Name: Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a técnica de coloração com hFTAA para detecção de agregados proteicos em amostras de tecido usando microscopia de fluorescência. Este método oferece maior sensibilidade e seletividade para estudos de doenças amiloides.

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Os autores desejam agradecer Mikael Lindgren e Chanan Sluzny para o Conselho em microscopia de fluorescência e Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark e Kurt Zatloukal por contribuir cortes histologicos ou micrografias exibidas nesta publicação. A coleção de dados apresentados neste documento foi financiada por contribuições de sueca cérebro Foundation (Hjärnfonden), a associação de Alzheimer sueco (Alzheimerfonden), o Conselho de pesquisa Sueco (VR), a associação Göran Gustafsson, Georg &#38; Astrid Olsson, projeto UE FP7 saúde LUPAS e Universidade de Linköping.

Nota: síntese LCO foi realizada em nossos laboratórios por mais de uma década. Essencialmente aplicando protocolos para substituição eletrofílica aromática, paládio catalisado acoplamento, acoplamento de Amida e hidrólise de éster, personalizamos sinteticamente sondas para diferentes fins 5 , 12. após a síntese, caracterização e purificação, o produto LCO é liofilizado e armazenado à temperatura ambiente. Algumas das sondas (entre eles hFTAA) estão agora comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
 1. solução de coloração LCO Nota: se hFTAA é adquirido de um fornecedor comercial, por favor, siga o fornecedor &#39; instruções de s em vez de seção 1.
HFTAA <ol><li>Ressuspender o liofilizado em 2mm NaOH para preparar uma solução de 1 mg/mL. Manter o estoque em um frasco de vidro, a 4 ° C. As ações podem ser armazenadas por um ano.</li>
	<li>No dia da coloração, preparar uma solução de trabalho diluindo o estoque 1:10,000 em tampão fosfato salino (PBS).</li>
</ol> 2. Preparação de amostras de tecido Nota: muitos tipos de tecido podem ser fotografados usando hFTAA como um marcador de amiloide. Para obter exemplos, consulte a Figura 1. hFTAA é sensível à conformação agregada. A coloração deve, portanto, de preferência ser executada em agregados ininterrupta sem exposição epítopo. Óptima qualidade espectral é alcançada se a fixação do tecido é reduzida ao mínimo. Daí o material congelado fresco, delicadamente fixado em etanol no momento da coloração, é preferível. No entanto, é possível detectar depósitos amiloides também no tecido que foi corrigido com por exemplo, formol. hFTAA geralmente penetra o tecido bem. Selecione uma espessura do espécime que seja compatível com a intenção de imagem técnica.
<ol><li>Se formol fixa, parafinembedded seções são usadas, deparafinize em xilol durante a noite. Mergulhe as seções em banhos consecutivos de 99% de etanol, etanol a 70%, dH 2 O e PBS, 10 min em cada um. Permitir que as seções de tecido secar em condições ambientes. 
	Cuidado: Xileno sempre é tratado em uma coifa de química. Xileno e outros solventes orgânicos são prejudiciais.
	<ol><li>Cryosections descongelar em temperatura ambiente. Corrigir as seções de tecido em formol a 10% durante a noite e reidratar mergulhando-os em banhos consecutivos de 99% de etanol, etanol a 70%, dH 2 O e PBS, 10 min em cada um. Permitir que as seções de tecido secar em condições ambientes.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar gotas da solução de trabalho de hFTAA (aproximadamente 200 µ l) para as seções de tecido para cobri-lo. A gota deve permanecer no local por tensão superficial. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente para coloracao.</li>
	<li>Enxaguar fora a solução de coloração com 500 µ l PBS, usando uma pipeta e em seguida mergulhe o slide no banho de PBS durante 10 min. permitir a seção para secar em condições ambientes.</li>
	<li>Montagem utilizando o meio de montagem de fluorescência. Permitir que o meio de montagem resolver durante a noite. 
	Nota: hFTAA coloração pode ser executada em combinação com outros métodos de coloração como a imunofluorescência, célula - ou organela marcadores específicos, etc. Para realizar a coloração de co, executar sua completo protocolo de coloração de escolha e adicionar hFTAA coloração no final, a partir de passo 2.2. Para obter exemplos, consulte a Figura 2. Imunofluorescência, preferencialmente um anticorpo secundário, que está animado em 640 nm ou superior. Nesta faixa de comprimento de onda, hFTAA não absorve e, portanto, não pode ser animado e será não fluorescem. Isso garante que nenhuma infiltração é visto entre hFTAA e anticorpo.</li>
</ol> 3. Microscopia Nota: usar um microscópio de fluorescência equipado com filtros de passe longo. Todas as configurações abaixo foram usadas para gerar as imagens na Figura 4. Ajustes podem precisam ser feitas dependendo da amostra de tecido e tipo de amiloide. Apesar de hFTAA limite a amiloide é estável para branqueamento, é aconselhável desligar a fonte de luz quando a amostra não é examinada ou fotografada.
<ol><li>HIS Nota: O experimento foi realizado utilizando um microscópio de epifluorescência com filtros de emissão de passe longo e uma cabeça de câmara para dele (consulte Tabela de materiais).
	<ol><li>Uso um microscópio de fluorescência padrão equipados com filtros de passe longo e uma câmera hiperespectrais. Certifique-se que a câmara espectral é calibrada.</li>
		<li>No software, nome do projeto, selecione &#34; imagem espectral &#34; e iniciar aquisição.</li>
		<li>Selecione o objeto de interesse através da ocular usando o filtro de excitação de 436 nm e mudar o trajeto da luz para a câmera.</li>
		<li>No caso Data Manager (CDM), selecione o tipo de amostra espectrais, rótulo da amostra, e adquirir de imprensa. Abrirá a janela de aquisição.</li>
		<li>Na janela de aquisição &#34; imagem espectral &#34;, abra o menu de configurações, selecione Propriedades de aquisição e definir a faixa espectral de 460-700, a qualidade de velocidade à velocidade máxima e a medição tipo a gás/laser/estreitar os filtros. Fechar a caixa de diálogo.</li>
		<li>No menu imagem, selecione live completo. Na barra de ícones, desligue as franjas. Selecione ou tamanho de uma região para a imagem que tem o valor de memória de pico abaixo de 800 MB. Defina o tempo de exposição para um valor que dá um brilho de imagem total entre 1.000 e 3.000. Na barra de ícones, pressione a câmera colorida. Aquisição vai começar. Quando a aquisição de imagem estiver completa, pressione salvar no &#34; adquirir imagem espectral &#34; caixa de diálogo e &#34; nova célula &#34; na caixa de diálogo Gerenciador de dados caso.</li>
		<li>De MDL, abra a imagem coletada usando o botão de iniciar análise. Abrirá a janela de análise de dados.</li>
		Informações de <li>espectrais podem ser coletadas de cada pixel da imagem, selecionando ROIs usando a caixa de diálogo exibição espectral. Escolha &#34; definir &#34; e selecione as áreas relevantes da imagem ROIs.</li>
		<li>Salvar os dados espectrais como um arquivo de texto usando o botão de Lib. O arquivo. txt salvos pode ser importado para qualquer software de análise de escolha. O arquivo .slb pode ser usado para análise do software de análise de dados. Os dados de cubo hiperespectral de toda a imagem também podem ser exportados como um arquivo raw, como &#34; camadas como tif &#34;, ou como &#34; camadas no formato de texto &#34; para aplicações de análise de dados e imagem usando software externo.</li>
	</ol></li> <li>Microscopia confocal Nota: O microscópio confocal é equipado com um laser sintonizável como a fonte de excitação. Para todos os experimentos de emissão de fluorescência, definir a intensidade do laser para 0,2% (correspondendo a uma potência média de 3 µW), a pinhole para 1 unidade arejada, o tamanho do quadro para 1.024 px x 1,024 px, a velocidade de varredura como 7 e uma média de mais de 16 scans e a profundidade de bits como 8 bits (veja < s Trong &gt; tabela de materiais). Essas configurações devem ser ajustados para cada sistema individual confocal, fonte de laser e tipo de amostra.
	<ol><li>Para o espectro de emissão, coletar os dados usando o modo de lambda e a excitação usando argônio laser conjunto de 488 nm. Recolha de emissão entre 503 e 687 nm usando 22 canais no detector de suspiro 32 canal. Definir o ganho para 755.</li>
		<li>Para conseguir imagens de canal único, use o smart configurar opção. Para FITC (filtro verde), o ganho para 750 e para Alexa 535 (filtro vermelho) definir o ganho de 845.</li>
		<li>Para coletar o espectro de excitação com o laser sintonizável, usar excitação com 1 passos nm entre 490 e 545 nm enquanto coleta de emissões entre 551 e 586 nm. Defina a intensidade do laser para 2% (correspondendo a uma potência média de 30 µW) e o ganho de 774.</li>
		<li>Para coletar Z-pilha no modo espectral, fazer a varredura através da profundidade da seção em passos de 0,96 µm. As mesmas configurações de excitação e emissão como na etapa 3.2.1 podem ser usadas mas definir o ganho a 730.</li>
	</ol></li> <li>FLIM Nota: O microscópio confocal é equipado com uma unidade FLIM (ver Tabela de materiais).
	<ol><li>Configurar os seguintes parâmetros para o microscópio confocal: Pinhole, 20; comprimento de onda de excitação, 490 nm; intensidade do laser, 0,5% (correspondendo a uma potência média de 7.5 µW). Usam lasers pulsados em 40MHz.</li>
		<li>Software em the FLIM, configurar o fóton, contando com mais de 550 nm. Na janela de parâmetros do Display, siga o fóton contando até a contagem de Max é de cerca de 4.000 contagens de fótons.</li>
		<li>Salve o arquivo e exportá-lo como imagem SPC.</li>
		<li>Caber os dados a um decaimento exponencial de 2 componentes no software FLIM. Um ajuste que dá uma χ 2 &#60; 2 é bom. O valor no eixo y é o número da conta para o tempo de vida determinado.</li>
		<li>Selecione um limite para as contagens incluir, por exemplo, 100. Cor código por T1 e selecione o intervalo de tempo de vida. A decadência é dependente da estrutura amiloide onde o hFTAA é limitado. Vidas de fluorescência entre 300 e 1.000 ps têm sido observadas. Salve o arquivo.</li>
		<li>Os dados brutos de exportação usando as opções de exportação e salvar os dados desejados em uma nova pasta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+proteins+and+amyloidosis%3A+chemical+identification+and+clinical+classification+International+Society+of+Amyloidosis+2016+Nomenclature+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines.</a> Amyloid. 23, 209-213 (2016).</li>
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</ol>

PH PN MB SN são acionistas menores em biotecnologia Ebba que comercializa hFTAA sob a marca Amytracker545.

Deposição de proteínas aberrantly dobradas em amiloide é um evento-chave de muitos processos de doença. Placas amiloides extracelulares composta de peptídeos Aβ e neurofibrilares intracelulares formadas por hyperphosphorylated tau são encontradas no cérebro de pacientes da doença de Alzheimer. Uma variedade de proteínas diferentes, por exemplo, transtirretina (TTR), componente do soro amiloide A (SAA) e misfold de cadeia leve de IgG e manifesto como depósitos amiloides nos tecidos fora do SNC. Embora amiloide depósitos foram conhecidos e estudados por mais de um século, ainda falta conhecimento detalhado de como amiloide deposição é iniciada no nível molecular e o que pode ser feito para evitar este processo. Para a doença de Alzheimer, é necessário comprovar como o processo de amiloidose está associado a neurodegeneração. Uma busca de chave na missão de tratar a amiloidose é desenvolver romance aperfeiçoá-lo ferramentas para monitoramento de amiloide iniciação, progressão e regressão; Portanto, detecção de amiloide alvo é chave. A longo prazo, os diagnósticos clínicos irão beneficiar aumentando a sensibilidade e seletividade de amiloide coloração métodos7,15. Desafios atuais a este respeito são tremendos e é uma área de pesquisa muito ativa. Uma questão principal para o desenvolvimento clínico e ensaios é diagnóstico prognóstico. Estas doenças prováveis começam bem antes que os sintomas aparecem, mas começar com tratamento lá deve ser a identificação da doença. Neste documento, a sensibilidade é um aspecto chave para novas metodologias. Além disso, esta questão é ainda mais complexa porque alguns agregados de proteína são tóxicos, alguns são protetores, e alguns são neutros. Daí a capacidade de monitorar morfotipos agregados específicos é essencial, uma vez que a existência de espécies distintas de agregados foi sugerida para explicar o fenótipo heterogêneo, relatado por uma diversidade de DoenÃ § as Neurodegenerativas proteína agregação. Por exemplo, a proteína príon é um exemplo clássico de como uma sequência idêntica primária de aminoácidos pode DCJ em morfotipos agregados distintos, que dão origem a cepas específicas do prião. Polimorfismo de semelhante também foi relatado para o peptídeo Aβ, α-synuclein e tau. A este respeito, LCOs foram mostrados para ser excelentes ferramentas para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos. Proteína príon-cepa-específico agrega, depósitos de proteína encontrados em diversos tipos de amiloidose sistêmica, bem como polimórfico Aβ e agregados de tau distinguiram-se devido o fenômeno óptico conformationally induzido observado a partir do LCOs.
Deposição de amiloide é um evento que ocorre nos tecidos que são difíceis de penetrar com métodos biofísicos ou bioquímicos de precisão molecular. A possibilidade de sonda eventos ex vivo, in vivoe em vitro usando as mesmas moléculas LCO prepara o palco para unraveling eventos que ocorrem na vivo usando técnicas que só são possíveis aplicar em ex vivo ou em Vitro amostras de11,17. Um modelo estrutural recentemente relatada alta resolução mostra que o LCO pentamérica ALCA (pFTAA) liga-se em uma cavidade formada por cadeias laterais alinhadas paralelamente ao eixo de fibrila abrangendo 6 em registro-beta-hiper-velocidade18, demonstrando que é possível obter conhecimento de resolução atômica sobre as entidades do alvo LCO. Em essência, o modo de vinculação cavidade e vinculação de pFTAA é semelhante ao vermelho Congo19, ditada por um sulco forrado com repetitivas positiva carregada Lys cadeias laterais. A afinidade de LCOs parecem ser melhor em comparação com vermelho Congo, provavelmente devido a flexibilidade da cadeia e interações de van der Waals forte dos átomos de enxofre dos anéis tiofeno em direção a cavidade hidrofóbica. A detecção de espécies prefibrillar (antes responde ThT)5,20 aparece dependente folhas β repetitivos, compostas no registro paralelo-beta-vertentes, que para hFTAA, sendo duas unidades de tiofeno mais de pFTAA extensão de cruzamento de até 8 beta-fios.
O protocolo de coloração requer atenção à resolução de problemas para os seguintes passos: (i) fixação: fixação extensa de amostras de tecido pode perturbar a estrutura amiloide e limitar a possibilidade de detectar a variação nos espectros de fluorescência induzidos por conformacional distorção da molécula hFTAA. Fixação suave de cryosections de material fresco congelado é preferida para alcançar ótima resolução espectral. No entanto, hFTAA vai manchar e fluorescem amiloide em tecido fixo mas com eficácia reduzida e menos variação espectral. (ii) o epítopo exposição: pré-tratamento do tecido conseguir epítopo exposição para ligação de anticorpo ocasionalmente pode reduzir a capacidade de hFTAA ligar por causa do interrompido estrutura amiloide. Se este é um problema, e exposição de epítopo é um passo crucial no anticorpo que mancha o protocolo, usando seções consecutivas para anticorpo e hFTAA, respectivamente pode ser considerado. (iii) overstaining: hFTAA é extremamente sensível. Soluções de trabalho devem ser mantidas em concentração baixa nM. Diminua a concentração de hFTAA se a coloração de fundo é um problema. Se elementos que se ligam hFTAA são esparsos no tecido, um excesso de hFTAA pode agregar e acumular-se no meio de montagem. Isto é reconhecido como fluorescência que não consta do plano de foco do tecido em si. Se isto for exibida, mergulhe o slide montado em PBS até a lamínula pode ser deslizada da seção, lave com PBS e remontar com meio de montagem fresco e um novo deslizamento da tampa. (iv) o filtro com base em imagem: Este documento descreve principalmente espectralmente resolvido fluorescência imagem usando filtros de passe longo ou múltiplos canais de deteção. hFTAA também pode ser monitorado usando filtros de passe curto. Esteja ciente de que isso irá reduzir o contraste e abolir as possibilidades de detectar várias cores.
Nos últimos anos tornou-se evidente que como pesquisa ferramentas, LCOs fluorescentes e em particular o hFTAA mostrar propriedades altamente promissoras. Os resultados foram demonstrados para uma vasta variedade de proteínas e Estados de doença, variando de deteção de hFTAA dos agregados no interior das células (tau, miosite corpo de inclusão), amiloidose sistêmica de amiloide soro A, transtirretina, cadeias leves de imunoglobulina (kappa e lambda) seminogelin 1, príon proteína (incluindo amostras clínicas)21, polipeptídeo amiloide ilhéu e insulina7,15. Um fator limitante para a implementação de hFTAA como uma ferramenta de diagnóstico é que a microscopia de fluorescência não é extensivamente usada em laboratórios de patologia amiloide rotina. Além disso, dele não está prontamente disponível na clínica. No entanto, hFTAA coloração amiloide e microscopia de fluorescência têm sido utilizados em laboratórios clínicos em um microscópio de fluorescência com base do filtro e deveser considerado como um método diagnóstico complementar. Isto foi demonstrado recentemente em biópsias do túnel do carpo com amiloidose transtirretina usando as configurações básicas para fluorescência em uma forma automatizada de22.
Além disso, além de várias proteínas, hFTAA fluorescência reconhece uma grande variedade de tipos de fibrila e pre-fibrillar agregados amiloides, por exemplo, espécies fibrillar caminho foram detectados e caracterizadas. Nesta publicação, demonstrámos um Ice em vários tipos de amostra utilizando três técnicas de microscopia. O uso da síntese controlada também permitiu o desenvolvimento de LCOs para versátil deteção de alvos biomolecular, por exemplo, gravação de interações de plasmon de superfície (SPR) de ressonância23 e radioativos por emissão de pósitrons tomografia computadorizada (PET)24.
Até à data, foram publicados mais de 25 diferentes LCOs com. Um aumento da utilização de LCOs para a imagem latente de depósitos amiloides aumentará o conhecimento e a compreensão de como estes agregados associada a doença de montam, desmontagem e interferem com os órgãos e indivíduos em que residem.

Deposição de amiloide nos tecidos é uma característica patológica em um número de doenças como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose sistêmica e doenças de príon. Apesar da prevalência de doenças relacionadas com a amiloide e o fato de que perto de 40 proteínas diferentes até à data foram classificados como precursores amiloides em humano1, pouco se sabe sobre a relação entre a deposição de amiloide e fenótipo da doença. Histologia das amostras dos pacientes humanos tem sido usado tanto para fins de diagnósticos e científicos. Um grande número de modelos animais foram criado para investigar a correlação entre carga amiloide e comportamento, esperança de vida e um número de outro ler fenotípico outs de progressão de doença,2,3. Grandes esforços estão sendo feitos também na descoberta de medicamentos e design para combater alguns dos nossas mais temidas doenças generalizadas. No entanto, a avaliação da conexão entre genótipo, fenótipo, carga de placa amiloide e administração de droga não é para a frente. As ferramentas para imagem de amiloide nos tecidos e coloração são muitas vezes rude e fornecem informações de baixa resolução sobre estrutura e formação de amiloide.
Vermelho Congo birrefringência, ThT e ThS fluorescência são exemplos de métodos clássicos para detectar e analisar carga amiloide em amostras de tecido da pacientes biópsias e post mortem amostras e modelos animais de doença4. Estas técnicas têm sido usadas por várias décadas (vermelho de Congo desde a década de 1920 e ThT e derivados desde a década de 1960), e apesar de instrumentação tem sido aperfeiçoada e permite a análise detalhada, os procedimentos de coloração e análise ainda estão sendo realizadas da mesma forma como há quase um século.
Neste trabalho, descrevemos a utilização de um corante de amiloide romance altamente sensível, hFTAA5, que permite a deteção dos depósitos de proteína imatura pequena com alta precisão, bem como a detecção de amiloide maduro. Em comparação com corantes convencionais, hFTAA tem sido comprovada detectar uma gama maior de doença associados agregados de proteína a5,6,7. Além disso, hFTAA também pode ser aplicado para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos8. Aqui, descrevemos a coloração hFTAA e análise de tecido do estabelecido modelos animais da doença de Creutzfeld-Jacob e proteína de Precursor da β-amiloide (APP) ratos transgénicos projetado para imitar o desenvolvimento da placa na doença de Alzheimer9,10 . Mostramos também a análise de diagnóstico e post mortem amostras de pacientes que sofrem de amiloidose sistêmica. Os LCOs têm propriedades intrínsecas que permite fazer um relatório sobre as diferenças conformacionais dentro de uma placa; e combinando dois LCOs com propriedades diferentes em matéria de vinculação e fluorescência, a diferença é ainda mais pronunciada11. Um microscópio de epifluorescência equipados com filtros de passe longo e uma cabeça de câmara hiperespectrais é usada para ativar a classificação objectiva das propriedades espectrais e gravação de micrografias para análise espectral. Microscopia de fluorescência confocal com um laser sintonizável como a fonte de excitação é usada para avaliar as propriedades tridimensionais de uma placa amiloide em maior detalhe. O laser sintonizável habilita a coleção do espectro de excitação e um passo menos seleção de comprimentos de onda de emissão no microscópio co imagens de fluorescência LCO e imunofluorescência para determinar a localização co da proteina alvo e amiloide. FLIM oferece uma sensibilidade sem precedentes para diferenças conformacionais impostas as LCOs e revela diferenças que não podem ser detectadas em espectros de emissão de fluorescência.
Os principais objetivos com o método de coloração descrito são para facilitar a detecção sensível de pequenos depósitos amiloides e caracterizar o polimorfismo conformacional dentro depósitos amiloides. Este conhecimento é importante para a compreensão básica das doenças de agregação da proteína.

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako meio de montagem de fluorescene</td><td>Agilent technologies</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>LeicaDM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Spectraview</td><td>Imagem</td><td></td><td></td>espectral ASI</tr><tr><td>Software Spectraview Imagem</td><td></td> <td>espectral ASI</td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2010b v6.0 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM sistema</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Sintonizável em Sintonia</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de tecidos amiloides manchado com luminescent oligothiophenes conjugados por hiperespectrais confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

As proteínas que o depositam de amiloide nos tecidos por todo o corpo podem ser a causa ou a consequência de um grande número de doenças. Entre estas encontramos doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson doença afecta principalmente o sistema nervoso central e amiloidose sistêmica onde amiloide soro A, transtirretina e cadeias leves de IgG depositam como amiloide no fígado, do carpo túnel, baço, rins, coração e outros tecidos periféricos. Amiloide tem sido conhecido e estudado por mais de um século, muitas vezes utilizando corantes específicos amiloides como vermelho Congo e Thioflavin T (ThT) ou Thioflavin (ThS). Neste trabalho, apresentamos heptamer-formil ácido acético de tiofeno (hFTAA) como um exemplo de recentemente desenvolvidos complementa estes corantes chamado luminescent oligothiophenes conjugados (LCOs). hFTAA é fácil de usar e é compatível com coloração co na imunofluorescência ou com outros marcadores celulares. Pesquisa extensiva provou que hFTAA detecta uma ampla gama de agregados de proteínas de doença associada que corantes convencionais de amiloide. Além disso, hFTAA também pode ser aplicado para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos para permitir estudos de polimorfismo fibrila amiloide. Enquanto a metodologia de imagem aplicada é opcional, nós aqui demonstrar imagens hiperespectrais (HIS), microscopia confocal e imagem latente (FLIM) tempo de vida de fluorescência a laser. Estes exemplos mostram algumas das técnicas de imagem onde LCOs podem ser usados como ferramentas para adquirir conhecimento mais detalhado da formação e propriedades estruturais de amiloides. É uma limitação importante à técnica, quanto a todas as técnicas de microscopia óptica convencional, a exigência de tamanho microscópico de agregados para permitir a detecção. Além disso, o agregado deve incluir uma estrutura repetitiva de β-folha para permitir a ligação de hFTAA. Exposição excessiva de fixação e/ou epítopo que modificam a estrutura agregada ou conformação pode processar pobre hFTAA vinculação e, portanto, apresentam limitações a imagem exata.

Sensível e seletiva dos depósitos amiloides de um grande número de proteínas em muitos tipos de tecido diferentes de pacientes humanos e animais experimentais coloração é vital para diagnósticos clínicos, bem como na investigação científica. Neste artigo, demonstramos como isto pode ser conseguido usando LCOs, exemplificados pela hFTAA, para coloração e imagiologia multimodal de amiloide a partir de uma seleção de tipos de tecido. Desde a primeira publicação de tiofeno com base em ligantes amiloide há mais de dez anos13, amiloide depósitos compostos de uma vasta gama de proteínas em uma variedade de tecidos têm sido fotografados usando LCOs6,7,11, 14,15,16 (Figura 1). Em combinação com anticorpos ou outros marcadores histológicos, os LCOs fornecem excelentes ferramentas para fins de diagnósticos e científicos (Figura 1a, Figura 2). Com uma seleção apropriada dos marcadores fluorescentes, vários fluorophores pode ser fotografadas na mesma seção (Figura 1a, hFTAA e DAPI, Figura 2a hFTAA na configuração de imunofluorescência). Também é possível usar seções consecutivas para coloração usando brightfield e fluorescência (Figura 2b, hFTAA e mancha do anticorpo DAB). Recentemente, hFTAA tem sido provado para ser um complemento altamente promissor para o vermelho de Congo coloração em diagnósticos clínicos7,15 (Figura 3).
Desenvolvimento de técnicas de imagem nas últimas décadas tem aumentado a necessidade de amiloides corantes que pode discriminar entre o minuto, mas para as mesmo tempo profundas as diferenças em depósitos amiloides de forma quantitativa. O sistema conjugado dentro o LCO fornece-o com uma capacidade única de um relatório sobre a variação em seu modo de vinculação. Torção da molécula pode conduzir a distorções nos ângulos de ligação no sistema conjugado e impedir o transporte de elétrons (figura 4a). Isto por sua vez reflete sobre as propriedades fluorescentes do LCO no comprimento de onda de excitação e emissão e na vida de emissão. Nós usamos dele em um microscópio de fluorescência vertical equipado com filtros de passe longo para emissão. Para excitação e espectros de emissão em microscopia confocal e FLIM, usamos um LSM780 com laser pulsado. Para exemplificar as técnicas diferentes, fotografaram um objeto (a beta amiloide (Aβ) placa bacteriana em um rato transgénico APP) (figura 4b–e). Hiperespectral espectros de fluorescência (figura 4b) permite a avaliação dos deslocamentos espectrais e variação de intensidade dentro de diferentes regiões da placa. Espectro de excitação em microscopia confocal (Figura 4C) pode ser usado para determinar o comprimento de onda de excitação ideal para experimentos a jusante, por exemplo, combinação de coloração com vários fluorophores. Esse método também pode ser útil para a deteção das diferenças conformacionais no modo de ligação do LCO. Espectro de emissão no modo confocal pode ser usado para determinar as propriedades de emissão de fluorescência do hFTAA ou de uma combinação de vários fluorophores avaliar colocalization em experimentos de combinação com vários LCOs ou LCO e imunofluorescência combinações. O tempo de vida de fluorescência de hFTAA é altamente influenciado por pequenas variações no modo de ligação do hFTAA. Portanto, FLIM é uma ferramenta poderosa em discriminar entre as diferenças hFTAA são impostas pelo destino de vinculação (Figura 4D). Isso pode ser usado por exemplo na discriminação entre prião diferentes cepas8. Imagem latente confocal e transformação Z-pilhas em imagens tridimensionais são uma ferramenta útil para explorar a forma geral de um agregado de amiloide (Figura 4e). Novamente, o uso de fluorophores adicionais pode auxiliar na compreensão da composição de um depósito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg"> 
Figura 1: vários tecidos tipos e proteínas agregados mostrando h-ALCA coloração de: (a) Mallory-Denk corpos consistindo de agregados de queratina em um fígado (counterstained com DAPI), inclusões de r p62-positivo (b) em esporádicos inclusão-corpo miosite (s-IBM) tecido muscular, (c) Amyloid do polypeptide amiloide do Ilhéu no pâncreas humano, cérebro (d) cadeia leve Amyloid de imunoglobulina no intestino humano, tremor epizoótico (e), ovinos (priões) no mouse, (f ) Chronic desperdiçar doença (priões) em cérebro de rato, (g) Aβ placas no cérebro de rato APP23, (h) Aβ patologia no cérebro de rato APP/PS1 e biópsia (eu) gordura esfregaços de amostras de diagnósticos da transtirretina amiloide em pacientes humanos classificados de acordo com o padrão vermelho Congo (CR) de Pontuação de 1-4. Áreas amarelas mostram hFTAA manchado depósitos amiloides e autofluorescência do tecido adiposo é azul. O comprimento da barra de escala é especificado em cada painel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg"> 
Figura 2: exemplos de co coloração com anticorpos. (um) co coloração com imunofluorescência de antiproteína soro amiloide A (AA) e hFTAA de humano amiloide AA na mesma seção. Superior esquerdo: AA anticorpo emissão 640 nm; superior direito hFTAA em 488 nm; decalque do painel de fundo colocalization de exibição de imagem em amarelo. (b) Anticorpo fluorescência de coloração e hFTAA em seções consecutivas. Painel superior: AA anticorpo DAB coloração, painel de fundo: hFTAA fotografada com um filtro de emissão longpass. Barra de escala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg"> 
Figura 3: Comparando a fluorescência com filtros de passe curto na transtirretina amiloide no coração humano manchada com Mayer hematoxilina/Congo Vermelho (um–d) e a hematoxilina de Mayer/hFTAA (e). (um) Brightfield imagem, (b) Brightfield, fluorescência, (c) Brightfield + polarizadores cruzados, (d) Brightfield + fluorescência + polarizadores cruzados, (e) hFTAA de fluorescência em 405nm + 480 excitação nm (seções consecutivas a um–d). Barra de escala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg"> 
Figura 4: O mesmo objeto manchado com hFTAA e fotografada com várias técnicas é demonstrado usando uma placa Aβ em um rato APP23 envelhecido. (um) a fluorescência Propriedades de hFTAA é ditada pelo seu estado conformacional. Estrutura de hFTAA no estado planar e torcido é mostrada. (b) Hyperspectral imaging para avaliação do espectro de emissão contínuo. Espectros no painel inferior são cor codificada de acordo com o box regiões de interesse na imagem. (c) (i) Confocal de imagem para imagem de excitação e espectro (ii e iii) e imagem da emissão em modo de filtro ou (iv) espectral. (d), fluorescência imagem de tempo de vida para a deteção das diferenças conformacionais no amiloide, onde encontram-se na periferia da placa Aβ menor vida útil e os tempos de vida são mais longos no centro da placa. Histograma no painel inferior mostra a distribuição de tempos de vida para a placa inteira. A imagem é colorida de acordo com a escala abaixo do histograma. (e) Z-pilha Confocal coletados no modo de filtro para exibir a estrutura tridimensional de objetos. O comprimento da barra de escala é especificado em cada painel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Deposição de amiloide é uma marca registrada de diferentes doenças e aflige muitos órgãos diferentes. Este artigo descreve a aplicação da fluorescência luminescent oligothiophene conjugados coloração em combinação com técnicas de microscopia de fluorescência. Este método de coloração representa uma poderosa ferramenta para detecção e exploração de agregados de proteínas em configurações clínicas e científicas.

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

O objetivo geral deste método é a detecção de depósitos de agregados proteicos em ambientes clínicos e científicos. Descreve-se a coloração com ácido heptaformil tiofeno acético e a análise de tecidos de modelos animais de doenças priônicas e de Alzheimer. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área dos amiloides, como a presença de pequenas quantidades de agregados proteicos e suas variações conformacionais intrínsecas.A vantagem desta técnica é que ela é mais seletiva e mais sensível do que outras técnicas convencionais. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de diversas doenças por desdobramento incorreto de proteínas, devido à possibilidade de adaptar as sondas para a técnica de visualização desejada. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque o hFTAA exige uma concentração de coloração tão baixa.O HFTAA também exibe um comprimento de onda de excitação e emissão mais longo em comparação com corantes convencionais. Prepare a solução do oligotiofeno conjugado luminescente ressuspendendo o hFTAA liofilizado em hidróxido de sódio dois milimolar para obter uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Transfira a solução estoque para um frasco de vidro e armazene a quatro graus Celsius.Se forem utilizadas seções em parafina fixadas em formalina, desparafinize em xilol durante a noite. No dia da coloração, imerja as seções em banhos consecutivos de etanol 99%, etanol 70%, dH2O e PBS por dez minutos cada vez. Em seguida, deixe as seções de tecido secarem em condições ambientes.Enquanto o tecido seca, prepare uma solução de trabalho de hFTAA diluindo o estoque em uma proporção de 1 para 10.000 em PBS. Quando o tecido estiver seco, adicione gotas da solução de trabalho de hFTAA em cada seção do tecido para cobri-la. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente.Lave a solução de coloração com 500 microlitros de PBS e, em seguida, imerja a lâmina no banho de PBS por 10 minutos. Após deixar a seção secar em condições ambientes, monte-a usando meio de montagem fluorescente. Deixe o meio de montagem acomodar durante a noite.A detecção de amiloides pode ser realizada diretamente após o acondicionamento ou mesmo sem acondicionamento. No entanto, se o objetivo do experimento for coletar informações espectrais de alta qualidade, é preferível uma incubação durante a noite. Abra o software do microscópio, nomeie o projeto, selecione a imagem espectral e inicie a aquisição.Selecione o objeto de interesse através da ocular usando o filtro de excitação de 436 nanômetros e redirecione o trajeto da luz para a câmera. No gerenciador de dados, selecione o tipo de amostra espectral, rotule a amostra e pressione adquirir. A janela de aquisição será aberta.Na imagem espectral, abra o menu de configurações, selecione as propriedades de aquisição e defina a faixa espectral de 460 a 700, a qualidade de velocidade na velocidade máxima e o tipo de medição em filtros estreitos a laser a gás. Feche a caixa de diálogo. No menu de imagem, selecione visualização completa ao vivo.Na barra de ícones, desative as franjas. Selecione uma região para imagem e certifique-se de que o valor máximo de memória esteja abaixo de 800 megabytes. Ajuste o tempo de exposição para um valor que forneça um brilho total da imagem entre 1.000 e 3.000.Na barra de ícones, pressione a câmera colorida. A aquisição será iniciada. Quando a aquisição da imagem for concluída, pressione salvar na caixa de diálogo de aquisição de imagem espectral e nova célula na caixa de diálogo do gerenciador de dados de caso.No gerenciador de dados do caso, abra a imagem coletada usando o botão iniciar análise. A janela de análise de dados será aberta. Informações espectrais podem ser coletadas de cada pixel da imagem mediante a seleção de ROI usando a caixa de diálogo de exibição espectral.Escolha definir e selecione as ROI a partir das áreas relevantes da imagem. Salve os dados espectrais como um arquivo de texto usando o botão Lib. O arquivo txt salvo pode ser importado para qualquer software de análise de sua escolha.Abra o software do microscópio e comece configurando o microscópio confocal. Ajuste a intensidade do laser para 0,2%, o pinhole para uma unidade Airy, o tamanho do quadro para 1.024 por 1.024 pixels, a velocidade de varredura para sete com média em 16 varreduras e a profundidade de bits para oito bits. Para coletar o espectro de emissão, selecione o modo lambda e o laser de argônio ajustado para 488 nanômetros.Colete a emissão entre 499 e 691 nanômetros utilizando 22 canais no detector gasp de 32 canais. Ajuste o ganho para 755. Clique no botão live e altere a paleta para indicador de faixa, ajustando o ganho para permitir pixels não sobrecarregados na cor vermelha.Clique no botão de parada e, em seguida, capture a imagem usando o botão de captura. Para obter imagens de canal único, selecione a opção de configuração rápida. Selecione FITC e Alexa 532.Selecione a separação linear e aplique. Ajuste o ganho para permitir pixels não sobrecarregados. Para FITC, defina o ganho em 693, e para Alexa 532, defina o ganho em 433 durante o modo ao vivo.Clique no botão de parada e, em seguida, capture a imagem usando o botão de captura. Altere o microscópio para o modo FLIM. Ajuste o pinhole para 20, o comprimento de onda de excitação para 490 nanômetros e a intensidade do laser para 0,5%. Utilize lasers pulsados em 40 megahertz.No software FLIM, configure a contagem de fótons acima de 550 nanômetros. Na janela de parâmetros de exibição, acompanhe a contagem de fótons até que a contagem máxima esteja em torno de 4.000 contagens de fótons. Salve o arquivo e exporte-o como imagem SPC.Esta imagem mostra corpos de Mallory-Denk, constituídos por agregados de queratina em hepatócitos hepáticos, contra-colorados com DAPI. Aqui, inclusões positivas para P62 são mostradas em tecido muscular esquelético de miosite por corpos de inclusão esporádica. Esta imagem mostra uma inclusão amiloide do polipeptídeo amiloide de ilhotas no pâncreas humano.Um depósito de cadeia leve de imunoglobulina amiloide no intestino humano é mostrado aqui. Esta imagem mostra depósitos de agregados da proteína priónica da scrapie ovina no cérebro de camundongo. Agregados da proteína priónica no cérebro de um camundongo infectado com doença crônica de emagrecimento são mostrados aqui.Esta imagem mostra placas de amiloide A-beta no cérebro de camundongo APP23. E esta imagem mostra a patologia de A-beta no cérebro de camundongo APP-PS1. Essas esfregaços de biópsia de gordura de amostras diagnósticas de amiloidose transtirretina em pacientes humanos classificadas de um a quatro de acordo com a pontuação padrão do vermelho Congo.As áreas amarelas mostram depósitos de amiloide de transtirretina corados com hFTAA, e o azul é a autofluorescência do tecido adiposo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de realizar a coloração em concentração adequadamente baixa. Lembre-se também de usar filtros de longa passagem para obter o máximo de contraste e evitar a autofluorescência e a fluorescência de fundo.Após este procedimento, outros métodos como imunofluorescência podem ser realizados para identificar a proteína agregada e identificar proteínas coagregadas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de amiloidose explorarem estruturas de agregados proteicos e para a química orgânica projetar novas sondas para esses alvos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a coloração com LCO e obter imagens utilizando diferentes técnicas.

imaging-amyloid-tissues-stained-with-luminescent-conjugated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve uma técnica para corar amilóides em seções de tecido usando um corante oligotiofeno conjugado luminescente - ácido heptamer-formil tiofeno acético ou hFTAA - para imagens de fluorescência. Os amilóides são agregados de proteínas anormais ricos em β folhas. Sua detecção em amostras de tecido é útil no diagnóstico e tratamento de doenças associadas à amilóide ou proteinopatias.

Coloração hFTAA de depósitos amilóides: uma técnica para visualizar fibrilas amilóides usando corante à base de oligotiofeno para imagens de fluorescência em seções de tecido

Fonte: Nyström, S., et al., Imagem de tecidos amilóides corados com oligotiofenos conjugados luminescentes por microscopia confocal hiperespectral e imagem de tempo de vida de fluorescência. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra a análise de estruturas amilóides com microscopia de imagem de fluorescência ou FLIM, usando corante hFTAA para revelar núcleos compactos como azul/verde e periferias instáveis como vermelho/amarelo em imagens codificadas por cores, refletindo a organização amilóide.

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Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Aprenda a técnica de coloração com hFTAA para detecção de agregados proteicos em amostras de tecido usando microscopia de fluorescência. Este método oferece maior sensibilidade e seletividade para estudos de doenças amiloides.

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia (Vídeo) | JoVE Journal

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

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