Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas
31 de agosto de 2017
O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.
O objetivo geral deste método é purificar o DNA do vírus Herpes Simplex tipo um de células infectadas para a análise proteômica de proteínas associadas ao genoma viral. Este método fornece informações importantes sobre o envolvimento de fatores celulares e infecção pelo vírus do herpes. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser adaptada para purificar diretamente diferentes populações de DNA viral de células infectadas, permitindo a análise de múltiplos aspectos da infecção.
Comece este procedimento com a cultura de cinco células MRC, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilua o HSV-1 em solução salina fria tamponada com tris ou TBS. Para as etapas a seguir, é importante desligar o soprador e a capa de cultura de tecidos para evitar que as células sequem.
Use uma pipeta para transferir o meio de crescimento das células MRC 5 para um frasco estéril para adicionar de volta às células após a infecção. Infecte as células adicionando sete mililitros de vírus diluído às células. Balance as células a cada 10 minutos por uma hora em temperatura ambiente.
Após a absorção, aspire o inóculo, lave as células com 50 mililitros de TBS à temperatura ambiente e substitua o meio de crescimento original. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono. Após o início da replicação do DNA viral, cerca de quatro horas após a infecção, rotule o DNA viral replicante.
Para fazer isso, dilua o EdC em um mililitro de meio de crescimento e adicione-o ao meio de cultura celular das células infectadas por duas a quatro horas. Para colher núcleos, substitua o meio de crescimento por 20 mililitros de tampão de extração de núcleos e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius com balanço ocasional. Após a incubação, raspe os núcleos da placa usando um raspador de células e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo.
Centrifugue por 10 minutos a 2.500 x g e quatro graus Celsius para granular os núcleos. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Desaloje suavemente o pellet nuclear em 10 mililitros de solução salina tampão fosfato ou PBS e transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros.
Em seguida, centrifugue a amostra como antes. Depois de remover completamente o PBS, ressuspenda o pellet nuclear em 10 mililitros de mistura de reação de clique, pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 mililitros. Gire a amostra por uma hora a quatro graus Celsius, antes de peletizar os núcleos como antes.
Remova completamente a mistura de reação rápida e, em seguida, lave o pellet ressuspendendo-o suavemente em 10 mililitros de PBS e centrifugando novamente. Agora, ressuspenda cuidadosamente o pellet nuclear em um mililitro de PBS e transfira a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, remova completamente o PBS e congele rapidamente o pellet em nitrogênio líquido.
Neste ponto, o pellet pode ser armazenado a 80 graus Celsius ou o procedimento pode ser continuado. Para lisar os núcleos e fragmentar o DNA, ressuspenda os núcleos descongelados em 500 microlitros de tampão B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar a suspensão no gelo durante 45 minutos.
Em seguida, sonicar as amostras seis vezes por 30 segundos cada a 40% de amplitude, usando uma sonda de microponta de três milímetros. Coloque as amostras no gelo por pelo menos 30 segundos entre os pulsos. Após a sonicação, as amostras devem parecer claras, não turvas.
Pulverizar os restos celulares centrifugando a 14 000 x G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. O tamanho do pellet deve diminuir substancialmente, filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 100 mícrons e reter o fluxo. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão B2 ao sobrenadante filtrado.
Para ligar o DNA biotinilado a grânulos revestidos com estreptavidina, prepare os grânulos magnéticos de estreptavidina transferindo 300 microlitros de pasta de grânulos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Prepare um tubo de contas por amostra. Lave as contas três vezes com mililitro de Buffer B2 por vórtice para ressuspender, aplicando a um ímã para separar as contas e aspirando o tampão de lavagem.
Em seguida, adicione 900 microlitros da amostra às contas lavadas. O restante da amostra será usado para DNA de entrada e isolamento de proteínas. Gire a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, coloque as amostras em um suporte de tubo de microcentrífuga magnética e remova o sobrenadante. Ressuspenda suavemente os grânulos em um mililitro de tampão B2, antes de girar a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante novamente usando o suporte de tubo de microcentrífuga magnética.
Desta vez, ressuspenda suavemente as contas em um mililitro de tampão B3 e gire a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante da mistura de grânulos usando o ímã, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de tampão de amostra 2x Laemmli para aludir a complexos de proteínas de DNA. Em seguida, ferva as amostras a 95 graus Celsius por 15 minutos.
Vortex uma mistura antes de girar rapidamente as amostras em uma microcentrífuga. Aplique as amostras no ímã e transfira a colocação para um novo tubo. Finalmente, congele rapidamente as amostras e armazene-as a 80 graus Celsius.
Realize a análise de proteínas conforme descrito no protocolo de texto. A marcação EdC foi realizada por zero, 20, 40 ou 60 minutos, seguida da purificação do DNA viral e proteínas associadas. As proteínas eluídas foram submetidas à coloração azul de coomassie e western blotting com o anticorpo específico para proteínas de ligação ao DNA viral, ICP4 e UL42.
A seta indica estreptavidina que foi retirada das contas durante a eluição, que está presente em todas as condições. As proteínas isoladas por este método são então submetidas à espectrometria de massa. O gráfico de pizza ilustra o número de proteínas em cada categoria funcional que foram associadas ao tipo de vírus Herpes Simplex nos genomas seis horas após a infecção.
Um olhar mais atento às interações proteína-proteína entre as proteínas identificadas foi realizado usando o banco de dados da rede de associação de proteínas funcionais da corda. Os resultados revelam subcomplexos de proteínas que funcionam juntas no mesmo processo biológico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar o DNA viral de células infectadas para a investigação proteômica de proteínas associadas ao genoma viral.
Esta técnica pode ser concluída em três a quatro dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar precauções para evitar a contaminação por DNAse ou protease das amostras. Além desse procedimento, outros métodos, como imunofluorescência, podem ser realizados para verificar a natureza do DNA viral marcado com EdC.
Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da virologia do herpes explorarem as funções das proteínas do hospedeiro e da infecção viral.
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Visão Geral
Este protocolo tem como objetivo purificar o DNA do vírus Herpes simples tipo um de células infectadas para a análise proteômica de proteínas associadas ao genoma viral. Ele fornece informações sobre o papel dos fatores celulares na infecção pelo vírus Herpes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Proteômica
- Biologia Celular
Contexto
- O vírus do herpes simples tipo um (HSV-1) é um patógeno viral comum.
- Compreender as proteínas associadas ao genoma viral é crucial para o desenvolvimento de terapias.
- Fatores celulares desempenham um papel significativo na dinâmica da infecção viral.
- Os métodos atuais para isolamento de DNA viral podem ser aprimorados quanto à especificidade e eficiência.
Objetivo do Estudo
- Isolar o DNA viral de células infectadas.
- Analisar as proteínas associadas ao genoma viral.
- Adaptar o método para diferentes populações de DNA viral.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células MRC cinco.
- Diluição do HSV-1 em solução salina tamponada com tris (TBS) fria.
- Desligamento do exaustor na capela de cultura de tecidos para evitar a secagem das células.
- Seguimento de um protocolo detalhado para as etapas de purificação.
Resultados Principais
- Purificação bem-sucedida de DNA do HSV-1 a partir de células infectadas.
- Identificação de proteínas associadas ao genoma viral.
- Compreensão das interações entre fatores celulares e infecção viral.
- Adaptabilidade do método para diversas populações de DNA viral.
Conclusões
- O método isola efetivamente o DNA viral para análise proteômica.
- Ele melhora a compreensão dos mecanismos de infecção viral.
- Aplicações futuras podem incluir a identificação de alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A purificação direta do DNA do HSV-1 a partir de células infectadas permite a identificação abrangente de proteínas virais e hospedeiras associadas aos genomas virais em replicação. Essa capacidade impulsiona a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na interface entre virologia e proteômica, apoiando a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. A adaptabilidade do método a outros vírus de DNA o posiciona como uma plataforma reutilizável para estudos de interação vírus-hospedeiro em todo o portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de complexos proteicos em forquilhas de replicação viral para obtenção de insights mecanicistas.
- Apoia a validação funcional de alvos ao mapear associações de proteínas virais e hospedeiras com o DNA viral.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao revelar fatores celulares essenciais para os resultados da infecção.
- Oferece uma base para confiança preditiva na seleção de alvos antivirais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara complexos de DNA-viral e proteína validados para fluxos de trabalho downstream de espectrometria de massa.
- Padroniza o isolamento de DNA específico da replicação para ensaios proteômicos reprodutíveis.
- Gera dados quantitativos de associação proteica para orientar estratégias de triagem de compostos.
- Permite adaptação escalonável a diferentes populações virais ou estágios de infecção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas proteômicas com interações vírus-hospedeiro relevantes para doenças, visando a descoberta de biomarcadores translacionais.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de mecanismos antivirais.
- Reduz riscos nas decisões de avanço ao esclarecer fatores de dependência do hospedeiro na infecção.
- Fornece contexto mecanicista para a seleção e validação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e a identificação de compostos líderes, permitindo a análise direta de complexos proteicos vírus-hospedeiro e apoiando triagens subsequentes e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre interações entre genoma viral e proteínas, bem como o mapeamento de vias.
- Triagem: Fornece saídas proteômicas quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Oferece identificação e categorização baseadas em espectrometria de massa de proteínas associadas.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de proteínas virais e hospedeiras a mecanismos relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Adaptável a outros vírus de DNA e modelos de infecção, com amplo impacto em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de infecção viral.
- Valor Operacional: Padroniza a purificação de DNA-proteína viral para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e melhora a eficiência do capital na descoberta de antivirais.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos virais e fatores de dependência do hospedeiro.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em virologia, proteômica e análise de espectrometria de massas.
- Requer acesso a cultivo celular, reagentes de química click e instrumentação analítica avançada.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para prevenir contaminação e garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diferentes vírus de DNA e modelos de infecção mediante otimização do protocolo.
- Depende de manipulação cuidadosa para evitar contaminação por DNAse e protease, conforme observado no protocolo.
