Name: Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a detectar príons da doença de emagrecimento crônico em amostras fecais de cervídeos usando o ensaio RT-QuIC. Este método sensível e específico permite análise em alta vazão para pesquisa em saúde animal.

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Nós estamos gratos ao Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para fornecer a formação e o plasmídeo de expressão bacteriana do PrP de cervídeos provenientes. SG é suportado pelo programa da cadeira de pesquisa do Canadá. Reconhecemos que o financiamento para esta pesquisa para SG do Genome Canadá, príon Alberta Research Institute e Alberta agricultura e silvicultura através do genoma Alberta e a Universidade de Calgary para apoiar este trabalho. Reconhecemos uma bolsa de pesquisa da Margaret Gunn Foundation para a pesquisa Animal.

1. RT-QuIC usando Material Fecal <ol><li>preparação de cervídeos provenientes de fezes de extratos <ol><li>Make homogenate fecal pela adição de 1 g de material fecal para 10 mL de fezes Extraia buffer (fosfato de sódio de 20 mM, pH 7.1, 130 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1x completam os inibidores de protease, EDTA-free) para dar uma concentração final de 10% (p/v). O buffer de homogeneização pode ser preparado antes da utilização e armazenado a -20 ° C.</li>
		<li>Homogenize pelotas fecais (1g) e buffer (10 mL) em tubos (por exemplo, tubos de gentleMACS M) usando um dissociador com um programa pré-estabelecido do fabricante para proteínas para 1 min à temperatura ambiente. Repita este passo de duas a três vezes, até as amostras fecais são completamente homogeneizadas no buffer.</li>
		<li>Selar os tubos com parafilm e coloque-os em um agitador de plataforma ou giratório balanço para uma incubação de 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 18.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Coletar os sobrenadantes que contêm a proteína extrai e alíquota-los em 1,5 mL tubos. Alíquotas podem ser armazenadas a-80 ° C para mais aplicativos.</li>
	</ol></li> <li>Concentração de PrP Sc nas fezes extrai Nota: a fim de concentrar os príons CWD nas amostras de fezes de extrato, melhorando assim a sensibilidade de detecção por RT-QuIC, é adicionado a um passo de precipitação de proteínas para o protocolo.
	<ol><li>Método de precipitação NaPTA</li> <li>Adicionar 250 µ l de 10% (p/v) de N-Lauril sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL de proteína fecal Extraia-o para dar uma concentração final de sarkosyl de 2% (v/v).</li>
		<li>Selar os tubos que contêm as amostras com parafilm e incubam a 37 ° C por 30 min sob agitação constante a 1.400 rpm em um thermomixer.</li>
		<li>Ajustar a mistura de extrato de proteína fecal e sarkosyl com uma solução contendo 10% (p/v) de ácido fosfotúngstico de sódio e 170 mM de cloreto de magnésio, pH 7,4 para obter uma concentração final de 0,3% (p/v) o ácido fosfotúngstico de sódio nas amostras.</li>
		<li>Incubar as amostras a 37 ° C por 2 h com agitação constante a 400 rpm.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 14 ° C por 30 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.</li>
		<li>Lavar as pelotas por resuspending-los em tampão de lavagem (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,5% Triton-X100, EDTA 10 mM, 0,5% de sódio Deoxycholate do (w/v) e 0.1% sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 14 ° C por 15 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas em 100 µ l (1/10 do volume original da proteína fecal extrair) de tampão de diluição QuIC-RT. 
		Nota: RT-QuIC tampão de diluição (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 130 mM NaCl, SDS 0,1% (p/v) e 1 X N2 suplemento) é preparado antes da utilização. Um volume total de 10 mL é filtrado através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e em seguida, armazenado a-20 ° C até o uso.</li>
		<li>Armazenar as amostras de NaPTA Tratado a-20 º C até utilizá-las no ensaio de RT-QuIC.</li>
	</ol></li> <li>RT-QuIC ensaio <ol><li>Prepare uma solução stock de 10mm fresco Th-T (0,032 g de Th-T em 10 mL de água destilada dobro H 2 O).</li>
		<li>Fazer uma diluição de 01:10 da solução estoque em dobro destilada H 2 O para fazer uma concentração final de Th-T de 1 mM o filtro através de uma seringa de acrodisc 0,2 µm filtro usando uma seringa Th-T.</li>
		<li>Descongelar o rato recombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL por reação de RT-QuIC) armazenado a -80 ° C no Ice.</li>
		<li>Carga 500 µ l de substrato rPrP cada vez em 100 kDa tamanho microtubos de filtro de exclusão e centrifugação a 14.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente (um tubo/filtro pode ser usado até duas vezes).</li>
		<li>Transferir o substrato eluted em um tubo estéril de 1,5 mL e mantê-lo em 4 ° C até o uso.</li>
		<li>Tampão de diluição descongelar RT-QuIC armazenado a -20 ° C.</li>
		Tampão de diluição de <li>fazer diluições das sementes (extracto de proteína fecal) QuIC-RT: 
		Amostra não diluída: use o extrato de proteína fecal sem diluir diluído a 2 x 10 -1 diluído a 2 x 10 -2 diluído a 2 x 10 -3</li> <li>preparar soluções estoque para RT-QuIC mistura reacional: tampão fosfato salino ( PBS): 5 X NaCl: solução de NaCl preparada em água destilada dobro H 2 O. o estoque 2 M 
		100 mM de EDTA: solução de EDTA preparado em dobro destilada H 2 O.</li>
		<li>Antes da utilização de todas as soluções (etapa 1.3.8), filtrar cada solução separadamente através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e mantê-los estéril à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar um volume total da mistura de reação RT-QuIC de acordo com o número de amostras (98 volume µ l de reação por amostra e quatro repetições por amostra) a ser usado, acrescido de 10% desse volume, para ter certeza de ter bastante mistura para todas as reações.
		<ol><li>Uso um tubo de 15 mL para preparar a mistura de reação QuIC-RT (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 300 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, substrato de rPrP 10 µ g/mL e água bidestilada para ajustar a concentração final rPrP na reação) usando o sol estoque utions.</li>
			<li>Misture todas as soluções bem pipetando subindo e descendo com uma pipeta com uma ponta do filtro. Evitar, tanto quanto possível, o uso de vórtice.</li>
			<li>Despeje a mistura em um reservatório de pipetagem descartáveis de 50 mL.</li>
			<li>Usar uma pipeta multicanal para carregar 98 µ l da mistura de reação RT-QuIC em cada poço de uma placa de 96 poços óptica inferior.</li>
		</ol></li> <li>Adicionar para cada RT-QuIC µ l de reação 2 de não diluído ou extrato de proteína fecal serialmente diluída 10 vezes. Teste cada amostra em quatro repetições. 
		Nota: Em cada experimento, diluições em série de amostras fecais (variando de não diluído a 2 x 10 -3) de CWD-negativo e verificadas CWD-positivo de animais são usadas como controles positivos e negativos, respectivamente.</li>
		<li>a placa com uma fita de vedação do selo antes da incubação em um leitor de placas a 42 ° C para 25 h com ciclos repetidos de 1min dupla orbital tremendo (700 rpm) e 1 min descansando durante a incubação.</li>
		Definir configurações de medição de fluorescência de <li>: 
		Excitação: 450 nm emissão: 480 nm ler, de fundo número de flashes: 20 ganho Manual: 1000 (dependendo da máquina) tempo de integração: 20 µs</li> <li>retirar a placa do leitor de placa no final da 25 h.</li>
		<li>Spin para baixo a placa a 3.000 x g por 3 min evitar a potencial contaminação entre os poços.</li>
		<li>Remover o selo da placa de.</li>
		<li>Prepare uma nova placa de 96 poços, acrescentando 90 µ l da mistura de reação RT-QuIC contendo substrato fresco e fresca fluorescência tingir Th-T conforme descrito na seção 1.3.1 a 1.3.6.</li>
		<li>Placa de transferência 10 µ l de cada poço da placa de primeira para o 96 recém preparado bem.</li>
		<li>a nova placa do selo e continuar o ensaio QuIC-RT para adicional h 50 seguindo os passos descritos na etapa 1.3.13. Esta etapa adicional de 50 h vai fazer o tempo de reação total de 75 h. 
		Nota: Todos os procedimentos de ensaio de RT-QuIC são feitos sob o armário de biossegurança.</li>
		<li>Coleta de dados.
		<ol><li>Leitura e documento do sinal de fluorescência do Th-T de cada poço a cada 15 min.</li>
			<li>Coletar dados dos ciclos totais usando software de análise de dados e a transferência para uma planilha com a média de reações quadruplicate.</li>
			<li>Plotar as médias dos dados. O eixo x corresponde ao tempo de reação de RT-QuIC (h) e o eixo y corresponde as unidades de fluorescência relativo (RFU). Cada curva corresponde a uma diluição de uma amostra conhecida.</li>
			<li>Em cada experimento, demarcar um limite, calculando-se os valores médios mais elevados do controlo negativo, mais 5 desvios-padrão, conforme descrito na atual publicado literatura 41. 
			NOTA: Todas as réplicas que cruzaram o limiar definido são consideradas positivas. Se pelo menos duas das quatro repetições cruzar o limiar, a amostra é então considerada positiva.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Purificação da proteína príon de recombinante (rPrP) <ol><li>crescimento de estoque bacteriana e expressão de rPrP Nota: A Escherichia coli (e. coli) COE Rosetta (DE3) transformada com o vetor de pET-24 codificação a mouse PrP (resíduos 23-231) foi usado para preparar o rPrP.
	<ol><li>Descongelar o estoque de glicerol de Rosetta (DE3) transformada com animal de estimação-24 mPrP(23-231) na Ice.</li>
		<li>Raia LB (Luria Bertani) placas com uma concentração final de canamicina de 50 µ g/mL e incuba durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C. Certifique-se que as placas são de cabeça para baixo para evitar a condensação de umidade na mídia sólida contendo as bactérias. Prepare duas placas para certificar-se de ter crescimento em pelo menos uma das duas placas.</li>
		<li>Preparar 1 L de LB e autoclave para torná-lo estéril.</li>
		<li>Suplemento 1 L de estéril LB mídia com 1 mL de canamicina (50 mg/mL) e 1 mL de cloranfenicol (34 mg/mL).</li>
		<li>Escolher uma colônia de cada placa, usando um loop de inoculação descartável para inocular 3 mL de meio LB contendo canamicina e cloranfenicol.</li>
		<li>Lugar da miniculturas em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 225 rpm para 5-6 h.</li>
		<li>Adicionar as miniculturas para o resto do original 1 l de LB mídia juntamente com Express 1 de sistema Autoinduction para indução da expressão da proteína.</li>
		<li>Lugar da cultura no frasco de 2 L, ou maior, em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 20-24 h.</li>
		<li>Dividir a cultura de 1L em tubos de centrífuga de 4 x 250 mL.</li>
		<li>Spin para baixo os tubos contendo a cultura a 3.750 x g por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e coletar as pelotas bacterianas em tubos de centrífuga de 50 mL e, em seguida, congelá-los a-80 ° C até o processamento adicional. As pelotas resultantes pesar 3 a 4 g para um rendimento de proteína boa.</li>
	</ol></li> <li>Preparação do corpo de inclusão <ol><li>descongelar a pelota congelada (3 a 4 g) a 37 ° C por alguns minutos.</li>
		<li>Congelar a pelota, mais uma vez para 10 min a-80 ° C e descongelar novamente. Repita essa etapa de congelamento e degelo mais duas vezes.</li>
		<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 1 X reagente de lise (por exemplo, BugBuster Master Mix) pipetando completamente. Use 5 mL do reagente para 1G de pelota bacteriana. Certifique-se de homogeneizar completamente o mix.</li>
		<li>Incubar o homogeneizado em um balancim por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Descartar os sobrenadantes derramando cuidadosamente la fora</li>
		<li>Homogeneizar as pelotas do mesmo volume de reagente de Lise como usado na etapa anterior de 1x.</li>
		<li>Incubar o homogeneizado por 15 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar um volume suficiente de 01:10 (0.1 x) reagente de Lise para obter um volume total homogeneizado de 40 mL. Misture por inversão para certifique-se de homogeneizar bem.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 7.900 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante derramando cuidadosamente la</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 40 mL de 0.1 x reagente de Lise.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 16.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante cuidadosamente por coloca-lo e armazenar a pelota contendo os corpos de inclusão a-20 º C até posterior processamento.</li>
	</ol></li> <li>Purificação da proteína <ol><li>descongelar os corpos de inclusão à temperatura ambiente.</li>
		<li>Dissolver os corpos de inclusão descongelados em 14 mL de 8m guanidina-HCl (cloridrato de guanidina g 38 em 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e o preenchimento da suspensão com H 2 O a 50 mL; não ajustar o pH a solução final) para solubilizar proteínas.</li>
		<li>Certifique-se de homogeneizar bem pipetando para cima e para baixo.</li>
		<li>Incubar o lisado sobre um roqueiro à temperatura de 50 min.</li>
		<li>Preparar 18 g de resina Ni-NTA grânulos (18 g para pellet bacteriana de 3 a 4 g); enxaguá-los com 100 mL de água usando a vácuo e um filtro garrafa-top 100 mL 0,22 µm.
		<ol><li>Coloque a 18 g de grânulos de resina Ni-NTA em tubo de 50 mL e adicionar um volume suficiente de desnaturação buffer (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) para fazer o volume final de 50 mL.</li>
			<li>Equilibrar as contas no buffer de desnaturação por 50 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugar o corpo de inclusão lisado a 16.000 x g por 5 min remover os resíduos insolúveis.</li>
		<li>Adicionar o sobrenadante para os grânulos equilibrados e descartar as pelotas.</li>
		<li>Colocar a mistura sobre um roqueiro para 40 min à temperatura ambiente para permitir a ligação às proteínas a resina Ni-NTA. 
		Nota: Grânulos de Quelato de níquel são usados para purificar o PrP por sua afinidade de níquel. A região N-terminal de histidina-rica de PrP processa a afinidade para nickel(II), que permite que a proteína ligar ao níquel íons sem qualquer marca de sua-.</li>
		<li>FPLC de lavagem com água para limpar para fora as duas linhas (A e B).</li>
		<li>Executar o buffer de desnaturação (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) através de ambas as linhas (A e B) para aprontar o sistema (a coluna ainda não está ligada.)</li>
		<li>Carregar a resina na coluna. Certifique-se de minimizar as bolhas de ar.</li>
		<li>Unir a coluna para o FPLC e executar um gradiente linear de 100% desnaturação de tampão A e 0% de redobramento buffer B (fosfato de sódio de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) em primeiro lugar para 0%, tampão de desnaturação e 100% dobrar tampão até o final. Esta mudança gradual é executada em uma taxa de fluxo de 0,75 mL/min para 240 min e é necessária para a adequada de dobramento de PrP. 
		Nota: Durante o processo de purificação cromatográfica, o PrP desnaturado é primeiro lentamente novamente sobre a resina através da aplicação de um gradiente linear de redobramento reserva para substituir o buffer de desnaturação. Esta etapa também remove o guanidina-HCl caotrópicas.</li>
		<li>Certifique-se de buffer de redobramento 100% continua a fluir através da coluna para um adicional 30 min em 0,75 mL/min.</li>
		<li>Lavagem linha A com água, seguida de tampão de eluição (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, imidazol 500 mM, pH 5,8) ignorando a coluna. Isto irá limpar o buffer de desnaturação, que foi substituído agora pelo tampão de eluição no sistema AKTA.</li>
		<li>Proteína Elute em 2 mL/min, executando um gradiente linear de 40 min de 100% reenovelamento buffer B e tampão de eluição de 0% A primeiro para 0% dobrar buffer e tampão de eluição de 100%. 
		Nota: A alta concentração de imidazol em tampão de eluição competirão PrP &#39; ligação de s para o nickel(II). O pico principal proteína deve começar a eluir cerca de 1/3 do caminho através do gradiente.
		<ol><li>Assistir o cromatograma para OD 280 nm aumentar a.</li>
		</ol></li> <li>Coletar apenas os tubos que contêm a proteína no centro do grande pico. 
		Nota: As frações eluted de 2 mL cada são coletadas em tubos de 15 mL.</li>
		<li>Diluir a proteína contida nos tubos imediatamente com volume de aproximadamente 1/3 (1ml) do buffer de diálise (fosfato de sódio de 10 mM, pH 5,8).</li>
		<li>Imediatamente, coloque os tubos no Ice.</li>
		<li>Piscina a proteína eluted contida nos tubos.</li>
		<li>Pobre a proteína em diálise Cassettes (peso molecular de corte 10 kDa).</li>
		<li>Colocar as fitas no buffer de diálise pre-refrigerados (3,6 L) por 2 h a 4 ° C e, em seguida, transferir as fitas em um buffer de diálise fresco (3,6 L) para a noite. Fazer Se o buffer de diálise está sob constante agitação.</li>
		<li>Filtrar proteína após diálise através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc utilizando uma seringa.</li>
		<li>Medir a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA.</li>
		<li>Concentrado ou diluir se necessário para ajustar a concentração de proteína para 0,3 mg/mL. 
		Nota: Confirmar a pureza por SDS-PAGE e coloração de azul de Coomassie.</li>
		<li>Fazer alíquotas de 1 mL de proteína em tubos microcentrifuga e imediatamente armazenar a-80 ° C até nova utilização, conforme descrito no protocolo de RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

RT-QuIC anteriormente foi empregado para detectar os príons CWD em urina e fezes extractos de infectados oralmente cariacu e veado-mula 38. O sistema mostrado neste manuscrito é um método adaptado do ensaio QuIC-RT. Etapas adicionais foram incorporadas o ensaio de RT-QuIC "clássico" para melhorar a detecção e a sensibilidade do ensaio para príons CWD em material fecal de animais infectados.
A baixa sensibilidade da deteção em extractos de fezes nos levou para o aprimora...

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos 1,2. EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de "proteína apenas", príons são principalmente compostos de PrPSc ('Sc' para o tremor epizoótico) 3, uma isoforma misfolded da proteína príon celular codificado anfitrião, PrPC. PrPSc resulta da conversão de PrPC em uma conformação enriquecida em ᵦ-folhas 4,5,6 , que pode atuar como uma semente para vincular e converter outras moléculas de PrPC . As moléculas de PrPSc recém-gerado são incorporadas em um crescente polímero 7,,8 que invade oligômeros menores, resultando em maior número de núcleos infecciosos. PrPSc é propenso a agregação e é parcialmente resistente às proteases 9,10.
CWD afeta alces selvagens e de criação (Cervus canadensis), veado (Odocoileus hemionus), cariacu (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e Rena (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. É considerada a mais contagiosa doença de Creutzfeld-Jacob com transmissão horizontal favorecido por cervídeos provenientes interações e persistência ambiental de infecciosidade 14,15. Ao contrário de outras doenças de príon onde PrPSc acumulação e infecciosidade estão confinados ao cérebro, em CWD estas também são encontradas em tecidos periféricos e fluidos corporais, por exemplo, saliva, urina e fezes 16,17, 18.
Imuno-histoquímica é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico CWD detectar a distribuição de PrPSc e espongiforme lesões 19,20. ELISA e em casos mais raros, borrão ocidental também são usados para diagnóstico CWD. Assim, o atual diagnóstico de doença de príon é baseado principalmente na detecção de príons em tecidos post-mortem. Diagnóstico ante mortem por CWD está disponível por tirar as amígdalas ou biópsias de tecido linfoide associado a mucosa reto-anal (RAMALT); no entanto, este procedimento é invasivo e requer a captura dos animais. Assim, o uso de amostras facilmente acessíveis, tais como urina e fezes, seria uma maneira prática para a deteção de príons CWD. No entanto, esses harbor excreções relativamente baixa concentrações dos priões abaixo do limite de detecção dos métodos de diagnóstico atuais. Por conseguinte, uma ferramenta diagnóstica mais sensível e alta taxa de transferência é necessária. Em vitro sistemas de conversão, tais como proteína enrolamento amplificação cíclica do ensaio (PMCA) 21, amiloide semeadura do ensaio e conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC) ensaio 22,23, 24 são ferramentas muito poderosas para explorar a capacidade auto-propagação de PrPSc de imitar em vitro o processo de conversão de príon e, assim, ampliar a presença de quantidades minuciosas de PrPSc para níveis detectáveis 25 ,26. O método de RT-QuIC, no entanto, tira proveito do fato de que o produto de conversão enriquecido em estrutura secundária de β-folha especificamente pode ligar thioflavin T (Th-T). Portanto, o PrP recombinante (rPrP) mediante conversão semeado cresce em amiloides que ligam Th-T e, portanto, podem ser detectados em tempo real através da medição de fluorescência do Th-T expressada em unidades de fluorescência relativo (RFU) ao longo do tempo. Uma vez controlada, a RFU pode ser usada para avaliar atividades de semeadura relativas e parâmetros quantitativos como a fase de retardo. A fase de retardo representa o tempo necessário para atingir o limiar, durante a qual rPrP conversão a fase inicial da reação é abaixo do limite de detecção de fluorescência Th-T (h). O fim da fase de aparente defasagem, concomitante à formação de um núcleo de amiloide suficiente (nucleação/alongamento), ocorre quando a fluorescência de Th-T excede o nível de limiar e torna-se positivo. O crescimento das fibrilas podem ser detectadas em tempo real e a inicial do PrPSc ou semeadura atividade contida na amostra de amiloide é amplificado por segmentação que gera mais sementes. Estas sementes, por sua vez induzem uma rápida fase exponencial de crescimento de fibra amiloide.
Porque este ensaio é capaz de detectar tão baixo quanto 1 fg de PrPSc 24, a alta sensibilidade qualifica esta técnica para conseguir ante mortem ou diagnóstico não-invasivo, detectando PrPSc em vários tecidos periféricos, excreções ou outros tipos de amostra, abrigando os baixos níveis de infecciosidade. RT-QuIC definitivamente fornece vantagens sobre outros ensaios para sua reprodutibilidade, praticidade, rapidez (menos de 50 h) e baixos custos em comparação com os bioensaios. Evita as complexidades técnicas tais como sonication usado em PMCA; Além disso, ela é realizada em uma microplaca de fita-selado que minimiza o risco de contaminação de aerossol de cada poço. O formato multi bem permite a análise de até 96 amostras no mesmo experimento. Para combater o problema recorrente de falsos positivos e conversão espontânea de rPrP nos ensaios de conversão em vitro , a implementação de um limiar (cut-off) em RT-QuIC é muito útil. De fato, baseado nos resultados do controlo negativo (RFU média de amostras negativas + 5 SD 27), uma linha de base é configurada do qual seja possível discriminação entre amostras positivas e negativas. O uso de quatro repetições para cada amostra, portanto, pode ajudar a definir uma amostra como positivo quando pelo menos 50% de repetições a mostrar um sinal positivo, ou seja, cruzar o disco de corte 28. A homologia entre Sementes e substrato não é necessária no RT-QuIC, como por exemplo, em um estudo anterior, hamster rPrP foi encontrado ser um substrato mais sensível em relação ao substrato homólogas em humanos PrPvCJD semeado e tremor epizoótico ovelhas semeado reações 29. hamster-ovelha quimérico rPrP sugeriu-se também para ser um substrato mais adequado do que rPrP humano para detectar CJD variante humana priões 30. Assim, o uso de substratos rPrP de diferentes espécies é muito comum neste ensaio. Este ensaio tem sido aplicado com êxito a várias doenças de príon, como esporádicos DCJ 31,32,33, gendoenças de príon ETIC 34, BSE 35,36,37, 23,de tremor epizoótico36e CWD 38,39,40,41, 42. Estudos utilizando processados líquor, sangue, saliva e urina como sementes em RT-QuIC foram todos bem sucedidas para detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. para fomentar a capacidade de deteção em amostras de plasma de sangue que podem conter inibidores da formação de amiloide, Orrú et al. (2011) desenvolveu uma estratégia para remover potenciais inibidores da formação de amiloide penteando PrPSc passo de imunoprecipitação (IP) e RT-QuIC, chamado "reforçada QuIC" ensaio (eQuIC). Além disso, uma etapa de substituição do substrato foi empregada após ~ 24 h de tempo de reação a fim de melhorar a sensibilidade. Em última análise, como baixa como 1 ag de PrPSc era detectável por eQuIC 30.
Fim de extratos de fezes de purificar e remover inibidores possível ensaio nas fezes, amostras fecais coletadas em estágios pré-clínicos e clínicos de elk após infecção oral experimental foram homogeneizadas em tampão contendo detergentes e inibidores de protease. Os extratos de fezes mais foram submetidos a diferentes metodologias para concentrar o PrPSc nas amostras utilizando a precipitação de proteínas através da precipitação do sódio fosfotúngstico ácida (NaPTA). O método de precipitação de NaPTA, primeiramente descrito por Safar e col 43, é usado para concentrar o PrPSc em amostras do teste. A incubação de NaPTA com a amostra resulta em precipitação preferencial do PrPSc ao invés de PrPC. No entanto, o mecanismo molecular é ainda incerto. Esta etapa também ajudou a contendo e impedindo a conversão espontânea de rPrP, que é observado em alguns casos. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC usando rPrP rato (aa 23-231) como substrato e incluindo substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção.
Aqui os resultados demonstram que este método melhorado pode detectar concentrações muito baixas de príons CWD e aumenta a sensibilidade de detecção e especificidade em amostras fecais em comparação com um protocolo sem substituição de precipitação e substrato de NaPTA. Potencialmente, este método pode ser aplicado a outros tecidos e fluidos corporais e pode ser de grande utilidade para vigilância CWD em cervídeos, selvagens e em cativeiro.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa Acrodisc</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Unidade de filtro centrífugo</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringe de 10 ml</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning filtros de vácuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de guanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani (LB)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Suplemento Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroilsarcosina sal de sódio (sarkosyl)</td><td>Dispositivos centrífugos Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep com membrana ômega 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>fitas de vedação Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido inibidor de protease</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4693159001</tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de fosfotungstato de sódio (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hidroxi-Metil-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Buffers e soluções comerciais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Superfluxo Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPura</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários </td></tr><tr><td>Padrões e kits comerciais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Sistema de Autoindução 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Configuração do equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA sistemas de purificação de proteínas FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Avanti J-25</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>Sofware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Análise de dados MARS</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons cwd em material fecal

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrPSc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrPSc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Os extratos fecais CWD preparados em 10% (p/v) foram capazes de reação de RT-QuIC de sementes, ainda a sensibilidade da deteção era baixa 27. Usar uma reserva específica para homogeneização fecal foi um passo fundamental para evitar a fluorescência de fundo elevado em RT-QuIC reações concomitantes ao uso de substrato de rato rPrP ao invés de veado rPrP que permitiu para obter mais específico resulta 27. A adição de NaPTA precipitação reduzid...

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

O objetivo geral deste protocolo para ensaio de conversão induzida por tremores em tempo real é permitir a detecção sensível de príons de doença debilitante crônica em amostras fecais de cervídeos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa da CWD, como quando os príons da CWD cervídeos são infectados nas fezes. A principal vantagem dessa técnica é que ela é específica, sensível e permite alto rendimento de amostras.Demonstrando o procedimento estará Ginny Cheng, uma técnica de laboratório do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione um grama de material fecal a um tubo contendo 10 mililitros de tampão de extrato de fezes. Usando um dissociador com um programa predefinido para proteínas, homogeneizar os pellets fecais por um minuto à temperatura ambiente.Repita isso duas a três vezes até que as amostras fecais estejam completamente homogeneizadas. Em seguida, use o parafilme para selar os tubos e coloque-os em uma plataforma de balanço ou agitador rotativo para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a 18.000 g por cinco minutos em temperatura ambiente.Recolher os sobrenadantes e alíquota para tubos de 1,5 mililitros. Armazene a 80 graus Celsius negativos até a hora de usar. Para iniciar o método de precipitação do ácido fosfotúngstico de sódio, adicione 250 microlitros de sarkosyl a um mililitro de extrato de proteína fecal.Usando parafilme, sele o tubo. Coloque o tubo em um misturador térmico e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação constante a 1.400 rpm. Em seguida, adicione uma solução estoque contendo 10% de ácido fosfotúngstico de sódio e cloreto de magnésio 170 milimolar, de modo que a concentração final de ácido fosfotúngstico de sódio nas amostras seja de 3% Transfira as amostras para o misturador térmico e incube a 37 graus Celsius por duas horas com agitação constante a 400 rpm.Em seguida, centrifugue a 15.800 g por 30 minutos a 14 graus Celsius. Remova cuidadosamente os sobrenadantes e lave os pellets ressuspendendo-os no tampão de lavagem. Em seguida, centrifugue a 15.800 g por 15 minutos a 14 graus Celsius.Remova cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de diluição RT-QuIC. Armazene as amostras tratadas a menos 20 graus Celsius até que estejam prontas para realizar o ensaio RT-QuIC. Para começar, adicione 0,032 gramas de tioflavina T a 10 mililitros de água bidestilada para preparar uma solução estoque de tioflavina T fresca de 10 milimolares.Em seguida, use água bidestilada para fazer uma diluição de um a 10 da solução estoque, resultando em uma concentração final de um milimolar de tioflavina T. Usando uma seringa equipada com um filtro de disco Acro de 0,2 micrômetro, filtre a solução milimolar de tioflavina T. Em seguida, descongele o substrato de proteína príon mais recombinante. Carregue 500 microlitros de substrato de proteína príon recombinante de cada vez em microtubos de filtro de exclusão de tamanho Dalton de 100 quilos.Centrifugar a 14 000 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois disso, transfira o substrato eluído para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Armazene a quatro graus Celsius até a hora de usar.Em seguida, descongele o tampão de diluição RT-QuIC armazenado. Diluir a semente e preparar as soluções-mãe e a mistura de reacção RT-QuIC conforme descrito no protocolo de texto. Usando uma pipeta com uma ponta de filtro, misture a mistura de reação pipetando para cima e para baixo.Despeje a mistura em um reservatório de pipetagem de descarte de 50 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, carregue 98 microlitros de mistura de reação RT-QuIC em cada poço de uma placa inferior óptica de 96 poços. Para cada reação, adicione dois microlitros de extrato de proteína fecal não diluído ou 10 vezes diluído em série.Em seguida, use fita de vedação para selar a placa. Incubar em um leitor de placas a 42 graus Celsius por 25 horas com ciclos repetidos de um minuto de agitação orbital dupla a 700 rpm e um minuto de repouso durante toda a incubação. Enquanto isso, defina as configurações de medição de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto.Após 25 horas, remova a placa do leitor de placas. Gire a placa a 3.000 g por três minutos para evitar contaminação potencial entre os poços. Em seguida, remova o selo da placa.Prepare uma nova placa adicionando 90 microlitros de mistura de reação RT-QuIC contendo substrato fresco e corante de fluorescência T de tioflavina fresco. Transfira 10 microlitros de cada poço da primeira placa para a placa de 96 poços recém-preparada. Use fita de vedação para selar a nova placa.Depois de definir as configurações de medição de fluorescência, continue o ensaio por mais 50 horas. Leia e documente o sinal de fluorescência da tioflavina T para cada poço a cada 15 minutos. Em seguida, colete e plote os dados conforme descrito no protocolo de texto.Neste estudo, o material fecal de alces ou veados-mula não infectados é homogeneizado em tampão de extrato de fezes para obter uma concentração final de amostra de 10%Alguns homogeneizados são então processados e 10 vezes concentrados por precipitação de ácido fosfotúngstico de sódio. Embora uma redução das conversões espontâneas seja observada em amostras purificadas, todas as amostras mostraram baixos sinais de fluorescência em amostras fecais positivas para CWD. Para melhorar a amplificação de príons e aumentar a sensibilidade de detecção, uma etapa de substituição de substrato é incorporada.As amostras que foram submetidas à substituição de substrato como parte do protocolo RT-QuIC mostram um aumento na sensibilidade e especificidade da detecção, com 14 das 18 amostras sendo positivas e nenhum dos controles negativos sendo registrados como falso positivo. Uma vez dominado, a preparação do extrato fecal e a concentração de PRP/SCRP podem ser feitas em cerca de quatro horas e o ensaio RT-QuIC pode ser configurado em cerca de 1/1-2 horas se for realizado corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de filtrar o substrato, mas nunca o vórtice.Após o procedimento, outros métodos, como western blotting, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como a resistência das proteases aos produtos resultantes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os cientistas no campo da pesquisa de príons explorarem a presença de príons em animais vivos, testando amostras fecais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e concentrar PRP/SCRP a partir de extratos fecais e como realizar um ensaio RT-QuIC modificado para obter detecção de príon sensível e específica.Não se esqueça de que trabalhar com príons pode ser extremamente perigoso e que é importante usar EPIs adequados e trabalhar sob um gabinete de biossegurança durante a execução do procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Catadores têm potencial para translocam infecciosas transmissíveis prions encefalopatia espongiforme em suas fezes para áreas livres da doença. Nós métodos de detalhes usados ​​para determinar se prions de scrapie mouse adaptados permanecer infeccioso após a passagem que o trato digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), o consumidor comum de animais mortos.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Medir a barreira à transmissão interespécies de doenças priônicas é desafiador e normalmente envolve desafios em animais ou ensaios bioquímicos. Aqui, apresentamos um ensaio de conversão de proteína príon in vitro com a capacidade de prever barreiras de espécies.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

Detecção rápida e exata de patógenos no local, especialmente de solo-carregadas patógenos vegetais, é crucial para prevenir mais produção de inóculo e proliferação de doenças de plantas no campo. O método desenvolvido aqui, usando um sistema de detecção de PCR em tempo real portátil permite o diagnóstico no local em condições de campo.

Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real

Análise de reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real combinada com transcrição reversa (RT-qPCR) tem sido amplamente utilizada para medir o nível de infecções por vírus de RNA. Aqui nós apresentamos um ensaio de RT-qPCR direto, que não requer uma etapa de purificação de RNA, desenvolvida para a quantificação de vários vírus de RNA, incluindo o vírus da dengue.

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

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Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Falta um método para avaliar áreas comumente usadas em ambientes de laboratório para contaminação por príons e descontaminação eficaz. O protocolo descrito aqui fornece os principais fundamentos para a implementação de um teste de segurança de príons em laboratório que pode ser facilmente modificado para atender às necessidades individuais de laboratórios específicos.

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Aprenda a detectar príons da doença de emagrecimento crônico em amostras fecais de cervídeos usando o ensaio RT-QuIC. Este método sensível e específico permite análise em alta vazão para pesquisa em saúde animal.

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