Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Olá, sou Eric Gottwald e sou cientista pesquisador no Instituto para Interfaces Biológicas do Ware Institute of Technology. E hoje gostaria de apresentar a vocês o nosso sistema microbiorreativo perfundido baseado em chip. Antes de podermos usar o chip em aplicações de cultura celular, precisamos hidrolisar o polímero e desobstruir a área microestruturada.

Isso é conseguido simplesmente mergulhando o chip em diferentes concentrações de isopropanol, começando com 100%. Mergulho o chip por apenas alguns segundos em cada concentração e o passo final é apenas água. Posteriormente, o chip é secado e, finalmente, precisamos revestir o chip com um colágeno, uma solução para facilitar a adesão das células ao polímero. Isso é feito pingando apenas algumas gotas de uma solução de colágeno um sobre a área microestruturada, e, nesse estado, o chip é incubado a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a incubação durante a noite com a solução de colágeno I, a solução é removida e o chip é lavado com PBS estéril. Em seguida, o PBS também é removido e o chip está agora pronto para a inoculação das células. Agora, inocularemos o chip celular com uma suspensão de células isoladas, o que é feito simplesmente colocando 150 microlitros da suspensão celular sobre a área microestruturada. Após a deposição das células, o chip é incubado por três horas a 37 graus em uma estufa.

Após o período de incubação de três horas, o chip é removido do incubador e está agora pronto para a inserção no ector. Para isso, o ector é retirado de sua embalagem estéril e a esterilidade é obtida por irradiação gama dessa folha de transparência. Assim, basta abrir a embalagem e remover o ector.

O que faremos em seguida é inserir o topo do frasco neste reservatório de meio para que possamos desmontar a carcaça do biorreator e inserir o chip. Após abrir a carcaça do biorreator, podemos agora inserir o chip, o que é feito simplesmente colocando-o no entalhe da carcaça do biorreator, e o biorreator pode então ser montado novamente. O que precisamos fazer por fim é conectar dois filtros estéreis ao reservatório de meio e uma porta estéril de amostragem.

Para a medição da tensão real de oxigênio no circuito fechado, inseriremos dois sensores de oxigênio simplesmente acoplando-os entre esses dois conectores. O bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura. O sistema bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura celular, o que é realizado conectando-se simplesmente o circuito fechado à bomba de roletes.

Com isso, reduziremos simultaneamente toda a circulação do bactor. Como você pode ver aqui na janela do Ector, é possível observar o meio subindo a partir da parte inferior, cada vez mais, e saindo do bactor na parte superior. Antes de colocar o sistema Bactor no incubador, verificamos o preenchimento livre de bolhas do circuito de circulação.

Agora o sistema está completamente preenchido com meio de cultura celular e podemos transferir o biorreator para a incubadora. Agora colocaremos o biorreator na câmara de incubação. Para isso, inicialmente, o biorreator é conectado à bomba peristáltica, como você já viu brevemente antes, e agora o biorreator é perfundido ativamente por este meio proveniente do frasco.

E para manter a concentração ambiente de oxigênio, conectamos o reservatório de meio à fonte de gás. E, finalmente, conectaremos dois sensores de oxigênio ao circuito para monitorar em tempo real a tensão de oxigênio no sistema. Agora a montagem está completa e pode funcionar pelo tempo que você tiver planejado para o experimento.

Uma das ferramentas mais poderosas durante a análise das funções organotípicas das células dentro dos recipientes MicroCon é o microscópio de varredura a laser, que você pode ver aqui. O microscópio de varredura a laser nos dá a oportunidade de observar cada recipiente MicroCon individualmente, sem destruí-lo. E como os recipientes MicroCon ou o chip podem ser utilizados para métodos convencionais de coloração imunológica por imunofluorescência, somos capazes de detectar todos os tipos de marcadores e funções organotípicas dentro dos microrecipientes.

Como é possível observar aqui na animação deste chip, a parte inferior está completamente preenchida com células, assim como as paredes do recipiente MicroCon. Temos uma grande quantidade de células bastante viáveis e um número muito, muito pequeno de células mortas. A próxima imagem mostra que podemos detectar todos os tipos de funções organotípicas dentro do recipiente MicroCon.

Por exemplo, para hepatócitos, a produção de albumina ou a expressão de E pode ser observada nas células, o que pode ser visto nitidamente aqui na sobreposição. Os núcleos são corados em azul. O ECO aqui é corado em verde, e a albumina é expressa ou corada em vermelho.

E, como você pode ver aqui claramente, todas as funções organotípicas que se espera de hepatócitos são bem expressas neste tipo de cultura tridimensional. Além disso, analisamos outro marcador de hepatócito, a citoceratina 18, e esta imagem mostra que a citoceratina 18 também é bem expressa nesse tipo de cultura. E isso esperançosamente o convence de que esse tipo de função organotípica pode ser útil também para outras culturas organotípicas.

Após o término do experimento no biorreator, o chip pode ser utilizado para o isolamento de todos os tipos de componentes celulares, como, por exemplo, RNA total. Como é possível observar aqui, mostramos o RNA total obtido, que foi isolado do sistema de biorreator. Esse RNA total pode então ser usado em aplicações posteriores, como, por exemplo, PCR em tempo real ou, como é possível ver aqui, análise por microarranjo.

Além disso, células intactas podem ser isoladas a partir do sistema e essas células podem então ser utilizadas para análise convencional por citometria de fluxo. Como você pode ver aqui, espero que tenhamos conseguido demonstrar que o sistema pode ser útil para todos os tipos de aplicações nas quais reações organotípicas são necessárias e que o sistema pode ser útil para todos aqueles tipos de aplicações que ainda não consideramos até o momento, como, por exemplo, aplicações com células-tronco.