Name: Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a manipular G-quadruplexes em nível de única molécula usando pinça magnética. Este método permite medir a dinâmica de dobramento e a regulação por proteínas ligantes, oferecendo insights sobre estabilidade molecular e aplicações terapêuticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecer Meng Pan para revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado por Singapura Ministério da educação acadêmica pesquisa fundo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) a JY; a Fundação Nacional de pesquisa através da Cingapura Mechanobiology Instituto de JY; Fundação Nacional de pesquisa, escritório, Singapura do primeiro-ministro, sob seu programa de Investigatorship da NRF (NRF Investigatorship Award no. NRF-NRFI2016-03, a JY; o fundo de investigação Fundamental para as universidades Central (2017KFYXJJ153) para H. Y.

1. preparação de DNA G4 para único-molécula esticão <ol><li>Prepare 5 '-tiol rotulado e 5 '-biotina etiquetado dsDNA alças por PCR usando polimerase DDNA em um modelo de ADN do fago lambda usando 5 '-tiol e 5 '-biotina as primeiras demão 14 ( Figura 1). As duas alças de dsDNA tem alto teor de GC (&gt; 60%) para evitar DNA derretendo quando o DNA é realizada em altas forças ou durante a distensão excessiva DNA transição 15.</li>
	<li>Produtos de PCR purify usando um kit de purificação comercial e digest com enzima de restrição BstXI de acordo com o fabricante ' protocolo de s.</li>
	<li>G4 ligate formando ssDNA e flanco ssDNA e dsDNA alças usando T4 DNA ligase de acordo com o fabricante ' protocolo s. Purificar o produto ligado por extração de gel usando um kit de purificação comercial de acordo com o fabricante ' protocolo de s.</li>
</ol> 2. Preparação do canal de fluxo <ol><li>lamela limpeza e superfície functionalization <ol><li>lugar inferior lamelas (#1.5, 22 mm × 32 mm) e lamelas superiores (#1.5, 20 x 20 mm) em vidro de tampa frascos (cada frasco pode segurar 7 peças de lamelas, de coloração o volume é ~ 20 mL). Enxagúe as lamelas nos vidrinhos com água destilada, 2 - 5 vezes.</li>
		<li>Add ~ 20 mL da solução de detergente de 5-40% em cada frasco e coloc então em um banho de limpeza ultra-sônica de 30 min. Enxágue com água destilada para &gt; 10 vezes para remover o detergente.</li>
		<li>Secar as lamelas nos frascos no forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente), ou pelo gás de 2 N. Armazenar as lamelas top secas em um armário seco.</li>
		<li>Plasma de uso (O gás de 2) para limpar as lamelas na jarra por 10 min. Durante o 10 min, prepare-se 20 mL da solução a 1% (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) em metanol (cuidado, tóxico/inflamável). Usar uma coifa química para dissolver APTES em metanol. 
		Nota: Evite a umidade ao armazenar a solução APTES. APTES velho muitas vezes causa problema na superfície funcionalização de lamelas.</li>
		<li>Imediatamente após o plasma limpeza, adicionar todas da solução APTES 1% para os vidrinhos e incubar por 1 h. Despeje os resíduos para a garrafa de resíduos específico para 1% metanol APTES. Execute as etapas relacionadas com metanol a coifa para produtos químicos inflamáveis.</li>
		<li>Lavar os potes de uma vez com metanol e &gt; 10 vezes com água destilada e em seguida seco pelo forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente). Armazenar as lamelas de fundo APTES revestido em um armário seco senão na utilização por até duas semanas. 
		Nota: Após cada etapa sub de 2.1.1 a 2.1.4, o processo de limpeza pode ser pausado antes da próxima etapa.</li>
	</ol></li> <li>Montar o canal de fluxo <ol><li>preparar dois " espaçadores ", ou seja, parafilm ou dobro-lado fita (~ 4 mm × 20mm) para cada canal. Coloque os dois pedaços de espaçadores sobre uma lamela inferior ao longo da borda longa. Coloque o espaçador, formando uma célula de fluxo entre uma lamela superior (~ área 10 mm × 20mm, Figura 2A , B).</li>
		<li>Se parafilm é usado como um espaçador, coloque o canal do fluxo sobre um aquecedor (60-120 ° C; Cuidado, quente) por 5-10 s pressionando suavemente os lados da lamela superior para unir as duas lamelas por parafilme. O canal de fluxo resultante tem uma altura de ~ 100 µm, e desse modo o volume do canal é ~ 20 µ l.</li>
		<li>Selar a borda longa do canal com cola de silicone para evitar fugas. Use cola de silicone para fazer uma pequena estrutura de pia em cada borda aberta do canal de fluxo, que serve como uma entrada e uma saída da solução. 
		Nota: A entrada e saída também podem ser feitas por outros meios, por exemplo, por anéis de plástico pequenos aderente usando cera.</li>
		<li>Armazenar canais em um armário seco por até 4 semanas.</li>
	</ol></li> <li>DNA baraço para a superfície inferior do canal de fluxo <ol><li>diluir as esferas de poliestireno revestido amino (diâmetro: 3 µm) por 200 X em água destilada 1 X fosfato tamponado tampão salino (PBS). Vórtice a solução do grânulo e então fluxo em canais. Incubar a solução do grânulo em canais para ~ 30 min. Retire qualquer surpresa desagradável grânulos por lavagem com 200 µ l de 1 tampão PBS X.</li>
		<li>Ajuste (aumentar/diminuir) o tempo de incubação para atingir uma densidade de superfície dos grânulos de 1-5 por área de 50 x 50 mm. Armazenar os canais depositados com os grânulos de referência até 3 dias.</li>
		Sulfosuccinimidyl <li>dilua 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) pó para solução de PBS X 1 (~ 0,5 mg/mL). Vórtice a solução e em seguida fluxo dentro do canal. 
		Nota: Preparar a solução de Sulfo-SMCC fresca antes da utilização e adicioná-lo imediatamente para o canal para evitar a hidrólise da SMCC.</li>
		<li>Incubar a solução SMCC no canal de 30 min. Remove a solução SMCC lavando com uma grande quantidade (mL 1, ~ 50 X o volume do canal) de 1 solução de PBS X. 
		Nota: Lave o excesso SMCC cuidadosamente. Esta etapa é essencial para a ligação do DNA na lamela.</li>
		<li>DNA amarrar <ol><li>diluir o tiol-biotina rotulado de DNA em 1X PBS, com uma concentração de DNA resultante de ~ 0,3 nM. Pipetar delicadamente para misturar a solução, a solução de DNA de fluxo dentro do canal SMCC-revestido e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Lavar delicadamente DNA livre com 200 µ l de solução que contém 1X PBS com 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% de 2-Mercaptoetanol de bloqueio.</li>
		<li>Bloco a superfície do canal incubando o canal em solução (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoetanol) de bloqueio para &gt; 2 h; após este passo, o canal está pronto para as experiências. O canal preparado pode ser mantido a 4 ° C para ~ 1 dia. 
		Nota: A etapa de bloqueio é importante para a redução da ligação não-específica de DNA e grânulos magnéticos para as lamelas.</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnético pinças instalação e identificação de único dsDNA Tether <ol><li>instalação de pinça magnética <ol><li>iniciar o magnético pinças controlam o programa. Aqui, a pinça magnética eram controlada por um programa LabVIEW escrito casa.</li>
		<li>Alinhar os centros do ímã antes de montar o canal. Use uma lente de objetivo 4 X para ajustar para o x - e eixo y dos ímãs no eixo óptico do microscópio.</li>
		<li>Usar um manipulador motorizado controlado por computador para mover os ímãs na direção-z ( Figura 2A) e defina a distância como d = 0 (d: distância entre os ímãs e lamela) quando os ímãs anexar a uma lamela no microscópio.</li>
		O movimento dos ímãs através da manipulação para conseguir o controle da força, incluindo a força constante (ou seja, constante d) do programa de <li>e tempo variando a força F (t) (ou seja, variando o tempo d(t )).</li>
		<li>Brilhante use uma fonte de luz do diodo emissor de luz (LED) para a iluminação difusa de volta do cordão com o objetivo de. Recolher as imagens do grânulo, a uma taxa de amostragem de 100 Hz por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). &lt; / lEu &gt;</li></ol></li> <li>configuração da amostra e identifique o baraço dsDNA único <ol><li>formação Tether <ol><li>suavemente o fluxo em 200 X diluído grânulos M-280, paramagnéticos na solução de ensaio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10mm Tris-pH 7,4 ) para um canal. Incube durante 10 minutos permitir que os grânulos vincular a biotina-rotulado moléculas de DNA imobilizadas na superfície de SMCC-revestido através da extremidade do thiol-rotulados. Lavar delicadamente grânulos un-amarrados usando 200 µ l da solução de reação padrão. 
			Nota: Os grânulos de M-280 mostram menor ligação não específica para a superfície em comparação com outros grânulos magnéticos comerciais tais como M-270.</li>
		</ol></li> <li>Montar o canal para o palco do microscópio. Pesquisa para os grânulos na superfície de fundo usando o 100 X objetivo de imersão de óleo.</li>
		<li>Selecione um grânulo de referência na superfície e um grânulo amarrado em movimento. Construir as bibliotecas de imagem inicial do grânulo de referência e do grânulo amarrado em aviões diferentes desfocagem.</li>
		<li>Calibração da imagem de grânulos <ol><li>antes de experimentos, use um atuador piezo objetiva para obter imagens de referência e grânulos amarrados em aviões diferentes desfocagem espaçadas de 20-50 nm, que são armazenados como dois imagem separada do grânulo bibliotecas e são respectivamente indexados com a distância de desfocagem ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>x, y, determinação de posição z <ol><li>durante as experiências, determinar a posição do cordão de no plano x-y pelo centroide do grânulo. Determine a mudança de altura do cordão amarrado de comparando a imagem atual do grânulo com aqueles armazenados na biblioteca. Usar a análise de função autocorrelação do espectro de energia da transformada de Fourier do grânulo imagens 16.</li>
		</ol></li> <li>Do ADS gabarito usando a conta de referência <ol><li>durante as experiências, usar o piezo para " bloqueio " a distância entre o objectivo e uma imagem de grânulo de referência específicas armazenadas na biblioteca através de uma frequência baixa controle de gabarito, para que a imagem do grânulo preso tem a melhor correlação com uma imagem específica armazenada na biblioteca ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>Determinar se o baraço é uma molécula única dsDNA aplicando ~ 65 pN força determinar uma molécula dsDNA único se o baraço sofre o ADN característico distensão excessiva transição 17 , 18 , 19. Repita o processo até que seja encontrado um única dsDNA baraço. (Consulte a próxima seção para calibração de força e DNA distensão excessiva transição).</li>
	</ol></li></ol> 4. Calibração de força de pinça magnética <ol><li>determinar diretamente a força (até 100 pN) para longa (λ 48.502 bp-DNA) as moléculas de DNA utilizando a flutuação do grânulo através de: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg"> , onde k B é a constante de Boltzmann, T é a temperatura na escala Kelvin, δ 2 y é a variância de flutuação do grânulo na direção perpendicular ao campo magnético e a força direção. Nesse sentido, o movimento da esfera pode ser descrito como uma flutuação de pêndulo com um comprimento de l + r 0, onde l é a distância de ponta a ponta na direção da força (extensão) do DNA, e é r 0 o raio do grânulo 10 ( Figura 3A).</li>
	<li>Determinar a curva de calibração para a força F como uma função de ímãs para distância do grânulo, d e F (d) para contas diferentes usando o longo λ-DNA. Geralmente, a distância entre o ímã e a lamela é usada como o comprimento do cabo do DNA pode ser ignorado. Encaixar o F-d curva pela função dupla-exponencial de decaimento: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg"> , onde o encaixe parâmetros α1, α2, γ1, γ2 são determinados pela pinça magnética e o parâmetro C é determinada pela propriedade heterogênea dos grânulos magnéticos. Deslocando o C, o F-d curva Obtida de missanga diferentes pode ser sobreposto 10 ( Figura 3B).</li>
	<li>Experimentos de calibração de parâmetro C para esferas magnéticas individuais para curto ADN.
	<ol><li>Determinar a força baseada a flutuação requer gravação da posição do grânulo em uma frequência maior do que a frequência de canto: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg"> , onde γ é o arrasto coeficiente do talão. Para DNA curta em alta força, requer frequência de gravação mais rápido do que 100 Hz, portanto, a força não pode ser medida diretamente com base na flutuação com a câmera. No entanto, o parâmetro C pode ser determinada medindo a força em uma baixa força gama (&lt; pN 15) utilizando a flutuação e encaixe os dados com um calibrado F-d curva para obter o parâmetro C 20.</li>
		<li>, Alternativamente, para experiências com dsDNA, determinar o parâmetro C usando DNA distensão excessiva transição com uma força de ~ 65 pN ( Figura 3) 21 , 22 , 23, gravando a posição d no qual salto de extensão mostrou dsDNA (0,6 X aumento de comprimento de comprimento de contorno). Depois de determinar o parâmetro C, calcular a força para os grânulos amarrados.</li>
	</ol></li> <li>Controlar a taxa de carregamento através da programação do movimento dos ímãs através da função inversa de F (d). O ímã deve aproximar a amostra dupla exponencialmente. 
	Nota: O erro relativo da força determinada por tal um método de extrapolação é ~ 10% e é causada principalmente pelo raio de grânulo heterogeneidade 20.</li>
</ol> 5. Único-molécula manipulação do G4 na presença e na ausência de ligação a proteínas <ol><li>força-rampa experimentos <ol><li>depois de identificar o baraço dsDNA, executar uma verificação de aumento de força a uma taxa de carregamento de 0.2 pN/s seguido de um verificação de força-falecimento em-0.2 pN/s. Após cada ciclo de alongamento, segure a molécula de DNA em 1 pN por 30 s para permitir que o ssDNA a redobrar a G4.</li>
	</ol></li> <li>Experimentos de força-salto <ol><li>a força do ciclo entre 54 pN por 30 s sob as quais um G4 dobrado pode ser desdobrado e 1 pN para 60, sob a qual um G4-15T dobrado pode redobrar.</li>
	</ol></li> <li>Solução de proteína flui <ol><li>fluxo de solução da proteína quando em ~ 20 pN força para evitar o apego dos grânulos a lamela. A helicase DEAH-caixa RHAU, que mostrou alta especificidade para a estrutura de G4, foi usado 24. A Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificado conforme descrito anteriormente, 25. O G4 atividade desenrolamento de DmRHAU foi analisada em um tetramoleculares G4 ADN substrato 13.</li>
	</ol></li> <li>Analisar a desdobramento força usando um in-house escrito Matlab programa 14.</li></ol>

<ol><li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li>
<li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li>
<li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+and+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li>
<li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li>
<li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li>
<li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li>
<li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li>
<li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li>
<li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA%2C+melting+bubbles%2C+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li>
<li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA%2C+melting+bubbles%2C+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-biophys-122311-100544?journalCode=biophys">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li>
<li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905(2004).</li>
<li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113(2015).</li>
<li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li>
<li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes%3A+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters%3A+a+novel+anticancer+strategy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li>
<li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders%3A+Synthesis%2C+Biophysical%2C+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li>
<li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-B+DNA+conformations%2C+mutagenesis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Conforme descrito acima, uma plataforma para estudar a estabilidade mecânica do ADN do G4 e as interações da proteína para G4 usando pinças de único-molécula magnética é relatada. Que acompanha a plataforma, são desenvolvidos protocolos altamente eficientes de encontrar DNA G4 baraço e medição da dobradura-revelação dinâmica e estabilidade da estrutura G4 com resolução especial nanômetros. O plano focal de travamento permite controle de anti drift altamente estável, que é importante para a detecção de uma transição de es...

Quatro-hélice do DNA ou RNA G4 estruturas desempenham um papel crítico em muitos processos biológicos importantes1. Muitas proteínas envolvidas no G4 vinculação e regulamento, incluindo proteínas obrigatórias do telômero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fatores de transcrição (nucleolin, PARP1)3, proteínas (hnRNP A1, de processamento de RNA hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVI, Dna2, Pif1)5e replicação de DNA relacionadas com proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Emperramento da proteína pode estabilizar ou desestabilizar estruturas G4; assim, regula as funções biológicas subsequentes. A estabilidade do G4 foi medida por térmica fusão usando radiação ultravioleta (UV) ou de métodos de Dicroísmo circular (CD)7. No entanto, tais condições não são fisiológicas relevantes e são difíceis de aplicar para estudar os efeitos de ligação a proteínas7.
O rápido desenvolvimento em tecnologias de manipulação do único-molécula permitiu estudos de dobramento e desdobramento de uma biomolécula, tais como um DNA ou uma proteína, a um nível único-molécula com resolução nanômetros em tempo real8. Microscopia de força atômica (AFM), pinça óptica e pinças magnéticas são os mais comumente usados métodos de manipulação de único-molécula. Comparado a AFM e pinça óptica9, pinça magnética permite medições estáveis de dobradura-revelação dinâmica de uma única molécula de dias usando uma técnica do ADS10,11.
Aqui, uma plataforma de manipulação do único-molécula usando uma pinça magnética para estudar a regulação da estabilidade do G4 por proteínas de ligação é relatado12,13. Este trabalho descreve as abordagens básicas, incluindo a preparação de amostra e fluxo de canal, a instalação de uma pinça magnética e a calibração de força. O controle de força e os protocolos do ADS como descrito no passo 3 permitem medições em longo tempo sob diversos controles de força, tais como a força constante (braçadeira de força) e constante carregando taxa (força-rampa) e medição de força-salto. O protocolo de calibração de força descrito na etapa 4 permite a calibração de força do &#60; 1 µm curto baraços ao longo de uma vasta força variam até 100 pN, com um erro relativo dentro de 10%. Um exemplo de regulamento da estabilidade do RNA Helicase associado com AU-rico elemento (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) que tem um papel essencial na resolução de que RNA G4 é usado para demonstrar as aplicações desta plataforma13.

<table><tbody><tr><td>Primers de PCR</td><td>de DNA IDT</td><td></td><td>Preparações de DNA</td></tr><tr><td>PCR Produtos químicos</td><td>de PCR NEB</td><td></td><td>Enzimas de</td></tr><tr><td>restrição BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>Preparações de DNA</td></tr><tr><td>lamínulas (# 1,5, 22 * 32 mm e 20 * 20 mm)</td> <td>BMH. BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Preparação limitada</td><td></td> do <td>canal de fluxo</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>M-280, esferas paramganéticas, estreptavidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>Preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>Microesferas de Amino Polybead 3.00 &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>preparação do canal de fluxo</td></tr><tr><td>Microscópios Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Olympus Lente objetiva MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Câmera CCD/CMOS</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B Configuração de</td><td>pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Estágio linear de tradução</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Ímãs cúbicos</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Configuração de pinças magnéticas</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Análise de dados</td></tr></tbody></table>

manipulação de único-molécula de g-quadruplexes por pinça magnética

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Estrutura secundária não-canônicos do ácido nucleico que g-quadruplexes (G4) estão envolvidos em diversos processos celulares, tais como a replicação do DNA, transcrição, processamento de RNA e alongamento do telômero. Durante estes processos, várias proteínas ligam e resolver estruturas G4 para desempenhar a sua função. Como a função do G4 muitas vezes depende da estabilidade de sua estrutura dobrada, é importante investigar como proteínas obrigatórias do G4 regulam a estabilidade do G4. Este trabalho apresenta um método para manipular o único G4 moléculas usando uma pinça magnética, que permite estudos do Regulamento das proteínas de ligação G4 em uma única molécula de G4 em tempo real. Em geral, este método é adequado para uma ampla gama de aplicações em estudos para interações de proteínas/ligantes e regulamentos sobre várias estruturas secundárias DNA ou RNA.

A montagem da experiência de uma única molécula de G4 de alongamento é mostrada na Figura 4. Uma sequência de formação single-stranded G4 que se expandiu entre duas alças de dsDNA foi amarrada entre uma lamela e um grânulo paramagnético. Para encontrar uma pérola de dsDNA único amarrados, realizou-se um ensaio overstretching, aumentando a força em taxas de carga constante. Três tipos de medidas muitas vezes foram usados para estudar o dobramento e o desdobram...

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

O objetivo geral deste experimento é medir diretamente o dobramento e desdobramento de G-quadruplexes, abreviados como G4, e a regulação pela ligação de proteínas no nível de molécula única usando pinças magnéticas. Esta mensagem pode ajudar a responder a questões-chave no campo G4, como a dinâmica flutuante de G4 e a regulação por proteínas de ligação. A principal vantagem desta técnica, é que as pinças magnéticas, permitem a medição estável, da dinâmica flutuante de tamanho nanométrico de uma única molécula ao longo de dias, usando a técnica anti-deriva.Vamos começar com esta mensagem, pode fornecer o interior dos mecanismos moleculares de estabilidade do G4, as atividades da helicase no G4, também pode ser usado para sondar os al-a-do-gees relacionados às proteínas de ligação ao G4, ou ligans, que podem ter potenciais aplicações terapêuticas. Além disso, também pode ser usado para sondar as interações externas do DNA da proteína ou interações proteína-proteína. Comece este procedimento com a preparação do DNA G4 no canal de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.O DNA G4 foi preparado ligando G4 formando DNA de fita simples, DNA de fita simples de dois flancos e uma alça

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Pinças magnéticas, uma poderosa molécula única técnica de manipulação, pode ser adaptado para as medições diretas da torção (usando uma configuração chamada livremente em órbita pinças magnéticas) e torque (usando uma configuração chamada pinças de torque magnético) em macromoléculas biológicas. Orientações para a realização de tais medidas são dadas, incluindo aplicações para o estudo do DNA e filamentos nucleo-proteínas associadas.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Pinças ópticas têm sido usadas para estudar o dobramento de RNA esticando moléculas individuais de suas extremidades 5 'e 3'. Aqui são descritos procedimentos comuns para sintetizar moléculas de RNA para pinça, calibração do instrumento e métodos para manipular moléculas individuais.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

G4 Resolvase1 liga-se a (G4) estruturas G-quadruplex com mais apertados afinidade reportada para uma proteína de ligação e G4 representa a maior parte da actividade de desenrolamento-G4 ADN em células HeLa. Nós descrevemos um protocolo romance que aproveita a afinidade e atividade desenrolamento dependente de ATP G4-Resolvase1 para purificar especificamente G4R1 recombinante cataliticamente ativo.

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Este protocolo demonstra o uso de pinças magnéticas de molécula única para estudar as interações entre proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e telômeros longos extraídos de células humanas. Ele descreve as etapas preparatórias para telômeros e fatores de ligação de repetição teloméricos, a execução de experimentos de molécula única e os métodos de coleta e análise de dados.

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Este protocolo descreve um ensaio de replicação de DNA de molécula única baseado em microscopia de fluorescência, permitindo a visualização em tempo real das interações entre DNA polimerases e obstáculos como estruturas G-quadruplex.

Visualização de fluorescência de molécula única da dinâmica da DNA polimerase em G-quadruplexes

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Aprenda a manipular G-quadruplexes em nível de única molécula usando pinça magnética. Este método permite medir a dinâmica de dobramento e a regulação por proteínas ligantes, oferecendo insights sobre estabilidade molecular e aplicações terapêuticas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Explorar mais vídeos