é baseado em um sucesso anterior cérebro bovino endothelial da pilha modelo13. O método original de preparação da pilha foi um dois-fase de filtragem usando nylon malhas para pegar o microvessels, seguido por uma etapa de subculturing para melhorar a pureza. No desenvolvimento do método anterior, tensão do fenótipo e barreira BBB ideal foram atingidos pelo crescimento médio e completados, incluindo ACM. Modificações adicionais para o método foram feitas por R. Skinner no laboratório do Prof N. Rothwell em Manchester UK14,15. O método foi adotado pelo laboratório Abbott, KCL de Londres, onde Patabendige fez significativamente mais simples de preparar, evitando o uso de astrócitos ou ACM e eliminando células contaminantes como pericitos com puromicina. Os primeiros artigos confirmou que o modelo MC preservadas várias características importantes do na vivo BBB, incluindo junções apertadas eficazes, sistemas de transporte de membrana e mediada transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. mais tarde S. Yusof novamente testado co-cultura astrocyte e melhorou significativamente TEER, então esta é a variante preferencial usado atualmente na Abbott laboratório21. O modelo agora tem sido com sucesso transferido para o M. Nielsen laboratório em Aarhus, onde novas modificações foram introduzidas (este protocolo), incluindo simplificadora cinza importa extração, usando malha apenas uma etapa de filtração e uma etapa de revestimento de filtro único combinação de colágeno e fibronectina. O procedimento aplicado para isolamento de suínos astrócitos (este protocolo) foi baseado em protocolos desenvolvidos pelo laboratório T. Moos em Aalborg, descrito por Thomsen et al.22. A TEER e outras propriedades do modelo gerado em Londres e Aarhus são semelhantes, que empresta a confiança para a noção de que o modelo é facilmente transferido entre laboratórios e responde bem a observação cuidadosa e racionalização das etapas do método. Com efeito, S. Yusof criou o modelo MC em um país tropical (Malásia)23, que envolveu a nova adaptação para as condições locais e fontes de tecido.
Vantagens sobre métodos alternativos e atualmente estabeleceram modelos
Em comparação com células endoteliais do cérebro de origem bovina e roedor, pBECs oferecem a vantagem de ter uma menor taxa de perda do fenótipo BBB na vivo após isolamento24. Além disso, os pBECs são capazes de formar barreiras endoteliais relativamente apertadas, mesmo quando cultivadas em MC (Ω 800 cm2)16 , em comparação com os níveis comumente relatados por monocamadas de linhas celulares, tais como bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrais primários células endoteliais de rato (100-300 Ω cm2)SS = "xref" > 33,34,35,36 e rato (100-300 Ω cm2)37,38. No entanto, a TEER demonstrou dependência sobre os procedimentos de purificação e de cultura. Na maioria dos casos, a adição de ACM ou co-cultura com astrócitos mostra diferenciação efeitos sobre as células endoteliais e um aumento na tensão das camadas endoteliais1. No entanto, com os esforços para otimizar as condições de cultivo, apenas os modelos baseados em bovinos mostraram valores TEER comparável aos modelos baseados em suínos (médias de 800 Ω cm2 no MC, até 2500 Ω cm2 em co-cultura astrocyte)13 ,39,40,41,42,,43,44,45. Como os modelos baseados no cérebro bovino primário, células endoteliais mostraram grandes variações, tanto entre como dentro de laboratórios14,,45,46,,47,48, reprodutibilidade pode ser um problema. No modelo de pBEC relatado aqui, os laboratórios contribuindo alcançaram TEER muito semelhante e valores de permeabilidade paracellular com baixa variabilidade, tanto em e entre laboratórios. Daí, é possível que outros laboratórios estabelecer um modelo robusto com baixa variabilidade, usando o método apresentado aqui. Além de formar camadas endoteliais apertadas, modelos com pBECs anteriormente foram validados pela expressão de proteínas de junção apertada, transportadores BBB funcionais, receptores e enzimas e aptidão demonstrada para uma gama de estudos15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Além disso, dados de transcriptoma inéditos sobre as culturas co de pBECs mostram um perfil esperado do BBB transportadores e receptores (resultados não publicados, Nielsen et al).
O modelo baseado em suínos de BBB tem uma vantagem adicional como o genoma, anatomia, fisiologia, e progressão da doença do porco refletem a biologia humana para um grau mais elevado do que outros modelos estabelecidos dispõe de60, que são favoráveis para o indústria farmacêutica. Como cérebros de suínos são um subproduto comum da indústria da carne, eles constituem uma fonte facilmente acessível de cérebro células endoteliais, minimizando o número de animais necessários para as experiências e fornecendo um rendimento elevado da purificação de um cérebro de suínos. Apesar de purificação e cultivo de células primárias é um pouco demorados e exige conhecimentos especializados de normalização na criação do modelo, as células primárias gerar os modelos BBB mais confiáveis. Linha celular imortalizado não pode ser um substituto, como propriedades importantes, tais como tensão de barreira, perfis de expressão do transportador e regulamento do microambiente não refletem os resultados experimentais na vivo61, 62. em vitro modelos oferecem a vantagem de viver-pilha de imagens com maior resolução, possibilitando a visualização de processos intracelulares, permitindo uma abordagem de proximidade para as células da amostra ou observadas, com objectivos com ampliação maior e melhor qualidade óptica63. Isto não é o caso para o uso da microscopia de dois fotões em animais vivos. Além disso, em vitro modelos fornecem a capacidade de transfect células, permitindo a visualização de proteínas etiquetadas e investigação do seu tráfico.
Aplicações do modelo
A função do BBB não é fixo e pode ser modulada dinamicamente na fisiologia e patologia. Em muitas doenças neurológicas, incluindo neurodegenerativas, doenças inflamatórias e infecciosas, interrupções e aumento da permeabilidade do BBB é observado64,,65,66,67 . Para reduzir e prevenir a progressão da doença e danos subsequentes, identificação e caracterização dos mecanismos moleculares subjacentes à modulação do BBB são de grande importância. Neste contexto, confiável em vitro modelos estão em alta demanda pela indústria farmacêutica, em Além disso desempenham papéis importantes na previsão de permeabilidade BBB de drogas ao SNC. Qualquer modelo in vitro , servindo como uma tela de permeabilidade deve exibir um caminho paracellular restritiva, uma arquitetura cell fisiologicamente realistas e expressão funcional de mecanismos de transporte68. Demonstrado em estudos anteriores16,17,57e por paracellular permeabilidade e expressão de proteínas TJ e AJ aqui, o modelo apresentado atende a todos esses critérios e é adequado para uma variedade de BBB estudos em ambos fisiologia normal e em patologia. Os pontos fortes do método de purificação e cultivo apresentado incluem uma combinação de simplicidade e reprodutibilidade e a capacidade de incluir hamartomas influenciaram com um robusto e fiável alta TEER em vitro BBB modelo resultante. Para esta finalidade, astrócitos de suínos e rato origem têm sido mostrados para aumentar o fenótipo BBB de pBECs em um similar de maneira22.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Baixa Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Soro derivado de plasma (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>Misturar a solução a 70 % da EtOH</td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich a 96 %</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td> Feito com frascos <td>Elga System</td></tr><tr><td>T75</td><td>Inserções Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell (Inserções de membrana permeável celular)</td> <td>Placa</td><td>Costar CLS3401</td> de <td>12 poços, diâmetro de 12 mm, 0,4 &mu; m membrana de policarbonato</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 50 ml</td> Placas <td>de Petri 227261</td><td></td><td>Cellstar</td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 150350 Frascos criogênicos Garrafa 377224 de 500 ml Thermo <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Bisturis <td></td></tr><tr><td></td>Homogeneizador <td>de tecidos tipo</td><td>24</td> <td>REF0211 Swann-Morten</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; m filtros</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtros M</td><td>Sistema de câmara EndOhm Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12</td><td>Câmara EndOhm para copos de cultura de 12mm</td></tr><tr><td>Sistema de eletrodos EVOM2</td> Sistema de medição World <td>Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>TEER com par de eletrodos rígidos STX-100C</td></tr><tr><td>Agulha longa</td><td>Sigma</td><td></td><td>Anexe a uma seringa</td></tr><tr><td>Pinça curva de ponta fina</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta larga</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de filtro</td> Seringa de 50 ml <td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p120 Laboratórios</td> de <td>transdução BD de anticorpo</td> de catenina <td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Claudina 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG conjugado com Alexa Flour 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Burro anti camundongo IgG conjugado com Alexa Flour 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&micro; l/ml conc de trabalho final</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 &micro; g/ml de trabalho final conc</td></tr></tbody></table>

melhor método para o estabelecimento de uma in vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

O objectivo do presente protocolo apresenta um procedimento otimizado para purificação e cultivo de pBECs e para estabelecer em vitro barreira hemato - encefálica (BBB) modelos baseados em pBECs em mono-cultura (MC), MC com astrocyte-condicionado médio (ACM), e sem contato co-cultura (NCC) com astrócitos de suínos ou rato origem. pBECs foram isoladas e cultivadas de fragmentos de capilares dos córtices cerebral de suínos domésticos 5-6 meses de idade. Esses fragmentos foram purificados por remoção cuidadosa de meninges, isolamento e homogeneização da massa cinzenta, filtração, centrifugação e digestão enzimática. Para eliminar mais células contaminantes, os fragmentos capilares foram cultivados com puromicina contendo médio. Quando 60-95% de confluencia, pBECs crescente dos fragmentos capilares foram passadas para filtro de membrana permeável insere e estabelecidos nos modelos. Para aumentar a tensão de barreira e fenótipo característico de BBB de pBECs, as células foram tratadas com os seguintes factores de diferenciação: permeant 8-CPT-acampamento da membrana (acampamento abreviado aqui), hidrocortisona e um inibidor da fosfodiesterase, 1724-RO-20 (RO). O procedimento foi realizado durante um período de 9 a 11 dias, e ao estabelecer o modelo do NCC, os astrócitos foram cultivados 2-8 semanas de antecedência. Aderência aos procedimentos descritos no protocolo permitiu a criação de camadas endoteliais com permeabilidade restrita paracellular, com o NCC modelo mostrando uma resistência elétrica média transendothelial (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω 2e paracellular permeabilidade (P.app) para Lúcifer amarelo de 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (quer dizer SEM ±, n = 55). Nova avaliação deste fenótipo pBEC mostrou boa expressão da proteínas juncionais apertado claudin 5, ZO-1, occludin e adherens junção catenina p120 de proteína. O modelo apresentado pode ser usado para uma variedade de estudos do BBB na saúde e na doença, e, com a permeabilidade de paracellular altamente restritiva, este modelo é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular.

Estabelecimento dos modelos In Vitro de BBB
No método apresentado, otimizado, a cultivo de pBECs e o estabelecimento do sistema de inserção de membrana permeável com MC ou sem ACM ou NCC com astrócitos (Figura 1) foi realizadas por um período de 9-11 dias (Figura 2). Para a seleção das células endoteliais, uma cultura inicial de fragmentos capilares purificados fo...

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

O objetivo geral deste protocolo é purificar e isolar as células endoteliais primárias do cérebro suíno, a fim de estabelecer um modelo de barreira hematoencefálica in vitro apertado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da barreira hematoencefálica, como administração de medicamentos, permeabilidade, tráfego de receptores, bem como a rigidez e polaridade do BB. A principal vantagem deste modelo é o alto rendimento de células endoteliais cerebrais primárias que podem ser usadas para criar um modelo de barreira hematoencefálica in vitro com alto TEER e baixa permeabilidade. Para iniciar este procedimento, coloque os cérebros em uma bancada de fluxo estéril e lave-os suavemente com um litro de PBS em um copo colocado no gelo.Em seguida, remova cuidadosamente as meninges de cada cérebro usando uma pinça de ponta fina. Usando um bisturi, raspe a massa cinzenta do cérebro, uma de cada vez, e transfira o material isolado para placas de Petri contendo 20 mililitros de DMEM / F-12 colocados no gelo. Para a fragmentação inicial, passe o material de substância cinzenta por uma seringa de 50 mililitros sem a agulha.Repita o procedimento para todos os cérebros e agrupe

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Este vídeo demonstra o isolamento dos capilares de cérebros suínos frescos. O processo envolve a remoção das meninges, isolando a substância cinzenta do tecido cerebral, homogeneizando e filtrando a substância cinzenta para isolar os capilares e, finalmente, usando a digestão enzimática para purificar ainda mais os capilares.

Purificando capilares de um cérebro suíno

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

A barreira sangue-cérebro humana impede seletivamente a penetração de moléculas hidrofônicas e patógenos no cérebro. Várias patologias, incluindo meningite e delírio pós-operatório, estão associadas a uma maior permeabilidade da barreira hematoencefálica. Aqui, descrevemos um modelo de cultura celular endotelial para testar a permeabilidade da barreira por travessia microbiana.

Analisando a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica por Travessia Microbiana através de Células Endoteliais Microvasculares

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Aprenda a estababelecer um modelo in vitro da barreira hematoencefálica usando células endoteliais cerebrais de suínos. Este método otimizado oferece alta reprodutibilidade e baixa permeabilidade para estudos de descoberta de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos (Vídeo) | JoVE Journal

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

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