Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

O objetivo geral deste método é a detecção de depósitos de agregados de proteínas em configurações clínicas e científicas. A coloração com ácido hepta formil tiofeno acético e a análise de tecidos de modelos animais da doença do príon e da doença de Alzheimer são descritas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo amilóide, como a presença de pequenas quantidades de agregados proteicos e suas variações conformacionais intrínsecas.

A vantagem dessa técnica é que ela é mais seletiva e mais sensível do que outras técnicas convencionais. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de várias doenças de dobramento incorreto de proteínas devido à possibilidade de adaptar as sondas à técnica de visualização desejada. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam porque a hFTAA requer uma concentração de coloração muito baixa.

O HFTAA também exibe um comprimento de onda de excitação e emissão mais longo em comparação com os corantes convencionais. Preparar a solução de oligotiofeno conjugado luminescente ressuspendendo o hFTAA liofilizado em hidróxido de sódio de dois milimolares para preparar uma solução-mãe de um miligrama por mililitro. Transfira a solução de estoque para um frasco de vidro e armazene a quatro graus Celsius.

Se forem usadas seções fixadas em formalina e embebidas em parafina, desparafinizar em xileno durante a noite. No dia da coloração, mergulhe as seções em banhos consecutivos de etanol a 99%, etanol a 70%, dH2O e PBS por dez minutos de cada vez. Em seguida, deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais.

Enquanto o tecido seca, prepare uma solução de trabalho de hFTAA diluindo o estoque de um a 10.000 em PBS. Quando o tecido estiver seco, adicione gotículas da solução de trabalho hFTAA a cada seção de tecido para cobri-la. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente.

Enxágue a solução de coloração com 500 microlitros de PBS e, em seguida, mergulhe a lâmina no banho de PBS por 10 minutos. Depois de deixar a seção secar em condições ambientais, monte usando meio de montagem de fluorescência. Deixe o meio de montagem assentar durante a noite.

A detecção de amilóide pode ser realizada diretamente após a montagem, ou mesmo sem montagem. No entanto, se o objetivo do experimento for coletar informações espectrais de alta qualidade, a incubação noturna é preferida. Abra o software do microscópio, nomeie o projeto, selecione a imagem espectral e inicie a aquisição.

Selecione o objeto de interesse através da ocular usando o filtro de excitação de 436 nanômetros e mude o caminho da luz para a câmera. No gerenciador de dados de caso, selecione o tipo de amostra espectral, rotule a amostra e pressione adquirir. A janela de aquisição será aberta.

Em imagem espectral, abra o menu de configurações, selecione as propriedades de aquisição e defina a faixa espectral para 460 a 700, a qualidade da velocidade na velocidade máxima e o tipo de medição para filtros estreitos a laser de gás. Feche a caixa de diálogo. No menu de imagens, selecione ao vivo completo.

Na barra do ícone, desative as franjas. Selecione uma região para a imagem e verifique se o valor de pico de memória está abaixo de 800 megabytes. Defina o tempo de exposição para um valor que forneça um brilho total da imagem entre 1.000 e 3.000.

Na barra do ícone, pressione a câmera colorida. A aquisição começará. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, pressione salvar na caixa de diálogo adquirir imagem espectral e nova célula na caixa de diálogo do gerenciador de dados de caso.

No gerenciador de dados de caso, abra a imagem coletada usando o botão iniciar análise. A janela de análise de dados será aberta. As informações espectrais podem ser coletadas de cada pixel da imagem selecionando ROIs usando a caixa de diálogo de exibição espectral.

Escolha, defina e selecione ROIs das áreas relevantes da imagem. Salve os dados espectrais como um arquivo de texto usando o botão Lib. O arquivo txt salvo pode ser importado para qualquer software de análise de sua escolha.

Abra o software do microscópio e comece configurando o microscópio confocal. Defina a intensidade do laser para 0,2% do orifício para uma unidade Airy, o tamanho do quadro para 1.024 por 1.024 pixels, a velocidade de varredura como sete com média de mais de 16 varreduras e a profundidade de bits como oito bits. Para coletar o espectro de emissão, selecione o modo lambda e o laser de argônio definido para 488 nanômetros.

Colete emissões entre 499 e 691 nanômetros usando 22 canais no detector de suspiro de 32 canais. Defina o ganho para 755. Clique no botão ao vivo e altere a paleta para o indicador de intervalo e ajuste o ganho para permitir pixels não sobrecarregados em vermelho.

Clique no botão Parar e, em seguida, capture a imagem pelo botão de encaixe. Para obter imagens de canal único, selecione a opção de configuração inteligente. Selecione FITC e Alexa 532.

Selecione a separação linear e aplique. Ajuste o ganho para permitir pixels não sobrecarregados. Para FITC, defina o ganho para 693 e, para Alexa 532, defina o ganho para 433 durante o modo ao vivo.

Clique no botão Parar e, em seguida, capture a imagem pelo botão de encaixe. Mude o microscópio para o modo FLIM. Defina o orifício para 20, o comprimento de onda de excitação para 490 nanômetros e a intensidade do laser para 0,5% Use lasers pulsados a 40 megahertz.

No software FLIM, configure a contagem de fótons acima de 550 nanômetros. Na janela de parâmetros de exibição, siga a contagem de fótons até que a contagem máxima seja de cerca de 4.000 contagens de fótons. Salve o arquivo e exporte-o como imagem SPC.

Esta imagem mostra corpos de Mallory-Denk consistindo de agregados de queratina em hepatócitos hepáticos contracorados com DAPI. Aqui, inclusões positivas de P62 são mostradas na miosite corporal de inclusão esporádica no tecido muscular esquelético. Esta imagem mostra uma inclusão amilóide do polipeptídeo amilóide das ilhotas no pâncreas humano.

Um depósito amilóide de cadeia leve de imunoglobulina no intestino humano é mostrado aqui. Esta imagem mostra depósitos de agregados de proteína príon de scrapie de ovelha no cérebro de camundongos. Os agregados de proteína príon em um cérebro de camundongo infectado com doença debilitante crônica são mostrados aqui.

Esta imagem mostra placas A-beta-amilóides no cérebro de camundongos APP23. E esta imagem mostra a patologia A-beta no cérebro de camundongos APP-PS1. Esses esfregaços de biópsia de gordura de amostras diagnósticas de amilóide de transtirretina em pacientes humanos classificaram de um a quatro de acordo com a pontuação padrão do Congo Red.

As áreas amarelas mostram depósitos de amilóide de transtirretina corados com hFTAA e azul é a autofluorescência do tecido adiposo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de corar em concentração adequadamente baixa. Lembre-se também de usar filtros de passagem longa para obter o máximo contraste e também evitar a autofluorescência e a fluorescência da coloração de fundo.

Após este procedimento, outros métodos como a imunofluorescência podem ser realizados para identificar a proteína agregada e identificar proteínas coagregadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da amiloidose explorarem estruturas de agregados de proteínas e para a química orgânica projetar novas sondas para esses alvos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como fazer a coloração LCO para obter imagens de cada uma com técnicas diferentes.