A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

O objetivo geral da fabricação deste dispositivo de imagem é criar uma plataforma modificável para análise microscópica da cicatrização de feridas em larvas vivas de peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cicatrização de feridas, como qual é a contribuição da reorganização das fibras de colágeno e das respostas celulares para o crescimento subsequente do tecido após a lesão. A principal vantagem dessa técnica é que o ferimento e a imagem ocorrem dentro de um único dispositivo, enquanto o crescimento da cauda não é impedido pelo dispositivo.

Além disso, os múltiplos compartimentos funcionais do zWEDGI podem ser modificados independentemente para acomodar diferentes estágios larvais e uma série de protocolos experimentais. Para começar, modele o componente PDMS do dispositivo com as geometrias e atributos desejados de acordo com o protocolo de texto. Depois de imprimir os moldes usando uma impressora 3D de fotopolímero, limpe os moldes usando um pincel fino, álcool desnaturado em um borrifador e ar comprimido.

Esfregue e remova suavemente a resina não curada, principalmente qualquer material das regiões dos microcanais. Em seguida, pós-cura dos bolores em um aparelho de pós-cura UV por 60 minutos de cada lado, pois a resina não curada é tóxica para as larvas do peixe-zebra. Usando uma lixa de grão 200, lixe o lado da cavidade do molde em uma superfície plana até que todas as superfícies do teto estejam em contato com a lixa.

Com lixa de grão 400 e 600, lixe levemente progressivamente para produzir superfícies lisas e niveladas em todas as faces geométricas do molde. Em seguida, use um relógio comparador para medir a profundidade da cavidade após o lixamento para verificar se ela está próxima da profundidade do projeto. Limpe os moldes e os discos de cobertura de vidro colocando-os em um limpador ultrassônico cheio de água por 30 minutos ou lavando-os em água corrente.

Use álcool isopropílico e ar comprimido filtrado para limpar e secar os moldes e tampas. Prepare uma bancada limpa como local para fabricar os dispositivos para minimizar a contaminação por detritos transportados pelo ar. Faça o PDMS despejando a base e o ativador na proporção de 5:1 em um copo plástico.

Com um palito de madeira, misture bem por dois minutos, mexendo o gel sobre si mesmo como se estivesse amassando pão. Desgaseifique a mistura em um dessecador a vácuo por 25 a 45 minutos até que todas as bolhas desapareçam. Em seguida, usando uma seringa de 10 mililitros, preencha a cavidade de cada molde impresso em 3D com aproximadamente 0,75 mililitros de PDMS até que o molde transborde levemente com um menisco.

Desgaseifique os moldes cheios por 45 minutos para remover bolhas adicionais que possam ter se formado durante o preenchimento. Aplique um disco de cobertura de vidro em cima do molde preenchido com PDMS, pressionando o disco para baixo em um ângulo para evitar que as bolhas fiquem presas. Permita que o excesso de PDMS seja expelido à medida que a tampa do disco de vidro é aplicada.

Em seguida, use uma pequena catraca clamp para segurar o disco de cobertura firmemente no molde. Para maior eficiência, um dispositivo multi-clamp pode ser usado. Cure o dispositivo PDMS e os moldes fixados a 100 graus Celsius em um forno por pelo menos 90 minutos.

Em seguida, retire as formas do forno e deixe-as esfriar até que possam ser facilmente manuseadas. Prenda o molde que contém o dispositivo PDMS curado em um torno de bancada de modo que as geometrias do molde fiquem voltadas para cima, paralelamente à bancada da estação de trabalho. Comece a remover o dispositivo PDMS usando uma pinça de ponta plana para liberar a torneira de tração PDMS do molde.

Em seguida, trabalhe ao redor do perímetro do molde com a pinça. O PDMS deve ser curado por pelo menos 90 minutos a 100 graus Celsius ou então permanecerá pegajoso e grudará no molde. Uma boa indicação de que você curou o dispositivo por tempo suficiente é que você realmente verá uma bolha de ar na interface entre o molde e o dispositivo PDMS, indicando que ele será facilmente removido.

Use ar comprimido filtrado e uma pinça para levantar suavemente o dispositivo para fora do molde, segurando a aba de puxar e soprando ar sob o dispositivo. Em seguida, coloque o dispositivo PDMS de cabeça para baixo na parte interna da tampa de um prato com fundo de vidro, de modo que as cunhas do túnel de retenção toquem o plástico. Em seguida, coloque a tampa do prato com zWEDGI de cabeça para baixo e o prato com fundo de vidro correspondente em um limpador de plasma com o vidro interno voltado para cima.

Evacue a câmara de limpeza de plasma até que a pressão atinja 500 militorr. Defina a frequência de rádio, ou potência de RF, para alta e exponha o dispositivo e a antena parabólica à frequência de RF por aproximadamente dois minutos. Em seguida, despressurize lentamente a câmara e retorne o dispositivo e o prato para um exaustor de sala limpa.

Remova o dispositivo PDMS da tampa do prato. Em seguida, vire o PDMS zWEDGI para a orientação correta no vidro, posicionando-o cuidadosamente no centro do prato de fundo de vidro. Para garantir a aderência do PDMS ao vidro, use a extremidade traseira da pinça para aplicar pressão em torno das geometrias minúsculas dos microcanais, alisando o PDMS em direção às bordas.

Pressione levemente o dispositivo PDMS para garantir que as bolhas de ar não fiquem presas sob o dispositivo. Adicione 70% de etanol ao prato e, usando uma micropipeta, enxágue os canais, inclusive através do túnel de retenção. Em seguida, remova o etanol e use água bidestilada para enxaguar o dispositivo duas ou três vezes antes de deixá-lo secar ao ar.

Encha os canais com leite desnatado e incube o dispositivo por 10 minutos em temperatura ambiente para minimizar a aderência das larvas à lamínula de vidro do prato. Em seguida, mergulhe suavemente o dispositivo várias vezes em água bidestilada para enxaguar e deixe-o secar ao ar de cabeça para baixo. Após anestesiar as larvas de acordo com o protocolo de texto, use alguns microlitros de tricaína E3 para pré-umedecer os canais do dispositivo.

Usando uma ponta de pipeta de orifício largo, pegue uma única larva e deposite-a no canal de carregamento. Em seguida, com uma ponta de pipeta ou ferramenta semelhante, oriente a larva na câmara de carregamento com o lado dorsal voltado para a borda mais reta da câmara de carregamento e a cauda voltada para o túnel de contenção. Retire cuidadosamente o fluido da câmara de ferimento, permitindo que a larva flua para o túnel de contenção.

Remova a maior parte do líquido, mantendo a umidade ao redor da larva. A larva deve ser devidamente orientada para o túnel de contenção à medida que a maior parte do líquido é removida. Mas líquido suficiente deve permanecer ao redor das larvas.

A orientação pode ser ajustada após a adição de agarose, mas deve ser realizada antes que a agarose se solidifique. Pipete agarose 1%LMP em tricaína E3 sobre a cabeça da larva, enchendo a câmara de carregamento e deixe a agarose solidificar com a larva na posição adequada. Adicione tricaína E3 à câmara de ferimento conforme necessário para manter a hidratação.

Em seguida, repita esse processo de carregamento para os dois canais restantes. Usando uma agulha de seringa, remova cuidadosamente qualquer agarose que tenha penetrado pelo túnel de contenção na câmara de ferimento. Para ferimentos, imagens de curto prazo ou isolamento do tratamento de feridas, adicione mais tricaína E3 sobre a agarose.

Para ferir as larvas na câmara de ferimento, use uma lâmina de bisturi estéril para transeccionar a barbatana caudal posterior à notocorda. Adicione tricaína E3 adicional, se necessário, e recoloque a tampa do prato de cultura. Instale o dispositivo zWEDGI com larvas anestesiadas em um microscópio invertido em um inserto de platina que acomodará o prato inferior de vidro de 60 milímetros.

Localize a cauda das larvas no canal superior, girando o prato conforme necessário para colocar a cauda na posição desejada. Visualize a larva conforme necessário para o experimento específico. Na conclusão do experimento, remova a placa zWEDGI do microscópio.

Após a remoção das larvas e do ágar de acordo com o protocolo de texto, use etanol e água destilada para limpar o zWEDGI conforme demonstrado anteriormente e coloque-o de cabeça para baixo para secar ao ar. Guarde o dispositivo coberto em um local fresco e seco. Aqui são mostradas imagens usando microscopia multifotônica para segundo harmônico, ou imagens SHG de fibras de colágeno na nadadeira caudal para ilustrar as capacidades de imagem do zWEDGI.

Antes da ferida, o SHG detectou fibras de colágeno que irradiam para fora da notocorda até a ponta da nadadeira. Logo após a ferida, a distância entre a ponta da barbatana contraída e o centro da barbatana aumenta com o relaxamento da ferida. O zWEDGI permite a coleta de dados tridimensionais ao longo do tempo, fornecendo uma visão mais completa das mudanças dinâmicas que ocorrem na estrutura da matriz extracelular.

A natureza 3D da coleta de dados permite a reconstrução espacial usando software de renderização. Essas reconstruções e as opções de rotação subsequentes ilustram que a contração e o relaxamento da barbatana ocorrem não apenas no plano XY da coleção de imagens, mas também no eixo Z, à medida que a cauda se achata a partir da curvatura ascendente do estado contraído. Uma vez impressos os moldes reutilizáveis, a técnica de fabricação pode ser feita em três a quatro horas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que nenhuma bolha de ar fique presa no PDMS antes de curar e curar os dispositivos por tempo suficiente antes de tentar removê-los dos moldes. Após este procedimento, outros métodos, como aplicação localizada de medicamentos, marcação de anticorpos ou purificação de RNA e proteínas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a presença de medicamentos ou inibidores afeta a cicatrização de feridas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da cicatrização de feridas explorarem a dinâmica do colágeno, a resposta das células imunes e o crescimento do tecido nas larvas do peixe-zebra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar um zWEDGI e usá-lo para ferir e obter imagens ao vivo de larvas de peixe-zebra. Não se esqueça de que as resinas de impressão 3D de fotopolímero são perigosas para os seres humanos e tóxicas para o peixe-zebra. Devem ser tomadas precauções, como usar luvas e máscara facial ao manusear peças impressas em 3D não curadas e garantir que toda a resina restante nas impressões seja curada antes de tentar preencher os moldes com PDMS.