Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal
29 de setembro de 2017
Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).
O objetivo geral deste protocolo para ensaio de conversão induzida por tremores em tempo real é permitir a detecção sensível de príons de doença debilitante crônica em amostras fecais de cervídeos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa da CWD, como quando os príons da CWD cervídeos são infectados nas fezes. A principal vantagem dessa técnica é que ela é específica, sensível e permite alto rendimento de amostras.
Demonstrando o procedimento estará Ginny Cheng, uma técnica de laboratório do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione um grama de material fecal a um tubo contendo 10 mililitros de tampão de extrato de fezes. Usando um dissociador com um programa predefinido para proteínas, homogeneizar os pellets fecais por um minuto à temperatura ambiente.
Repita isso duas a três vezes até que as amostras fecais estejam completamente homogeneizadas. Em seguida, use o parafilme para selar os tubos e coloque-os em uma plataforma de balanço ou agitador rotativo para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue a 18.000 g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Recolher os sobrenadantes e alíquota para tubos de 1,5 mililitros. Armazene a 80 graus Celsius negativos até a hora de usar. Para iniciar o método de precipitação do ácido fosfotúngstico de sódio, adicione 250 microlitros de sarkosyl a um mililitro de extrato de proteína fecal.
Usando parafilme, sele o tubo. Coloque o tubo em um misturador térmico e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação constante a 1.400 rpm. Em seguida, adicione uma solução estoque contendo 10% de ácido fosfotúngstico de sódio e cloreto de magnésio 170 milimolar, de modo que a concentração final de ácido fosfotúngstico de sódio nas amostras seja de 3% Transfira as amostras para o misturador térmico e incube a 37 graus Celsius por duas horas com agitação constante a 400 rpm.
Em seguida, centrifugue a 15.800 g por 30 minutos a 14 graus Celsius. Remova cuidadosamente os sobrenadantes e lave os pellets ressuspendendo-os no tampão de lavagem. Em seguida, centrifugue a 15.800 g por 15 minutos a 14 graus Celsius.
Remova cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de diluição RT-QuIC. Armazene as amostras tratadas a menos 20 graus Celsius até que estejam prontas para realizar o ensaio RT-QuIC. Para começar, adicione 0,032 gramas de tioflavina T a 10 mililitros de água bidestilada para preparar uma solução estoque de tioflavina T fresca de 10 milimolares.
Em seguida, use água bidestilada para fazer uma diluição de um a 10 da solução estoque, resultando em uma concentração final de um milimolar de tioflavina T. Usando uma seringa equipada com um filtro de disco Acro de 0,2 micrômetro, filtre a solução milimolar de tioflavina T. Em seguida, descongele o substrato de proteína príon mais recombinante. Carregue 500 microlitros de substrato de proteína príon recombinante de cada vez em microtubos de filtro de exclusão de tamanho Dalton de 100 quilos.
Centrifugar a 14 000 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois disso, transfira o substrato eluído para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Armazene a quatro graus Celsius até a hora de usar.
Em seguida, descongele o tampão de diluição RT-QuIC armazenado. Diluir a semente e preparar as soluções-mãe e a mistura de reacção RT-QuIC conforme descrito no protocolo de texto. Usando uma pipeta com uma ponta de filtro, misture a mistura de reação pipetando para cima e para baixo.
Despeje a mistura em um reservatório de pipetagem de descarte de 50 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, carregue 98 microlitros de mistura de reação RT-QuIC em cada poço de uma placa inferior óptica de 96 poços. Para cada reação, adicione dois microlitros de extrato de proteína fecal não diluído ou 10 vezes diluído em série.
Em seguida, use fita de vedação para selar a placa. Incubar em um leitor de placas a 42 graus Celsius por 25 horas com ciclos repetidos de um minuto de agitação orbital dupla a 700 rpm e um minuto de repouso durante toda a incubação. Enquanto isso, defina as configurações de medição de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto.
Após 25 horas, remova a placa do leitor de placas. Gire a placa a 3.000 g por três minutos para evitar contaminação potencial entre os poços. Em seguida, remova o selo da placa.
Prepare uma nova placa adicionando 90 microlitros de mistura de reação RT-QuIC contendo substrato fresco e corante de fluorescência T de tioflavina fresco. Transfira 10 microlitros de cada poço da primeira placa para a placa de 96 poços recém-preparada. Use fita de vedação para selar a nova placa.
Depois de definir as configurações de medição de fluorescência, continue o ensaio por mais 50 horas. Leia e documente o sinal de fluorescência da tioflavina T para cada poço a cada 15 minutos. Em seguida, colete e plote os dados conforme descrito no protocolo de texto.
Neste estudo, o material fecal de alces ou veados-mula não infectados é homogeneizado em tampão de extrato de fezes para obter uma concentração final de amostra de 10%Alguns homogeneizados são então processados e 10 vezes concentrados por precipitação de ácido fosfotúngstico de sódio. Embora uma redução das conversões espontâneas seja observada em amostras purificadas, todas as amostras mostraram baixos sinais de fluorescência em amostras fecais positivas para CWD. Para melhorar a amplificação de príons e aumentar a sensibilidade de detecção, uma etapa de substituição de substrato é incorporada.
As amostras que foram submetidas à substituição de substrato como parte do protocolo RT-QuIC mostram um aumento na sensibilidade e especificidade da detecção, com 14 das 18 amostras sendo positivas e nenhum dos controles negativos sendo registrados como falso positivo. Uma vez dominado, a preparação do extrato fecal e a concentração de PRP/SCRP podem ser feitas em cerca de quatro horas e o ensaio RT-QuIC pode ser configurado em cerca de 1/1-2 horas se for realizado corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de filtrar o substrato, mas nunca o vórtice.
Após o procedimento, outros métodos, como western blotting, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como a resistência das proteases aos produtos resultantes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os cientistas no campo da pesquisa de príons explorarem a presença de príons em animais vivos, testando amostras fecais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e concentrar PRP/SCRP a partir de extratos fecais e como realizar um ensaio RT-QuIC modificado para obter detecção de príon sensível e específica.
Não se esqueça de que trabalhar com príons pode ser extremamente perigoso e que é importante usar EPIs adequados e trabalhar sob um gabinete de biossegurança durante a execução do procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o método de conversão induzida por agitação em tempo real (RT-QuIC), uma técnica sensível para detectar príons da doença crônica de emagrecimento em amostras fecais de cervídeos. O método foi desenvolvido para responder perguntas fundamentais sobre a presença de príons da CWD nas fezes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre doenças priônicas
- Saúde animal
Antecedentes
- A doença crônica emagrecida (CWD) afeta cervídeos e representa preocupações ecológicas significativas.
- A detecção de príons em amostras fecais é crucial para compreender a transmissão da doença.
- O RT-QuIC é um método inovador que aumenta a sensibilidade e a especificidade na detecção de príons.
- A técnica permite a análise de alto rendimento de amostras.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para detectar prions de ECT nas fezes.
- Facilitar a pesquisa sobre o momento da eliminação de prions em cervídeos infectados.
- Aprimorar a compreensão da dinâmica da ECT em populações silvestres.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras fecais utilizando um tampão de extração de fezes.
- Homogeneização de pelotas fecais com um dissociador.
- Aplicação do ensaio RT-QuIC para detecção de príons.
- Demonstração do procedimento por um técnico de laboratório treinado.
Resultados Principais
- O método RT-QuIC detecta com sucesso príons de CWD em amostras fecais.
- O protocolo é eficiente e permite a análise de múltiplas amostras simultaneamente.
- Os resultados indicam que é possível determinar o momento da presença de príons nas fezes.
- O método apresenta alta especificidade e sensibilidade em comparação com técnicas tradicionais.
Conclusões
- RT-QuIC é uma ferramenta valiosa para a pesquisa e monitoramento da ECT.
- O protocolo pode aprimorar a compreensão da dinâmica dos príons em cervídeos.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar as vias de transmissão dos príons.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção da eliminação de príons em material fecal permite a vigilância não invasiva da doença crônica de emagrecimento em populações silvestres, apoiando estratégias de intervenção precoce. O ensaio RT-QuIC fornece um método de alta produtividade, específico e sensível para identificar a atividade de nucleação de príons, o que é essencial para compreender a dinâmica de transmissão e orientar decisões de manejo da doença. Essa abordagem reduz a dependência de amostragens invasivas e aumenta a escalabilidade para programas de monitoramento em larga escala em aplicações de pesquisa e saúde da fauna.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da atividade de nucleação de príons como biomarcador para a presença da doença em estágios pré-clínicos e clínicos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de métodos de detecção de príons utilizando matrizes de amostras não invasivas.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de fluorescência por meio do Thioflavin T para monitorar a formação de amiloides em tempo real.
- Valor Operacional: Facilita a padronização do ensaio por meio da preparação padronizada de amostras, incluindo homogeneização com detergente e precipitação com ácido fosfotúngstico.
- Valor Científico: Melhora a sensibilidade e a especificidade por meio da substituição do substrato, reduzindo o ruído de fundo e potencializando a detecção de verdadeiros positivos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo da cinética de eliminação de príons em cervídeos, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite amostragem longitudinal para acompanhar o aparecimento e a persistência de príons nas fezes ao longo das fases da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta até a preparação de ensaios para aplicações de triagem, especialmente quando é necessária a detecção não invasiva de biomarcadores.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses quanto ao momento e à frequência da liberação de príons em animais infectados.
- Triagem: Garante prontidão do ensaio por meio de etapas reprodutíveis de concentração e purificação de amostras que minimizam inibidores.
- Análise: Gera sinais quantitativos de fluorescência de Tioflavina T que permitem comparar a atividade de nucleação entre amostras e condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir a detecção em animais vivos, facilitando estudos longitudinais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para detecção de príons que pode ser adaptada a diferentes tipos de amostras e espécies mediante validação apropriada.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na detecção de príons ao reduzir falsos negativos por meio da remoção de inibidores e do realce do sinal.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de protocolos padronizados para processamento de fezes e detecção baseada em placas de 96 poços.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não prosseguir em programas de vigilância ao fornecer capacidade confiável de detecção em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco dos esforços de pesquisa com base nos padrões de eliminação de príons em populações-alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de príons, práticas de nível de biossegurança 2+ e interpretação de ensaios baseados em fluorescência.
- Depende do acesso a leitores de placa com agitação e controle de temperatura, centrífugas e filtros de exclusão por tamanho.
- Necessita padronização entre equipes para coleta, armazenamento (-80°C) e pré-tratamento de amostras, a fim de garantir consistência.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes matrizes fecais, o que pode exigir otimização da composição do tampão e das condições de precipitação.
- Inclui limitações práticas, como a variabilidade potencial na carga de inibidores entre amostras, exigindo validação empírica das etapas de purificação.
