Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

O objetivo geral deste experimento é medir diretamente o dobramento e desdobramento de G-quadruplexes, abreviados como G4, e a regulação pela ligação de proteínas no nível de molécula única usando pinças magnéticas. Esta mensagem pode ajudar a responder a questões-chave no campo G4, como a dinâmica flutuante de G4 e a regulação por proteínas de ligação. A principal vantagem desta técnica, é que as pinças magnéticas, permitem a medição estável, da dinâmica flutuante de tamanho nanométrico de uma única molécula ao longo de dias, usando a técnica anti-deriva.

Vamos começar com esta mensagem, pode fornecer o interior dos mecanismos moleculares de estabilidade do G4, as atividades da helicase no G4, também pode ser usado para sondar os al-a-do-gees relacionados às proteínas de ligação ao G4, ou ligans, que podem ter potenciais aplicações terapêuticas. Além disso, também pode ser usado para sondar as interações externas do DNA da proteína ou interações proteína-proteína. Comece este procedimento com a preparação do DNA G4 no canal de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.

O DNA G4 foi preparado ligando G4 formando DNA de fita simples, DNA de fita simples de dois flancos e uma alça de DNA de fita dupla, usando ligações de DNA T4. Para a configuração das pinças magnéticas, inicie o programa de pinças magnéticas. Aqui, as pinças magnéticas são controladas por um programa interno de visualização de laboratório escrito.

Em seguida, alinhe os centros magnéticos antes de montar o canal. Use uma lente objetiva 10 vezes para ajustar os eixos X e Y do magnetismo, no acesso óptico do microscópio. Use um manipulador motorizado controlado por computador para mover os ímãs ao longo da direção Z e defina a distância entre os ímãs e a lamínula como D igual a zero, quando o magnetismo se prende a uma lamínula no microscópio.

Programe o movimento do magnetismo através do manipulador para obter o controle da força, incluindo força constante e força variável no tempo. Use uma fonte de luz de diodo emissor de luz brilhante para iluminação retroespalhada do cordão através da objetiva. Colete as imagens do grânulo e uma taxa de amostragem de 100 hertz, por uma câmera de dispositivo acoplada à mudança.

Para a formação de amarras, flua suavemente 200 X diluídos M280 para esferas magnéticas em solução de ensaio em um canal. Incube a mistura por 10 minutos para permitir que as esferas se liguem às moléculas de DNA marcadas com biotina imobilizadas na superfície codificada SMCC através do ent marcado com tiol. Lave suavemente os grânulos soltos usando 200 microlitros de solução de reação padrão.

Em seguida, monte o canal no microscópio stage. Procure os grânulos na superfície inferior usando a objetiva de imersão em óleo 100 vezes. Selecione um cordão de referência na superfície e um cordão amarrado em movimento.

Construa as bibliotecas de imagens iniciais, tanto do cordão de referência quanto do cordão amarrado e de diferentes planícies desfocadas. Antes dos experimentos, use um atuador Piezo objetivo para obter imagens de contas de referência e amarradas em diferentes planícies desfocadas, espaçadas de 20 a 50 nanômetros. Armazene as imagens como duas bibliotecas de imagens de contas separadas que são indexadas respectivamente com a distância desfocada.

Durante os experimentos, determine a posição do cordão na planície XY, pelo centróide do cordão. Determine também a alteração de altura do cordão amarrado comparando a imagem do cordão atual com as armazenadas na biblioteca. Use a análise da função de correlação automática do espectro de potência da transformada de Fourier das imagens de contas.

Durante os experimentos, use o Pizeo para bloquear a distância entre a objetiva em uma imagem de cordão de referência específica armazenada na biblioteca por meio de um controle de feedback de baixa frequência, para que a imagem do cordão preso tenha a melhor correlação com a imagem específica armazenada na biblioteca. Determine se a corda é uma única molécula de DNA de fita dupla, aplicando aproximadamente 65 piconewtons de força. Uma corda é uma única molécula de DNA de fita dupla se sofrer a transição característica de alongamento excessivo do DNA.

Repita o processo até que uma única corda de DNA de fita dupla seja encontrada. A relação entre força e posição do ímã, ou chamada curva de distância de força, foi calibrada com base na flutuação do cordão. Além disso, a transição de alongamento excessivo do DNA de fita dupla que ocorreu perto de 65 piconewtons também pode ser usada para calibrar a força.

Para experimentos de rampa de força, execute uma varredura de aumento de força a uma taxa de carregamento de 0,2 piconewtons por segundo, seguida por uma varredura de diminuição de força a menos 0,2 piconewtons por segundo. Após cada ciclo de alongamento, mantenha a molécula de DNA em um piconewton por 30 segundos, para permitir que o DNA de fita simples se dobre novamente em G4. Para experimentos de salto forçado, alterne a força entre 54 piconewtons por 30 segundos, sob os quais um G4 dobrado pode ser desdobrado, e 1 piconewton por 60 segundos, permitindo que um G4-15T dobrado dobre novamente. Finalmente, analise a força de desdobramento, usando um programa interno de laboratório de esteira escrita.

Mostrado aqui, é um exemplo típico de uma curva de aumento de força e diminuição de força de um quadruplex G4 amarrado. O salto de extensão na varredura de aumento de força indicou uma transição de desdobramento de G4, em aproximadamente 52 piconewtons. No entanto, na presença de RHAU, G4 permaneceu dobrado durante a varredura de aumento de força por até 60 piconewtons, indicando estabilização da força G4 pela ligação do RHAU.

Na presença de RHAU e ATP, a distribuição de força de desdobramento de G4 foi deslocada para uma força menor, indicativa de uma desestabilização dependente de ATP de G4 por RHAU. Traços representativos da altura do cordão durante os ciclos de salto de força, mostram que a força aplicada à molécula foi ciclada entre 54 piconewtons por 30 segundos, sob os quais um G4 dobrado poderia ser desdobrado, e 1 piconewton por 60 segundos, sob o qual poderia se dobrar novamente. O tempo médio de vida de um G4 dobrado a 54 piconewtons foi de aproximadamente 6,4 segundos, estimado pelo ajuste do histograma de tempo de vida com uma função de decaimento exponencial.

Quando o RHAU helicase foi introduzido, a extensão do DNA amarrado permaneceu no nível dobrado durante os 30 segundos de tempo de retenção em 54 piconewtons, indicando que o RHAU estabiliza fortemente o G4 contra o desdobramento mecânico. Após a adição de RHAU e ATP, a extensão estava no nível do DNA de fita simples desdobrado, indicando uma desestabilização de G4. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a dinâmica de desdobramento e redobramento das junções nucleares ACS usando esta pinça magnética ultra estável. A atribuição desta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da estrutura de ácidos nucleicos e proteínas de ligação explorarem a regressão da estabilidade da estrutura e a cinética de dobramento, bem como a interação de ácidos nucléicos e proteínas de ligação.