Name: Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a purificar DNA viral de células infectadas para análise proteômica de proteínas associadas ao genoma viral. Este método revela o papel de fatores celulares na infecção por Herpes Simplex vírus tipo um.

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Reconhecemos a Hannah Fox pela ajuda na preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI030612.

1. cultura celular, infecção Viral e rotulação de EdC ( Figura 1) o seguinte protocolo envolve trabalhar com vírus. Por favor, consulte sua instituição &#39; protocolos de biossegurança s sobre manipulação segura de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh.
<ol><li>Trypsinize um frasco de cultura de tecidos confluente 150 cm 2 de MRC-5 células e as células de transferência para uma placa de cultura de tecido de 2 600 cm contendo 100 mL DMEM acrescido de 10% FBS. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2 para 3-4 dias para chegar a fase estacionária e Confluencia. Um prato de 2 cm de 600 confluente contém ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condição e 1 chapa para cada controle negativo correspondente. 
	Nota: Células devem alcançar a fase estacionária para inibir a replicação do DNA celular para garantir que apenas vDNA é rotulado e purificada em etapas subsequentes. 
	Nota: Cada amostra requer uma cortesia unlabeled controlo negativo preparado usando as mesmas condições de infecção e ponto de tempo sem a adição de EdC. 
	Nota: A escala versão desta experiência deve ser efectuada em tandem para testar para a rotulagem do DNA celular por imagem utilizando o crescimento de células comparáveis, infecção, EdC rotulando as condições e pontos (consulte a etapa 2).</li>
	<li>Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 em 7 mL salina de carbono frio (TBS). Remover o meio de crescimento e armazenar a 37 ° C. Para infectar, adicione o 7 mL vírus diluído para MRC-5 células e rock por 1h à temperatura ambiente. Após a adsorção, remover o inóculo, enxaguar com 50 mL temperatura TBS e substituir o original meio de crescimento. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2. Esta etapa deve ser efectuada para cada condição experimental e controlo negativo. 
	Nota: Rotulagem de EdC aumento pode ser conseguido usando mutantes de HSV-1 defeituosos para a expressão do dUTPase viral (gene UL50) e/ou glycosylase uracil (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tem baixa especificidade e pode diminuir a ativação de diversos nucleosídeos análogos 25 , 27.</li>
	<li>Genomas virais de rótulo com EdC. Siga as instruções para rotular os genomas de entrada (1.3.1.), replicação de genomas (1.3.2.), ou forquilhas de replicação viral (1.3.3).. 
	Nota: Só passo 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 deve ser realizado dependendo se entrada genomas, genomas replicadas ou forquilhas de replicação devem ser analisados em etapas subsequentes, respectivamente. 
	Nota: EdU ou f-ara EdU pode ser substituído por EdC. A toxicidade de análogos de nucleosídeos deve ser monitorizada e minimizada.
	<ol><li>Uso prelabeled ações para realizar a infecção na etapa 1.2 e vá para a etapa 2 ou 3 dentro de 4h pós infecção (hpi) para investigar replicada vDNA ( figura 1A). 
		Nota: Prepare o vírus prelabeled ações usando o protocolo descrito anteriormente, 25. Reservas de vírus devem ser passadas através de uma coluna de G-25 para remover qualquer residual EdC.</li>
		<li>Etiqueta vDNA replicação pela adição de 5-25 µM EdC para o meio de cultura celular de células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de adicionar, diluir EdC em 1 mL de meio de crescimento.</li>
		<li>Para rotular as forquilhas de replicação viral, após o início da replicação vDNA (&#8805; 4 hpi), etiqueta de pulso replicando vDNA com 5-25 µM EdC para 5 a 20 min. Para perseguir, lavar 3x com meio de perseguição contendo 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e então incubar na presença de meio de perseguição por um adicional 20-40 min ( Figura 1). 
		Nota: Pulso e chase médio deve ser incubado a 37 ° C e 5% CO 2 antes do uso. 
		Nota: Para experiências de perseguição do pulso, é importante considerar a quantidade de tempo que leva para nucleosídeos entrar na célula e ser phosphorylated antes que eles podem ser incorporados em replicação de DNA. Isso deve ser determinado empiricamente. 
		Nota: Para determinar a resolução de experimentos de perseguição de pulso, calcule a taxa de replicação viral nas condições experimentais utilizadas. Isto pode ser determinado por PCR quantitativo de genomas virais durante uma única etapa crescimento tempo curso 26. 
		Nota: Para imagens de genomas virais prosseguir para a etapa 2 e para a purificação de genomas virais prossiga para o passo 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Imagem de EdC rotulado de DNA ( Figura 2A) Nota: é útil realizar imagens em conjunto com o método de purificação do genoma viral para verificar que o DNA celular não é rotulado em experimentos. Imagem também pode ser usada para visualizar a natureza de vDNA etiquetado e validar dados de proteômica. Exemplos de DNA viral e celular, os padrões de coloração são mostrados na Figura 3.
<ol><li>Realizar infecções e EdC rotulando como indicado na etapa 1, exceto usando reduzidas condições em lamelas em um prato de cultura de tecidos de 12 poços contendo 1 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Correção de células com 1 mL 3,7% paraformaldeído em 1X PBS por 15 min no RT Após a fixação, enxaguar células 2x com 1ml 3% BSA em PBS. 
	Cuidado: Paraformaldehyde pode causar lesões graves ou permanentes. Siga as precauções de segurança. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e lamelas podem ser armazenadas a 4 ° C, na segunda lavagem por até 3 dias.</li>
	<li>Permeabilize células com 1 mL de tampão de permeabilização [ver Tabela de materiais] por 20 min à temperatura ambiente enquanto balançando.</li>
	<li>Enxaguar com 1 mL de BSA 3% e, em seguida, bloco com BSA de 3% 1 mL de PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando.</li>
	<li>Adicione 1 mL da reação clique cocktail [ver Tabela de materiais] para lamelas covalentemente conjugar Alexa Fluor 488 azida de EdC rotulado de DNA. Incube a temperatura ambiente por 30 min, enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Mancha DNA celular com 1 mL de uma diluição de 1:2,000 de Hoechst em PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Mancha com anticorpos primários e secundários, de acordo com o padrão de imunofluorescência indirecta protocolos 25. 
	Nota: VDNA rotulado colocalizes com ICP8, ICP4 ou UL42 e rotulado celular DNA colocalizes com mancha de Hoechst.</li>
	<li>Montar lamelas em slides e imagem células usando um microscópio de fluorescência. 
	Nota: Slides podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.</li>
</ol> 3. Purificação de proteínas associadas e vDNA Nota: vários aspectos deste protocolo foram adaptados de Leung et al. 22 Nota: todos os buffers e reagentes devem ser refrigerados no gelo antes da utilização e todas as etapas devem ser realizadas no gelo salvo indicação em contrário.
<ol><li>Colheita núcleos. 
	Nota: Antes de isolamento dos núcleos, formaldeído pode ser usado para a ligação cruzada proteínas para o DNA. Condições mais rigorosas de lavagem podem ser usadas durante a purificação de DNA em grânulos streptavidin-revestido. Para crcondições osslinking e lavagem ver Sirbu et al 21. <ol><li>substituir o meio de cultura com 20 mL de solução tampão de núcleos (NEB) e incube por 20 min a 4 ° C, com ocasionais de balanço. Núcleos se tornará visíveis no microscópio.</li>
		<li>Raspar núcleos da placa usando um raspador de célula e transfira para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C para núcleos de Pelotas, descartar o sobrenadante. 
		Nota: Trypan coloração azul pode ser usado para verificar o isolamento dos núcleos de células.</li>
		<li>Suavemente desalojar a pelota nuclear em 10 mL de PBS, transferir para um tubo cônico de 15 mL, pelota e por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS. 
		Nota: Núcleos podem ser congelados e o protocolo pode ser interrompido neste ponto. Para fazer isso, delicadamente Ressuspender o nuclear em 500 µ l de congelamento do buffer e incubar o tubo em um banho de gelo seco-etanol. Armazenar os núcleos congelados a-80 ° C. Antes da utilização, descongelar núcleos à temperatura ambiente, transferir rapidamente de gelo, adicionar 10 mL de PBS, pedra delicadamente para misturar, pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C e remover completamente a PBS. Núcleos de congelamento pode resultar em rendimento reduzido.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente conjugado biotina-azida de EdC rotulado vDNA.
	<ol><li>Ressuspender o pellet nuclear na reação de 10ml clique misturar [ver Tabela de materiais] suavemente pipetando acima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 mL. 
		Nota: É importante que os reagentes incluídos no mix clique reação são adicionados na ordem indicada.</li>
		<li>Rode durante 1h a 4 ° C. Enquanto roda preparar e relaxar Buffers B1, B2 e B3 [ver Tabela de materiais].</li>
		<li>Núcleos de pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover clique em mistura de reação e lavar o sedimento por suavemente resuspending em 10 mL de PBS e centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Suavemente resuspenda o pellet nuclear em 1 mL de PBS e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando a ponta da pipeta um grande furo. Núcleos de pelotas por centrifugação durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS e congelamento flash em azoto líquido. 
		Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e núcleos congelados podem ser armazenados no-80 ° C. Freeze degelo ajuda com Lise subsequente, por isso é recomendado que os núcleos ser flash congelado mesmo quando avançar para o passo 3.3 no mesmo dia.</li>
	</ol></li> <li>Lyse núcleos e fragmento de DNA.
	<ol><li>Descongelar núcleos no gelo e ressuspender em 500 µ l de Buffer B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar no gelo por 45 min.</li>
		<li>Sonicate amostras 6 vezes por 30 s cada em amplitude de 40%, usando uma sonda de microtip de 3 mm. Colocar as amostras no gelo por 30 s entre pulsos. Depois sonication, amostras devem aparecer, claro, não nublado. 
		Nota: Condições Sonication devem ser otimizadas para sonicators individuais. Para obter instruções detalhadas sobre como otimizar condições sonication referir Leung et al. 22.</li> <li>os restos da célula de pelotas por centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O tamanho da pelota deve diminuir substancialmente. Filtrar o sobrenadante através de filtro de célula 100 µM e manter o fluxo através de.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l tampão B2 a filtrada sobrenadante. 900 µ l desta amostra será usado na etapa 3.4.2.</li>
		<li>Tomar uma alíquota de cada condição para isolamento de DNA (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x solução de SDS-bicarbonato [ver Tabela de materiais]. Prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).</li>
		<li>Tomar uma alíquota de cada condição para a entrada da proteína (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x amortecedor da amostra Laemmli, congelamento em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C. utilizar na etapa 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinilado DNA para streptavidin revestido grânulos.
	<ol><li>Preparar Streptavidin T1 grânulos magnéticos Transferindo 300 µ l de chorume grânulo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare um tubo de grânulos por amostra. Lavagem de contas 3 x 1 ml de tampão B2 num Vortex para Ressuspender, aplicando um ímã para separar as contas, e aspirando o tampão de lavagem. 
		Nota: Otimizado resultado de condições no rendimento maximizado e vinculação de fundo mínimo de vinculação. Determinou-se experimentalmente que grânulos magnéticos Streptavidin T1 têm uma capacidade de ligação significativamente maior do que grânulos de agarose, bem como outros grânulos de estreptavidina e menos fundo vinculação do Streptavidin C1 grânulos ( Figura 4A ).</li>
		<li>Adicionar 900 µ l da amostra da etapa 3.3.4. aos talões lavados e rodar durante a noite a 4 ° C. 
		Nota: Fazer grânulos de vórtice não, uma vez que a amostra é adicionada a eles. 
		Nota: Se uma quantidade significativa de DNA ou proteína está isolada no controle negativo sem rótulo, esta etapa pode ser reduzida de durante a noite a 4 h para reduzir a ligação fundo.</li>
	</ol></li> <li>Lave grânulos e eluir vDNA e proteínas associadas. 
	Nota: É recomendável usar filtro dicas para as etapas restantes.
	<ol><li>Amostras de lugar em uma cremalheira do tubo de microcentrífuga magnético, remover sobrenadante, Ressuspender delicadamente em 1 mL de tampão B2, rode a 4 ° C por 5 min.</li>
		<li>Repita o passo 3.5.1 três vezes.</li>
		<li>Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga magnético, remover o sobrenadante, delicadamente Resuspenda em 1 mL de tampão B3 e rode a 4 ° C por 5 min.</li>
		<li>Mistura de grânulo transferir 100 µ l (volume de 1/10 th) para um tubo novo para isolamento de DNA acoplado. Aplicar este tubo ao ímã, remover o sobrenadante, resuspenda grânulos em 100 µ l 1 x solução de SDS-bicarbonato e prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).</li>
		<li>Aplicar o tubo contendo a mistura de grânulo de 900 µ l restantes da etapa 3.5.3. ao ímã, remover o sobrenadante e ressuspender grânulos em 50 µ l 2 x Laemmli tampão de amostra para eluir proteínas e complexos DNA-proteína.</li>
		<li>Amostras de ferver a 95 ° C por 15 min, vortex, rapidamente girar a microcentrífuga e aplicar o ímã. Eluato de transferência para um novo tubo, congelamento flash e loja a -80 ° C. 
		Nota: Bloqueios de tampão de uso para assegurar que os tubos não pop abrir enquanto ferver. 
		Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C durante várias semanas.</li>
		<li>Analisar amostras da proteína por azul de Coomassie mancha, mancha ocidental ou espectrometria de massa por procedimentos padrão 25. Resultados representativos são mostrados na Figura 4 e Figura 5. 
		Nota: Para determinar se o rendimento de proteína é suficiente para espectrometria de massa, 7,5 µ l de cada amostra é usado para análise pela coloração de azul de Coomassie e 7,5 µ l para a mancha ocidental de um representante do genoma viral associada da proteína (ICP4, ICP8 ou UL42). O mesmo volume de lysates da etapa 3.3.6. são executados ao lado de Controlarar para níveis de entrada de proteínas. A amostra restante (35 µ l) é então analisada por massa espectrometria conforme descrito anteriormente 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento de DNA <ol><li>incubar as amostras da escadaria 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h Remove uma amostra de grânulos magnéticos, se necessário.</li>
		<li>Extrair amostras com álcool de fenol: clorofórmio: isoamílico 150 µ l (PCI) e transferir a fase aquosa para um tubo novo.</li>
		<li>Extrair o restante PCI com 100 µ l Tris-EDTA (TE) e adicionar a fase aquosa para um tubo novo.</li>
		<li>Extrair amostras com álcool de clorofórmio: isoamílico 200 µ l (24:1).</li>
		<li>Purificar a fase aquosa, usando o Kit de purificação de PCR de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s. 
		Nota: O indicador de pH em Buffer PB ficará roxo quando adicionado à amostra. Adicionar 10 & #181; PH de NaOAc 3M L 5.0 para diminuir o pH da amostra.</li>
		<li>Concentração de DNA determinar usando um dados. 
		Nota: Este protocolo normalmente rende 100-400 ng grânulo-ligado DNA. Sem DNA deve ser detectado no eluído do controlo negativo no qual EdC não foi adicionado na etapa 1.3.</li>
		<li>DNA pode ser armazenado em uma baixa ligação DNA tube 4 ou - 20 ° C e pode ser usado para PCR em tempo real ou a análise do sequenciamento de alto rendimento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos etapas de colheita...

Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular interesse é identificar quais fatores e processos atuam sobre genomas virais durante todo o ciclo infeccioso.
Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é que uma dupla encalhado DNA vírus que infecta uma parte substancial da população humana. Dentro da primeira hora de infecção, o genoma viral entra no núcleo, onde uma cascata ordenada da expressão dos genes virais resulta em coordenação com viral de replicação de DNA (vDNA)1. No núcleo, genomas estão sujeitos a regulamento epigenético, passam por reparo e recombinação, em são empacotados em capsids, tal que o primeiros virions descendentes são produzidos dentro de menos de seis horas. A avaliação abrangente das proteínas do genoma viral associada ao longo do curso da infecção vai estabelecer as bases para investigar os detalhes moleculares de processos que agem sobre genomas virais e irão fornecer insights sobre quais fatores virais e celulares estão envolvidas em vários estágios de infecção.
Métodos anteriores para a investigação de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral incluem purificação da afinidade das proteínas virais para a análise de proteínas celulares associados2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estes ensaios têm sido fundamentais para a identificação de fatores celulares envolvidos em respostas antiviral de acolhimento, bem como a modificação de cromatina viral, expressão gênica, e reparo do DNA. No entanto, é difícil verificar se interações dependem da associação com vDNA e proteomics apenas fornecer insights sobre as interações que ocorrem em função de um fator viral específico. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tem sido utilizada para identificar onde as proteínas virais e celulares específicas bind para genomas virais10,11,12,13,14 , 15 e hibridização fluorescente in situ (FISH) combinado com imunocitoquímica permitiu a visualização de fatores celulares que colocalize com vDNA16,17,18, 19 , 20. estes ensaios permitem análise espacial e temporal. No entanto, as limitações incluem a necessidade de anticorpos altamente específicos, sensibilidade limitada e a necessidade de anterior insight interações hospedeiro de vírus. Portanto, desenvolvemos um método baseado na iPOND (isolamento de proteínas DNA nascente)21 e aniPOND (iPOND nativo acelerada)22 para seletivamente rotular e purificar vDNA de infectados células para a imparcial identificação do genoma viral proteínas associadas por espectrometria de massa. iPOND tem sido fundamental para a investigação da dinâmica do garfo de replicação celular.
Para a purificação seletiva de genomas virais de células infectadas, replicar vDNA é rotulado com nucleosídeos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) ou 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguido por ligações covalentes conjugação de azida de biotina, através do clique em química para facilitar a purificação de única etapa de genomas virais e proteínas associadas em grânulos streptavidin-revestido (Figura 2B). Importante, infecções são realizadas em células estacionárias, que não estão envolvidas na replicação do DNA celular para permitir a rotulagem específica de vDNA. Além disso, a infecção HSV-1 faz com que a detenção do ciclo celular e inibe de23,de replicação de DNA celular24. Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com entrada genomas virais (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B) 25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. Além disso, ethynyl-modificado vDNA pode ser covalentemente conjugado com um fluoróforo para investigação espacial da dinâmica da proteína (Figura 2A e Figura 3). Imagem permite a visualização directa de vDNA é uma abordagem complementar para a validação das interações da proteína-vDNA e pode ser adaptada para controlar genomas virais durante a infecção. Nós antecipamos que essas abordagens podem ser mais modificadas para estudar qualquer aspecto da infecção herpética, incluindo latência e reativação e estudar outros vírus de DNA. Além disso, etiquetando com uridina 5-ethynyl (UE) pode permitir para a análise do genoma viral de RNA.

<table><tbody><tr><td>Células MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituído por 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM&nbsp; (para crescimento em frascos) ou 30 mM (para crescimento em pratos) bicarbinato de sódio</td></tr><tr><td>600 cm2 placa</td><td>de cultura de tecidos Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 estoque</td><td></td><td></td><td>Estoques com títulos superiores a 1x109 PFU/mL funcionam melhor</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp; coluna (Coluna de dessalinização PD-10)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&agudo;-etinil-2&agudo;-desoxicitidina (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolva em DMSO para preparar estoque de 40 mM, alíquota e armazene a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&agudo;-desoxicitidina (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolva em água para preparar estoque de 40 mM, alíquota e armazene a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de extração nuclear (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresco (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sacarose, 0,5% Igepal)</td></tr><tr><td>Raspador de células Vidro</td><td>Bellco</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (diluir a 1x em água estéril antes de usar)</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM de estoque e armazene a 4 &deg; C por até 1 mês</td></tr> <tr><td>(+) L-ascorbato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Prepare 100 mM de estoque e armazene no gelo até o uso</td></tr><tr><td>Biotina azida</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM de estoque em DMSO, alíquota e armazene a -20 &deg; C por até 1 ano&nbsp;</td></tr><tr><td>Clique em Mistura de</td><td></td><td></td> reação <td>Prepare imediatamente antes de usar adicionando reagentes na ordem indicada (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotina Azida, 1 mL 100 mM ascorbato de sódio)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Coquetel Completo de Inibidor de Protease</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolver em 1 mL de água para preparar 50x estoque, pode armazenar a 4 &graus; C por até 1 semana, ou adicione diretamente 1 comprimido a 50 mL</td></tr><tr><td>de tampão Congelamento</td><td></td><td></td><td>Prepare fresco (7 mL 100% glicerol, 3 mL NEB, 200 &mu; L 50x inibidor de protease)</td></tr><tr><td>Tampão B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresco (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inibidor de protease)</td></tr><tr><td>Tampão B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inibidor de protease)</td></tr><tr><td>Tampão B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inibidor de protease)</td></tr> <tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipado com uma sonda microtip de 3 mm</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampão</td><td></td><td></td> de amostra Laemmli <td>Misture 400 mg de SDS, 2 mL de 100% de glicerol, 1,25 mL de 1 M Tris (pH 6,8) e 10 mg de azul de bromofenol em 8 mL de água. Armazenar em 4&nbsp; &deg; C por até 6 meses. Antes de usar, adicione 1 M DTT a uma concentração final de 200 mM.</td></tr><tr><td>Travas de tampa para tubo de 1,5 mL</td><td>Reagentes</td><td></td> de Western blotting padrão NC9679153 <td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>Kit de coloração azul coloidal</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Diluir a 3,7% em 1x PBS antes de usar</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Preparar 3% em 1x</td></tr><tr><td>PBS Tampão de permeabilização (0,5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Preparar 0,5% Triton-X 100 em 1x PBS</td></tr><tr><td>Coquetel de reação de clique - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de Imagem</td><td>Sondas Moleculares</td><td>C10337</td><td>Preparar de acordo com o protocolo do fabricante</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Preparar 10 mg/mL em água, pode armazenar a 4 &graus; C por até 1 ano</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-ICP8 de camundongo</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use uma diluição de 1:200 em 1x</td></tr><tr><td>PBS Anticorpo primário de camundongo anti-UL42 (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use uma diluição de 1:200 em 1x</td></tr><tr><td>PBS Cabra anti-camundongo 594-conjugado anticorpo secundário</td> Life <td>Technologies</td><td>a11005</td><td>Use uma diluição de 1:500 em 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr>2x solução <td></td><td></td><td>SDS-bicarb</td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Fenol:clorofórmio:álcool</td><td></td><td></td> isoamílico <td>Misture 25:24:1 pelo menos 1 dia antes de usar, armazene a 4 &deg; C no escuro</td></tr><tr><td>clorofórmio: álcool</td><td></td><td></td> isoamílico <td>Misture 24:1 pelo menos 1 dia antes de usar, armazene em temperatura ambiente no escuro</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8,0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilua para 1x antes de usar)</td></tr><tr><td>Kit de purificação Qiaquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato de sódio pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência equipado com software</td><td></td><td></td><td></td>de imagem</tr><tr><td>Microcentrífuga para tubos</td><td></td><td></td><td></td>de 1,5 mL</tr><tr><td>Centrífuga de mesa para tubos de</td><td></td><td></td><td></td>15 e 50 mL</tr><tr><td>Célula incubadora de</td><td></td><td></td><td></td>cultura</tr><tr><td>Gabinete de</td><td></td><td></td><td></td>biossegurança</tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &deg; C e 95 &graus; O</td></tr></tbody></table>

purificação de dna viral para a identificação de proteínas viral e celulares associadas

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.

O uso da química clique para a purificação do DNA de células primeiro foi realizado pelo iPOND método21. O objetivo do iPOND é purificar forquilhas de replicação celular, para a identificação de proteínas associadas. Nós adaptamos essa técnica para estudar especificamente as interações da proteína vDNA durante a infecção. Manipulação da abordagem de rotular genomas virais com EdC (Figura 1), combinadas com infecções sincronizadas, perm...

O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

O objetivo geral deste método é purificar o DNA do vírus Herpes Simplex tipo um de células infectadas para a análise proteômica de proteínas associadas ao genoma viral. Este método fornece informações importantes sobre o envolvimento de fatores celulares e infecção pelo vírus do herpes. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser adaptada para purificar diretamente diferentes populações de DNA viral de células infectadas, permitindo a análise de múltiplos aspectos da infecção.Comece este procedimento com a cultura de cinco células MRC, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilua o HSV-1 em solução salina fria tamponada com tris ou TBS. Para as etapas a seguir, é importante desligar o soprador e a capa de cultura de tecidos para evitar que as células sequem.Use uma pipeta para transferir o meio de crescimento das células MRC 5 para um frasco estéril para adicionar de volta às células após a infecção. Infecte as células adicionando sete mililitros de vírus diluído às células. Balance as células a cada 10 minutos por uma hora em temperatura ambiente.Após a absorção, aspire o inóculo, lave as células com 50 mililitros de TBS à temperatura ambiente e substitua o meio de crescimento original. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono. Após o início da replicação do DNA viral, cerca de quatro horas após a infecção, rotule o DNA viral replicante.Para fazer isso, dilua o EdC em um mililitro de meio de crescimento e adicione-o ao meio de cultura celular das células infectadas por duas a quatro horas. Para colher núcleos, substitua o meio de crescimento por 20 mililitros de tampão de extração de núcleos e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius com balanço ocasional. Após a incubação, raspe os núcleos da placa usando um raspador de células e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo.Centrifugue por 10 minutos a 2.500 x g e quatro graus Celsius para granular os núcleos. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Desaloje suavemente o pellet nuclear em 10 mililitros de solução salina tampão fosfato ou PBS e transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue a amostra como antes. Depois de remover completamente o PBS, ressuspenda o pellet nuclear em 10 mililitros de mistura de reação de clique, pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 mililitros. Gire a amostra por uma hora a quatro graus Celsius, antes de peletizar os núcleos como antes.Remova completamente a mistura de reação rápida e, em seguida, lave o pellet ressuspendendo-o suavemente em 10 mililitros de PBS e centrifugando novamente. Agora, ressuspenda cuidadosamente o pellet nuclear em um mililitro de PBS e transfira a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, remova completamente o PBS e congele rapidamente o pellet em nitrogênio líquido.Neste ponto, o pellet pode ser armazenado a 80 graus Celsius ou o procedimento pode ser continuado. Para lisar os núcleos e fragmentar o DNA, ressuspenda os núcleos descongelados em 500 microlitros de tampão B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar a suspensão no gelo durante 45 minutos.Em seguida, sonicar as amostras seis vezes por 30 segundos cada a 40% de amplitude, usando uma sonda de microponta de três milímetros. Coloque as amostras no gelo por pelo menos 30 segundos entre os pulsos. Após a sonicação, as amostras devem parecer claras, não turvas.Pulverizar os restos celulares centrifugando a 14 000 x G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. O tamanho do pellet deve diminuir substancialmente, filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 100 mícrons e reter o fluxo. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão B2 ao sobrenadante filtrado.Para ligar o DNA biotinilado a grânulos revestidos com estreptavidina, prepare os grânulos magnéticos de estreptavidina transferindo 300 microlitros de pasta de grânulos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Prepare um tubo de contas por amostra. Lave as contas três vezes com mililitro de Buffer B2 por vórtice para ressuspender, aplicando a um ímã para separar as contas e aspirando o tampão de lavagem.Em seguida, adicione 900 microlitros da amostra às contas lavadas. O restante da amostra será usado para DNA de entrada e isolamento de proteínas. Gire a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, coloque as amostras em um suporte de tubo de microcentrífuga magnética e remova o sobrenadante. Ressuspenda suavemente os grânulos em um mililitro de tampão B2, antes de girar a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante novamente usando o suporte de tubo de microcentrífuga magnética.Desta vez, ressuspenda suavemente as contas em um mililitro de tampão B3 e gire a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante da mistura de grânulos usando o ímã, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de tampão de amostra 2x Laemmli para aludir a complexos de proteínas de DNA. Em seguida, ferva as amostras a 95 graus Celsius por 15 minutos.Vortex uma mistura antes de girar rapidamente as amostras em uma microcentrífuga. Aplique as amostras no ímã e transfira a colocação para um novo tubo. Finalmente, congele rapidamente as amostras e armazene-as a 80 graus Celsius.Realize a análise de proteínas conforme descrito no protocolo de texto. A marcação EdC foi realizada por zero, 20, 40 ou 60 minutos, seguida da purificação do DNA viral e proteínas associadas. As proteínas eluídas foram submetidas à coloração azul de coomassie e western blotting com o anticorpo específico para proteínas de ligação ao DNA viral, ICP4 e UL42.A seta indica estreptavidina que foi retirada das contas durante a eluição, que está presente em todas as condições. As proteínas isoladas por este método são então submetidas à espectrometria de massa. O gráfico de pizza ilustra o número de proteínas em cada categoria funcional que foram associadas ao tipo de vírus Herpes Simplex nos genomas seis horas após a infecção.Um olhar mais atento às interações proteína-proteína entre as proteínas identificadas foi realizado usando o banco de dados da rede de associação de proteínas funcionais da corda. Os resultados revelam subcomplexos de proteínas que funcionam juntas no mesmo processo biológico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar o DNA viral de células infectadas para a investigação proteômica de proteínas associadas ao genoma viral.Esta técnica pode ser concluída em três a quatro dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar precauções para evitar a contaminação por DNAse ou protease das amostras. Além desse procedimento, outros métodos, como imunofluorescência, podem ser realizados para verificar a natureza do DNA viral marcado com EdC.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da virologia do herpes explorarem as funções das proteínas do hospedeiro e da infecção viral.

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a...

Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando &#39;Genomics vírus simples&#39;

Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados ​​por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para identificar a planta vírus com genoma de DNA dobro-costa. Utilizamos métodos padrão para extrair o DNA e RNA de folhas contaminadas e realizar o sequenciamento de próxima geração. Ferramentas de Bioinformatic montam sequências em contigs, identificam contigs representando genomas do vírus e atribuir genomas de grupos taxonômicos.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

Aqui, descrevemos um imunoensaio fluorescente multiplex recém-desenvolvido que usa um sistema de citometria de fluxo de repórter duplo para detectar simultaneamente dois epítopos de proteína spike exclusivos em partículas virais intactas do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que foram capturadas por microesferas magnéticas acopladas à enzima conversora de angiotensina 2.

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Aprenda a purificar DNA viral de células infectadas para análise proteômica de proteínas associadas ao genoma viral. Este método revela o papel de fatores celulares na infecção por Herpes Simplex vírus tipo um.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

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