Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Olá, sou Eric Gottwald e sou cientista pesquisador do Instituto de Interfaces Biológicas do Ware Institute of Technology. E hoje eu gostaria de apresentar a você nosso sistema microbioativo perfundido baseado em chip. Antes de podermos usar o chip Em aplicações de cultura de células, temos que hidrolisar o polímero e reduzir a área microestruturada.

Isso é conseguido apenas mergulhando o chip em diferentes concentrações de isopropanol, começando com 100% Estou mergulhando o chip apenas alguns segundos em cada concentração e a etapa final é apenas água. Depois, o chip é seco e, finalmente, temos que revestir o chip com um colágeno, uma solução para facilitar a adesão das células ao polímero. Isso é feito pingando apenas algumas gotas de colágeno, uma solução em cima da área microestruturada e, nesse estado, o chip é incubado a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a incubação noturna com a solução de colágeno um, a solução é removida e o chip é lavado com PBS estéril Depois, também, o PBS é removido e o chip está pronto para a inoculação das células. Agora vamos inocular a nave celular com uma suspensão de células únicas, e isso é feito apenas colocando 150 microlitros de suspensão celular em cima da área microestruturada. Após a deposição das células, o chip é incubado por três horas a 37 graus em uma incubadora.

Após o período de incubação de três horas, o chip é removido da incubadora e agora está pronto para a inserção no ector. Para isso, o ector é retirado de sua embalagem estéril e a esterilidade é alcançada por irradiação gama desta folha de transparência. Então só temos que abrir a embalagem e remover o ector.

O que faremos a seguir é inserir a parte superior da garrafa neste reservatório médio para que possamos desmontar a carcaça do biorreator para a inserção do chip. Depois de abrir a carcaça do biorreator, podemos inserir o chip agora, o que é conseguido apenas colocando o chip na ranhura da carcaça do biorreator e o bactor agora pode ser montado novamente. O que temos que fazer finalmente é conectar filtros estéreis ao reservatório médio e uma porta de amostragem estéril.

Para a medição da tensão real de oxigênio no circuito de circulação fechado, inseriremos dois sensores de oxigênio apenas montando-os entre esses dois conectores. O bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura. O sistema de bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura de células, e isso é conseguido simplesmente conectando o circuito de circulação fechado à bomba de rolos.

Com isso, desvalorizaremos simultaneamente toda a circulação de bactor. Como você pode ver aqui na janela do Ector, você pode ver o meio subindo de baixo subindo e subindo, e deixando o bactor no topo. Antes de colocarmos o sistema Bactor na incubadora, controlamos o enchimento sem bolhas do circuito de circulação.

Agora o sistema está completamente preenchido com meio de cultura de células e podemos transferir o biorreator para a incubadora. Agora vamos colocar o reitor bi na câmara de incubação. E para isso, a princípio, o bi-reitor é conectado à bomba de rolo, como você já viu pouco antes, e agora o ector é ativamente perfundido por este meio da garrafa.

E para manter a concentração de oxigênio ambiente, conectamos o reservatório do meio ao suprimento de gás. E, finalmente, conectaremos dois sensores de oxigênio à circulação para monitorar on-line a tensão de oxigênio no sistema. Agora a configuração está concluída e pode ser executada desde que você tenha projetado o experimento.

Uma das ferramentas mais poderosas durante a análise das funções organotípicas das células dentro dos recipientes MicroCon é o microscópio de varredura a laser, que você pode ver aqui. O microscópio de varredura a laser nos dá a oportunidade de examinar cada recipiente MicroCon sem destruição. E como os recipientes MicroCon ou o chip podem ser usados para métodos convencionais de imunofluorescência de imunocoloração, somos capazes de detectar todos os tipos de marcadores e funções organotípicas dentro dos micro recipientes.

Como você pode ver aqui na, na animação deste, deste chip, o fundo está completamente preenchido com células, bem como as paredes do contêiner MicroCon. Temos muitas células que estão bem vivas e temos muito, muito poucas células mortas. A próxima imagem mostra que podemos detectar todos os tipos de funções organotípicas dentro do recipiente MicroCon.

Como, por exemplo, para os hepatócitos, a produção de albumina ou o E pode ouvir uma expressão nas células, que você pode ver aqui bem na sobreposição. O núcleo está corado em azul. O eco aqui é corado em verde e a albumina é expressa ou corada em vermelho.

E como você pode ver aqui muito bem, todas as funções organotípicas que você espera dos hepatócitos são bem expressas nesse tipo de cultura 3D. Além disso, analisamos outro marcador de hepatócitos, e este era a citoqueratina 18, e esta imagem mostra que a citoqueratina 18 também é bem expressa nesse tipo de cultura. E espero que isso o convença de que esse tipo de função organotípica também pode ser útil para outras culturas organotípicas.

Após o término do experimento Biore, o chip pode ser usado para o isolamento de todos os tipos de componentes celulares, como por exemplo, RNA total. Como você pode ver aqui, aqui mostramos a ingestão de RNA total, que foi isolado do sistema de biorreator. Esse RNA total pode ser usado para aplicações downstream, como, por exemplo, PCR em tempo real ou, como você pode ver aqui, análise de microarray.

Além disso, as células intactas podem ser isoladas do sistema e essas células podem ser usadas para análise de citometria de fluxo convencional. Como você pode ver aqui, espero que possamos mostrar que o sistema pode ser útil para todos os tipos de aplicações em que reações organotípicas são necessárias e que o sistema pode ser útil para todos os tipos de aplicações que não consideramos até agora, como, por exemplo, aplicações de células-tronco.