Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

O objetivo geral deste protocolo é obter nanopadrões desiguais baseados em dendrímeros em grande escala que permitam o controle em nanoescala da adesividade da superfície local. O método descrito é aplicado para o estudo da adesão celular e diferenciação condrogênica. Os nanopadrões elevados de dendrímero permitem controlar localmente a adesividade da superfície em nanoescala.

Polinômeros de primeira geração modificados com o peptídeo RGD adesivo celular são usados para criar nanopadrões. Caracterizam-se por técnicas de varredura por microscopia e utilizadas em estudos de adesão e diferenciação celular. Em seguida, analisamos os resultados das técnicas de microscopia e imunocoloração.

O primeiro passo é preparar os substratos de trabalho. Lâminas de vidro quadradas personalizadas são produzidas cortando lâminas de microscopia com um cortador com ponta de diamante. Faça slides de 1,25 por 1,25 centímetros de tamanho.

Lave as lâminas com água deionizada, seguida de etanol a 96% e deixe secar ao ar. Prepare a solução de 2% de PLLA adicionando 200 miligramas de PLLA a um tubo de pressão e adicione 10 mililitros de dioxano. Adicione uma barra de agitação e feche bem o tubo.

Aqueça a mistura em um banho de glicerina a 60 graus centígrados por 24 horas sob agitação suave. Coloque as lâminas de vidro em um frasco de vidro contendo a solução de PLLA em uma placa limpa e quente a 60 graus centígrados. Aguarde pelo menos 10 minutos para atingir a temperatura necessária.

Gire os substratos de vidro com a solução PLLA, colocando a lâmina de vidro no estágio do revestidor giratório e executando o programa selecionado. Selecionamos 3.000 rpm por 30 segundos com uma aceleração de 1.500 rpm por segundo com um pré-passo de 500 rpm a cinco segundos a 300 rpm por segundo para garantir um revestimento homogêneo. Os copos revestidos de spin podem ser armazenados na geladeira.

Preparar e sonicar durante 10 minutos a solução A, uma solução de 0,77 miligramas por mililitro de dendrímero RGD-Cys-D1 em água desionizada. Em seguida, prepare soluções dendrímeras de 10 a 2% e 10 a 5% solução B e C, respectivamente, em água deionizada. Sonicate a solução C por 10 minutos e prepare as seguintes soluções dendrímeras, D, E e F também em água deionizada.

Solução D, 2,5x10 elevado a 8%solução E, 10 elevado a 8%e solução F, 4 10 elevado a 9%Conserve estas soluções no frigorífico até à utilização. Você se forma com uma lâmpada UV da cabine de cultura de células 18 vidros revestidos com PLLA por 13 minutos para torná-los estéreis. Sonicar cada uma das soluções dendrímeras por 10 minutos.

Filtre as soluções de dendrímeros através de filtros de 0,22 micrômetros de diâmetro nas lâminas de vidro revestidas com PLLA em uma placa de 12 poços sob o fluxo laminar da cabine de cultura de células. Deixe-os dentro da cabine em temperatura ambiente por 16 horas e lave-os com água desionizada estéril. Para as amostras de controlo positivo, preparar uma solução estéril de fibronectina em PBS e incubar as réplicas com a solução durante uma hora à temperatura ambiente na cabina de cultura de células.

Lave-os com PBS. Os três substratos revestidos com PLLA restantes servirão como réplicas para o controle negativo. A topografia do nanopadrão é analisada com o AFM operado no modo de batida no ar.

Monte um modilhão de silício com uma constante de mola de 40 newtons por metro e uma frequência ressonante de 300 kilohertz no suporte da ponta AFM. Com a carcaça do nanopattern na fase do AFM, aproxime-se da superfície até o contato e escolha um ponto ajustado da amplitude que permita a imagem latente a configuração do dendrímero sem exercer a pressão excessiva na superfície. Registre pelo menos três imagens representativas de 5x5 micrômetros por substrato de três substratos independentes por condição.

Trate as imagens adquiridas com o software de processamento do AFM. Selecione dendrímeros nas imagens processadas da altura do AFM e obtenha os limiares correspondentes da imagem. Obtenha as precisões das partículas e use-as para obter as distâncias mínimas entre partículas.

Sejam as distâncias mínimas entre partículas em Z para as precisões de partículas correspondentes para obter os plugues de controle de probabilidade para as distâncias mínimas entre partículas. Ajuste a escala de cores do gráfico para visualizar as regiões onde a densidade de superfície RGD local está abaixo de 70 nanômetros. Quantifique a área dessas regiões selecionando-as na imagem e gerando um limite.

Use tecido adiposo humano comercial derivado de células-tronco mesenquimais de passagens iniciais, de preferência abaixo de cinco. Cultive-os a 37 graus e 4,6% de atmosfera de CO2 no meio de crescimento de células-tronco até atingir 70 ou 80% de confluência. Semeie as células com uma densidade celular de 3.000 células por centímetro quadrado nos substratos em um meio indutor de condrogênese.

Troque o meio a cada três dias. A etapa de condensação pode ser observada desde o primeiro dia em cultura, e sua evolução pode ser acompanhada por um microscópio óptico de contraste de fase durante todos os laboratórios de cultura. Fixe as células com solução de formalina a 10% em temperatura ambiente por 20 minutos e depois lave com PBS.

Bloqueie os grupos furaldeído adicionando uma solução 50 milimolar de cloreto de amônio em PBS. Deixe por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave com PBS.

Permeabilize as células com solução de saponina a 0,1% na solução de bloqueio de albumina a 1% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Incubar com anticorpos primários na solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Lave com PBS.

Incubar com anticorpos secundários na solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente, evitando a exposição à luz. Lave com PBS e seque. Aplique meio de montagem de microscopia nas amostras e cubra-as suavemente com lamínulas.

Visualize as amostras imunocoradas para a proteína de adesão focal paxilina após um dia de indução condrogênica e para o marcador condrogênico inicial, colágeno II alfa I após cinco dias de indução condrogênica usando um microscópio confocal vertical. Colete seções em um intervalo representativo, por exemplo, 0,5 ou 1 micrômetro. Filtre as imagens coradas para paxilina da zona basal dos condensados celulares.

Remova o plano de fundo, suavize e converta em arquivos de oito bits. Torne-os binários definindo um limite empiricamente selecionado. Trate um mínimo de três condensados de células por condição de três amostras independentes.

Quantifique as áreas selecionadas e expresse-as como a porcentagem correspondente da área dividida pelo número de núcleos celulares na imagem. Para quantificar a coloração de colágeno II alfa I, crie projeções Z confocais. Filtre as imagens resultantes, remova o plano de fundo, suavize e defina um limite.

Quantificar a soma da área projectada da área máxima de colagénio II alfa I por amostra em relação à área do condensado celular correspondente. Diferentes configurações de nanopadrões podem ser obtidas modificando a concentração inicial de dendrímeros em solução. Os nanopadrões podem ser visualizados por análise AFM e gráficos de contorno de probabilidade para a distância mínima entre partículas construída.

Eles destacam as regiões na superfície com a maior densidade de superfície RGD local. Nanopadrões de dendrímeros são usados em estudos de adesão celular. A adesão aumenta com a densidade da superfície RGD local.

Para o controle positivo e superfícies contendo agregados dendrímeros, essa correlação é perdida. A influência da densidade superficial local do RGD foi testada na condrogênese, tanto a condensação quanto a diferenciação celular são favorecidas por nanopadrões que apresentam uma adesividade intermediária. Em conclusão, nanopadrão baseado em dendrímero em um método de três tabelas para abordar o efeito da densidade local de RGD na resposta celular.

Os nanopadrões sustentam a adesão celular de forma mais eficiente na superfície homogênea correspondente comumente usada em cultura de células. Nos experimentos de diferenciação, a adesividade intermediária das células ao substrato favoreceu a condensação das células mesenquimais e a diferenciação cronogênica precoce. Devido à fácil modificação do crescimento periférico do dendrímero, o método aqui descrito pode ser estendido a todas as camadas reumáticas excessivas com efeitos de densidade nas células.