Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama
13 de setembro de 2017
Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.
O objetivo geral deste modelo pré-clínico humano in vitro de osteoclastogênese derivado de monócitos do sangue periférico, ou PBMCs, cultivados com linhagens celulares de câncer de mama é imitar as interações dos osteoclastos das células cancerígenas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase óssea sobre os efeitos da interação entre células cancerígenas e células ósseas no microambiente ósseo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um modelo pré-clínico totalmente humano.
Além disso, este método pode fornecer informações sobre metástases ósseas. Também pode ser aplicado ao estudo de outros mecanismos patológicos relacionados ao osso, como a osteoporose. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido à variabilidade entre doadores saudáveis e na seleção da densidade celular PBMC apropriada.
A demonstração visual desse método é crítica, pois eles precisam ver que nossas etapas de seleção e semeadura do PBMC exigem alguma experiência manual antes que a proficiência possa ser alcançada. Comece diluindo pelo menos 20 mililitros de sangue total de doadores saudáveis em EDTA na proporção de um para um em PBS. Depois de misturar bem, divida a solução sanguínea em alíquotas de 30 mililitros em tubos cônicos de 50 mililitros.
Espalhe cuidadosamente 15 mililitros de meio de separação de linfócitos no fundo de cada tubo. Separar as células por centrifugação por gradiente de densidade. E puxe a célula mononuclear branca contendo camadas amareladas em um novo tubo de 15 mililitros.
Lave as células colhidas duas vezes em 20 mililitros de PBS por lavagem, seguida de lise dos glóbulos vermelhos com cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por três a cinco minutos, no gelo. Pare a reação com 20 mililitros de PBS e colete os glóbulos brancos por centrifugação. Ressuspenda o pellet e complete alfa MEM para contagem.
Em seguida, coloque as células em uma concentração de sete pontos cinco vezes 10 elevado a cinco PBMC por centímetro quadrado em cada poço de uma placa de 24 poços para sua incubação a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. Após cerca de três horas, remova o sobrenadante, detritos, células soltas e eritrócitos não lisados das culturas. E adicione meio fresco, complementado com MCSF.
Quatorze dias após a semeadura, lave as células duas vezes com PBS e fixe-as em paraformaldeído a quatro por cento por 20 minutos em temperatura ambiente. Execute a coloração do purgador de acordo com as instruções do fabricante. As células semelhantes a osteoclastos serão positivas para TRAP com pelo menos quatro núcleos.
Conte as células semelhantes a osteoclastos manualmente sob o microscópio com uma ampliação de 10X. Para a diferenciação de osteoclastos induzida por células cancerígenas, quando as células cancerígenas atingem noventa por cento de confluência, elas são destacadas por tripsinização e semeadas em inserções de poros de quatro micrômetros de ponto zero em uma concentração de quatro vezes 10 a três células por centímetro quadrado em alfa MEM fresco. No dia seguinte, coloque as inserções semeadas sobre culturas de células mononucleares indiferenciadas de um dia em alfa MEM completo e troque o meio a cada dois ou três dias.
Em seguida, 11 dias após o início da cocultura, transferir as inserções para uma nova placa contendo o reagente apropriado para a análise a jusante desejada. As células de câncer de mama podem sustentar a osteoclastogênese, pois o número de osteoclastos nos poços induzidos por células cancerígenas é semelhante ao obtido nos poços de controle do fator de crescimento positivo. O número de osteoclastos observados em todas as culturas é reduzido, no entanto, quando as células são tratadas com uma droga antitumoral.
Curiosamente, as áreas de superfície dos osteoclastos maduros derivados de fatores de crescimento são maiores do que as induzidas por células cancerígenas. Este efeito não é observado em culturas tratadas com drogas antitumorais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em sete e oito horas se for executada corretamente.
Após este procedimento, análises adicionais a jusante podem ser realizadas como análise de expressão gênica, Western Blot, análise de imunofluorescência ou ELISA para responder a perguntas adicionais sobre interações entre células cancerígenas / células ósseas ou sobre mecanismos de drogas antitumorais. Após o seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de metástases ósseas estudarem o microambiente ósseo, em modelo pré-clínico totalmente humano. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como co-cultivar monócitos, sofrer diferenciação com células cancerígenas.
Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas e medicamentos pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de luvas e jalecos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo pré-clínico humano in vitro de osteoclastogênese a partir de monócitos de sangue periférico cultivados com linhagens celulares de câncer de mama para imitar a interação entre célula cancerígena e osteoclasto. Este modelo pode ajudar a responder questões-chave sobre metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Osteoclastogênese
- Metástase óssea
- Interações entre células cancerígenas
Fundamentos
- O modelo utiliza monócitos de sangue periférico (PBMCs).
- Tem como objetivo replicar as interações entre células cancerígenas e osteoclastos.
- Esta pesquisa é significativa para compreender patologias relacionadas aos ossos.
- A variabilidade entre doadores saudáveis pode afetar os resultados.
Objetivo do Estudo
- Imitar as interações entre células cancerígenas e osteoclastos.
- Investigar os efeitos dessas interações no microambiente ósseo.
- Fornecer insights sobre metástase óssea e condições relacionadas.
Métodos Utilizados
- Cultivo de PBMCs com linhagens celulares de câncer de mama.
- Avaliação da osteoclastogênese.
- Avaliação das interações entre células cancerígenas e células ósseas.
- Análise da variabilidade na densidade celular de PBMCs.
Principais Resultados
- O modelo imita com sucesso as interações entre células cancerígenas e osteoclastos.
- Os insights obtidos podem informar estratégias terapêuticas para metástase óssea.
- As potenciais aplicações se estendem a outras doenças relacionadas aos ossos.
- Os desafios incluem a variabilidade entre doadores e a seleção da densidade celular.
Conclusões
- Este modelo pré-clínico humano é valioso para estudar a metástase óssea.
- Ele aumenta a compreensão das interações entre células cancerígenas no microambiente ósseo.
- Estudos futuros podem aproveitar este modelo para aplicações mais amplas na patologia óssea.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
