Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana
24 de janeiro de 2018
Este protocolo descreve um romance tridimensional em vitro modelo, onde as células do estroma corneana e diferenciada de células neuronais são cultivadas juntos para ajudar na análise e compreensão das interações dos tipos de célula de dois.
O objetivo geral deste protocolo é investigar as interações celulares entre as células estromais da córnea humana e as células neuronais em sua matriz extracelular natural. O protocolo pode ser expandido para estudar doenças e distrofias da córnea, como ceratocone, ceratopatia diabética e distrofia de Fuchs. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia da córnea humana, identificando os mecanismos subjacentes e defeitos nas interações nervosas do estroma durante uma doença ou distrofia específica da córnea.
A principal vantagem dessa técnica é que as células podem secretar sua própria matriz extracelular in vitro, que fornece um modelo melhor e mais preciso do tecido corneano humano real in vivo. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças da córnea, porque a avaliação das interações célula-célula e matriz extracelular celular garantirá uma representação precisa do tecido da córnea e permitirá o desenvolvimento de medicamentos mais direcionados. Agora, esse método pode fornecer informações sobre danos e regeneração do nervo corneano.
Também pode ser aplicado a outros sistemas, como triagem e desenvolvimento de medicamentos. Após o recebimento de amostras de tecido da córnea humana, transfira os tecidos para um prato de 21,5 centímetros quadrados contendo dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco. Posicione a cúpula da córnea voltada para cima e use uma lâmina de barbear em um ângulo de 45 graus para raspar a camada epitelial.
Em seguida, vire a cúpula da córnea para baixo e raspe completamente o endotélio do estroma. Lave o tecido estromal com DPBS. Mantenha os pedaços estromais úmidos com DPBS e use uma lâmina cirúrgica número 10 para cortar os tecidos estromais em pedaços pequenos.
Use uma pinça estéril para transferir os pedaços estromais para um frasco de cultura T25 sem meio. Deixe os explantes aderirem ao fundo do frasco a 37 graus Celsius por cerca de 30 a 40 minutos. Depois de cortar com precisão o tecido estromal, transfira cuidadosamente o frasco para a incubadora.
É importante permitir de 30 a 40 minutos e, em seguida, adicionar mídia lentamente. Esta etapa é fundamental para permitir a aderência completa dos explantes e evitar seu desprendimento. Uma vez aderido, adicione lentamente o Meio Essencial Mínimo de Eagle, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% antibiótico-antimicótico ao frasco, sem perturbar os explantes.
Coloque suavemente o frasco na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Deixar os explantes intactos até que as células comecem a isolar-se e a migrar para o frasco. Após aproximadamente duas a quatro semanas, as células devem atingir 100% de confluência.
Após 100% de confluência, passe as células removendo o meio de cultura de tecidos e lavando as células com DPBS. Adicione tripsina às células e incube a 37 graus Celsius. Após aproximadamente cinco minutos, observe as células sob uma microscopia de luz para confirmar se elas se separaram.
Interrompa a proteólise adicionando meio fresco e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 1000 x g para pellet as células. Remover o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o sedimento, e suspender as células em meio fresco.
Depois de realizar uma contagem de células, semeie aproximadamente uma vez 10 para as seis células no frasco de cultura T75 com meio fresco para expansão adicional. Para montar a construção 3D, primeiro passe e conte os fibroblastos da córnea humana e, em seguida, semeie aproximadamente uma vez 10 para os seis HCF em uma inserção de membrana de policarbonato com poros de 0,4 mícron. Adicione 1,5 mililitros de meio fresco ao topo da construção.
Em seguida, pipete mais 1,5 mililitros do mesmo meio para a parte inferior de cada construção. Após 24 horas, adicione 1,5 mililitros de meio, suplementado com 0,5 milimolar de vitamina C na parte superior e inferior de cada construção. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três semanas, adicionando meios frescos contendo vitamina C em dias alternados.
Isso estimulará as células a secretar e montar sua própria matriz extracelular. Após três semanas, adicione oito vezes 10 às terceiras células de neuroblastoma humano SH-SY5Y no topo das construções 3D previamente montadas. É fundamental calcular o número exato de células nesta etapa e aguardar 24 horas antes de iniciar a diferenciação celular.
Após 24 horas de incubação, inicie a diferenciação celular SH-SY5Y estimulando as células com 1,5 mililitros de EMEM com 10% de FBS e 10 micromolares de ácido retinóico. Em seguida, adicione 1,5 mililitros do meio contendo vitamina C na parte inferior da construção. O ácido retinóico é sensível à luz, portanto, esta etapa deve ser realizada no escuro.
Após cinco dias, quando as células atingirem a fase de diferenciação, adicione 1,5 mililitros de meio livre de soro contendo dois BDNF nanomolar e 1% antibiótico-antimicótico ao topo da construção. Adicione meio suplementado com vitamina C fresco na parte inferior da construção. Cultive as células por mais dois dias antes do processamento para análise posterior.
Esta é uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão de alta ampliação da construção 3D auto-montada mostrando a membrana de policarbonato e as células estromais da córnea assentadas no topo. Esta imagem mostra as células neuronais diferenciadas assentadas no topo, que exibem um arranjo de células estromal-neuronais. As setas na imagem mostram as células neuronais.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o tecido da córnea úmido o tempo todo, ao cortar explantes, e manter os instrumentos cirúrgicos e as lâminas estéreis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e usar este modelo in vitro para investigar as interações celulares entre as células estromais da córnea humana e as células neuronais em sua matriz extracelular natural. Não se esqueça de que trabalhar com BDNF, ácido retinóico e lâminas cirúrgicas pode ser extremamente perigoso, e precauções, como usar roupas de proteção adequadas, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um novo modelo tridimensional in vitro, no qual células estromais da córnea e células neuronais diferenciadas são cultivadas em conjunto, auxiliando na análise e compreensão das interações entre os dois tipos celulares. Este método pode fornecer informações sobre lesão e regeneração dos nervos corneanos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Corneana
Contexto
- O estudo concentra-se nas interações celulares na córnea humana.
- Doenças e distrofias corneanas, como ceratocone e ceratopatia diabética, são de interesse particular.
- Compreender as interações entre estroma e nervos é essencial para abordar condições corneanas.
- A matriz extracelular desempenha um papel significativo no comportamento celular.
Objetivo do Estudo
- Investigar as interações entre células estromais da córnea e células neuronais.
- Identificar mecanismos e defeitos nas interações nervosas durante doenças da córnea.
- Ampliar o entendimento da biologia da córnea.
Métodos Utilizados
- Modelo de cultura in vitro tridimensional.
- Cocultivo de células estromais corneanas e neuronais.
- Avaliação das interações célula-célula e célula-matriz extracelular.
- Avaliação das respostas celulares em um ambiente natural de matriz extracelular.
Resultados Principais
- O modelo permite a secreção de uma matriz extracelular autêntica.
- Obteve-se compreensão sobre os danos e a regeneração dos nervos corneanos.
- A técnica auxilia no desenvolvimento direcionado de fármacos para doenças corneanas.
- Questões fundamentais da biologia corneana foram abordadas por meio deste método.
Conclusões
- Este modelo inovador fornece uma representação mais precisa do tecido corneano humano.
- Ele tem implicações para a terapia em doenças da córnea.
- Pesquisas futuras podem ampliar o entendimento das interações dos nervos corneanos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo tridimensional in vitro atende à necessidade de sistemas corneanos humanos fisiologicamente relevantes na fase inicial de descoberta, permitindo a investigação mecanicista das interações estroma-nervo em doenças corneanas. Ao recapitular a deposição da matriz extracelular nativa e o cultivo conjunto de células estromais e neuronais, o modelo apoia a validação de alvos e a redução de riscos de hipóteses terapêuticas antes dos testes em animais. Ele fornece uma plataforma escalável e reprodutível para avaliar os efeitos de compostos sobre a integridade e regeneração dos nervos corneanos, alinhando-se aos esforços da indústria para reduzir a dependência de modelos in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a comunicação entre estroma e nervos no tecido corneano humano, esclarecendo mecanismos patogênicos em doenças como ceratocone e ceratopatia diabética.
- Valor Operacional: Oferece um sistema relevante para humanos para validar alvos envolvidos em vias de dano e regeneração nervosa.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao modelar interações celulares relevantes para doenças em um contexto definido de matriz extracelular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas sobre diferenciação neuronal, morfologia de células estromais e montagem da matriz extracelular sob exposição ao composto em teste.
- Valor Operacional: O formato padronizado do constructo 3D permite plaqueamento, dosagem e leitura reprodutíveis em campanhas de triagem.
- Prontidão do Ensaio: Permite avaliação de média escala de agentes neuroprotetores, neuroregenerativos ou antifibróticos em um microambiente corneano humano.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao manter fenótipos celulares humanos e composição da matriz relevantes para as distrofias corneanas.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação precoce dos efeitos de compostos sobre a integridade estromal-nervosa, orientando decisões de prosseguimento ou interrupção antes de estudos de eficácia in vivo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a correlação entre leituras funcionais (por exemplo, crescimento de neuritos, deposição de matriz) e o potencial de modificação da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a otimização de compostos líderes, fornecendo um sistema de co-cultivo estromal-nervoso relevante para humanos antes da validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de sinalização estroma-nervo em modelos de doenças corneanas.
- Triagem: Permite a obtenção de construtos tridimensionais prontos para ensaios, adequados para triagem de compostos com leituras dependentes da matriz extracelular.
- Análises: Gera dados quantitativos de imagem e saídas bioquímicas (por exemplo, alinhamento celular, marcadores de diferenciação, deposição de matriz) para comparar condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Mantém fenótipos humanos de fibroblastos corneanos e neurônios diferenciados, apoiando a continuidade até testes pré-clínicos de eficácia.
- Reutilização Empresarial: A plataforma pode ser adaptada a diferentes modelos de doenças corneanas e classes de compostos, reduzindo esforços de re-desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicista de hipóteses sobre interações estroma-nervo na fisiopatologia corneana.
- Valor Operacional: Protocolo padronizado para montagem de tecidos tridimensionais, co-cultivo e diferenciação, que favorece a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões iniciais de prosseguimento ou interrupção do desenvolvimento ao prever os efeitos de compostos na integridade dos nervos corneanos humanos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a terapias corneanas com base em dados relevantes para interações nervosas humanas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias, engenharia de tecidos tridimensionais e diferenciação neuronal.
- Depende de infraestrutura estéril para cultura celular, incubadores e microscopia para avaliação dos constructos.
- Necessita padronização do isolamento de explantes estromais, expansão de fibroblastos e do tempo de diferenciação de SH-SY5Y.
- A adaptação a outros tipos celulares neuronais ou gliais pode exigir otimização dos fatores de diferenciação.
- A linha do tempo de maturação do constructo (5 ou mais semanas) exige planejamento para janelas de ensaio de longo prazo.
