Name: Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Aprenda cultura celular tridimensional em micro-biorreatores perfundidos usando chips poliméricos revestidos com colágeno. Este método permite cultivar até 10 milhões de células em condições estéreis controladas para estudos de biologia celular.

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Gostaríamos de agradecer Mechthild Herschbach e Anke Dech de assistência técnica excelente.

Este artigo descreve a utilização de uma plataforma baseada em chip (fig. 1) para o cultivo tridimensional de linhagens celulares, bem como células primárias. Uma vez que muitas células não expressam funções organotípicas somente em um ambiente 3D, temos desenvolvido um chip de polímero que fornece uma plataforma para que as células podem aderir em todas as direções espaciais, e que pode ser montado em uma carcaça de biorreatores para o controle de fluxo de fluido , etc tensão de oxigênio Dependendo do projeto experimental, a superfície do polímero pode ser modificado por várias técnicas, por exemplo, radiação UV, PECVD, γ-enxertia ou química úmida convencional. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="564_Figure-01.png" width="546" height="386" /> Figura 01 1. Desaeração e hydrophilisation do chip Antes do uso, o chip tem de ser purgada e hydrophilized. Para isso, uma série de álcool é realizada. Soluções de isopropanol composto de 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol em DMPC-água tratada estão preparados eo chip é mergulhado em cada concentração, começando com a solução de 100%, para até 30 anos. A etapa final da série é composta por pyrocarbonate Dimetil puro (DMPC) tratados com água. A partir deste ponto, é importante manter o chip molhado. 2. Colágeno I revestimento Após a série de álcool, o chip é geralmente revestido com uma solução de colágeno I, a partir da cauda de rato. A partir da solução estoque de colágeno de 2 mg / ml em 0,2% de ácido acético uma alíquota correspondente a 30 mg de proteína de colágeno é diluída com água tratada DMPC-a um volume final de 150 mL. Isso resulta em uma camada de colágeno da superfície do chip com uma densidade de 10 de colágeno I mg por cm 2 de superfície. 3. Inoculação de células de carcinoma hepatocelular Células de carcinoma hepatocelular linha Hep G2 são tripsinizados e contadas. Para experimentos de curta duração (1-6 dias) 5 * 10 6 células são inoculadas em cada chip eo correspondente controle de seis centímetros de tecido placas de cultura de petri. Para inoculte, o chip de 5 * 10 6 células são ressuspendidas em 150 mL meio de cultura e colocado em cima da área do micro-chip (fig. 2). Depois, ele é colocado em uma incubadora por 2-3 horas. Durante este período de incubação do sedimento das células para o micro-recipientes e aderir ao colágeno I-revestido andaime. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="564_Figure-02.png" width="300" height="225" /> Figura 2 4. Inserção do chip dentro do alojamento biorreator Após o período de incubação, o chip é retirado da incubadora e montado no alojamento biorreator. Para isso, sob a bancada limpa, o biorreator preassembled é removido da embalagem estéril e desmontada em um grau que permite a inserção do chip. O chip é cuidadosamente tratada com pinças esterilizadas e colocado na ranhura que contém a gaxeta que veda o chip e que resulta na geração de um compartimento superior e inferior no biorreator. Então, o biorreator é montado novamente e transferido para a incubadora, onde ele está conectado à bomba, o fornecimento de gás eo analisador de oxigênio. 5. Enchimento do sistema Assim que o biorreator é conectada ao reservatório de meio, bomba e de fornecimento de gás do loop circulação fechada é preenchida com o meio. Isto é feito posicionando o 3-way-conectores de tal forma que superfusão, que é definido como o fluxo de meio por cima do chip, é alcançado. Isto leva a uma descarga de ar fechado da circulação biorreator sem remover as células do andaime. Depois que o sistema é completamente preenchida com o meio, o 3-way-conectores estão ligados de tal forma que a perfusão, que é definido como o fluxo de baixo para o chip através do tecido, seja alcançado. Na configuração do fluxo de perfusão é ajustado às necessidades da célula, que geralmente varia de hepatócitos 6-50 mL / min. 6. Amostragem Durante o experimento amostras médio pode ser desenhado. Para isso, seringas são ligados às portas estéril em cima do reservatório de médio porte. Após a amostragem, as portas são esterilizados com isopropanol 70%. 7. Isolamento de células intactas do chip para aplicações downstream No final do experimento, os biorreatores estão desconectados da fonte de gás ea bomba de rolete, transferido para a bancada limpa e desmontado conforme descrito anteriormente. Com uma pinça estéril, o chip é removido da habitação biorreator, colocadoem um prato de 3,5 centímetros de Petri e lavados com PBS. Depois, o chip é incubada com tripsina / EDTA (0,25% / 0.53mM) por 5-15 min em uma incubadora para separar as células da área microestruturada. A suspensão de células coletadas é centrifugada por 5 min a 600 g. As células podem então ser utilizados para aplicações convencionais de downstream, por exemplo, RNA total ou isolamento de proteínas. Rotineiramente, isolamos RNA total (kit PARIS, Ambion Inc., Austin, Texas, EUA) para análise de microarray e em tempo real de RT-PCR. Expressão da proteína é analisado após a coloração imuno-histoquímica das células dentro do chip com um microscópio de varredura a laser, mas também pode ser analisado de outra forma, por exemplo, por citometria de fluxo.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Nós desenvolvemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em biorreatores ativamente perfundidos micro. Os chips podem ser fabricados a partir de não-biodegradáveis, bem como polímeros biodegradáveis ​​por moldagem por injeção micro, estampagem a quente e micro técnicas de termoformagem 3. Dependendo do projeto experimental, a superfície do polímero pode ser modificado por irradiação UV-4. Linhagens de células de hepatócitos, bem como hepatócitos primários de rato pode ser cultivada com ...

<table><tbody><tr><td>Células</td><td>Outro</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I de cauda de rato</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit PARIS</td><td>Reagente</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anticitoceratina 18</td><td>Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>Anticorpo primário, monoclonal de camundongo, utilizado em diluição 1/100 em PBS</td></tr><tr><td>Anti E-caderina</td><td>Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>Anticorpo primário, monoclonal de camundongo, utilizado em diluição 1/50 em PBS.</td></tr><tr><td>Antialbumina de cabra</td><td>Reagente</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>Anticorpo primário, anticorpo de cabra anti-albumina humana, utilizado em diluição 1/200 em PBS</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG1 de coelho anti-murino</td><td>Anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Anticorpo secundário, conjugado com Alexa Fluor 488, utilizado em diluição 1/100 em PBS + 0,5% BSA</td></tr><tr><td>Cy3 anti-IgG de cabra</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Anticorpo Cy3 AffiniPure de jumento anti-IgG de cabra, utilizado em diluição 1/700 em PBS + 0,5% BSA</td></tr></tbody></table>

chip baseado em cultura de células tridimensional em perfundidos micro-biorreatores

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Nós desenvolvemos um chip baseado em sistema de cultura de células para o cultivo tridimensional de células. O chip é normalmente fabricados a partir de polímeros não-biodegradáveis, por exemplo, policarbonato ou polimetilmetacrilato por moldagem por injeção micro, estampagem a quente micro ou micro termoformagem. Mas, ele também pode ser fabricado a partir de polímeros bio-degradáveis. Suas dimensões são 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (AxLxP). As principais características dos chips usados ​​são ou uma grade de até 1.156 cúbicos micro-recipientes (cf-chip) cada um do tamanho de 120-300 x 300 x 300 μ (AxLxP) ou recessos redonda com diâmetro de 300 μ e uma profundidade de 300 μ (r-chip). O andaime pode abrigar 10 milhões. células em uma configuração tridimensional. Para um nutriente ideal e fornecimento de gás, o chip é inserido em uma carcaça biorreator. O biorreator é parte de um circuito fechado de circulação estéril que, na configuração mais simples, é adicionalmente constituído por uma bomba de roletes e um reservatório com uma média de fornecimento de gás. O biorreator pode ser executado em perfusão, superfusão, ou mesmo um modo de operação mista. Temos cultivou com sucesso linhagens de células, bem como células primárias ao longo de períodos de várias semanas. Para as células do fígado de ratos primária que poderia mostrar uma preservação das funções organotípicas por mais de duas semanas. Para as linhas de células de carcinoma hepatocelular pudéssemos mostrar a indução de genes específica do fígado ou não apenas um pouco expressa em cultura em monocamada padrão. O sistema também pode ser útil como um sistema de cultivo de células-tronco desde experimentos primeira diferenciação com linhas de células-tronco foram promissores.

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Desenvolvemos um sistema de cultura celular baseado em chip para o cultivo tridimensional de células. O chip é tipicamente fabricado a partir de ...

Olá, sou Eric Gottwald e sou cientista pesquisador no Instituto para Interfaces Biológicas do Ware Institute of Technology. E hoje gostaria de apresentar a vocês o nosso sistema microbiorreativo perfundido baseado em chip. Antes de podermos usar o chip em aplicações de cultura celular, precisamos hidrolisar o polímero e desobstruir a área microestruturada.Isso é conseguido simplesmente mergulhando o chip em diferentes concentrações de isopropanol, começando com 100%. Mergulho o chip por apenas alguns segundos em cada concentração e o passo final é apenas água. Posteriormente, o chip é secado e, finalmente, precisamos revestir o chip com um colágeno, uma solução para facilitar a adesão das células ao polímero. Isso é feito pingando apenas algumas gotas de uma solução de colágeno um sobre a área microestruturada, e, nesse estado, o chip é incubado a quatro graus Celsius durante a noite.Após a incubação durante a noite com a solução de colágeno I, a solução é removida e o chip é lavado com PBS estéril. Em seguida, o PBS também é removido e o chip está agora pronto para a inoculação das células. Agora, inocularemos o chip celular com uma suspensão de células isoladas, o que é feito simplesmente colocando 150 microlitros da suspensão celular sobre a área microestruturada. Após a deposição das células, o chip é incubado por três horas a 37 graus em uma estufa.Após o período de incubação de três horas, o chip é removido do incubador e está agora pronto para a inserção no ector. Para isso, o ector é retirado de sua embalagem estéril e a esterilidade é obtida por irradiação gama dessa folha de transparência. Assim, basta abrir a embalagem e remover o ector.O que faremos em seguida é inserir o topo do frasco neste reservatório de meio para que possamos desmontar a carcaça do biorreator e inserir o chip. Após abrir a carcaça do biorreator, podemos agora inserir o chip, o que é feito simplesmente colocando-o no entalhe da carcaça do biorreator, e o biorreator pode então ser montado novamente. O que precisamos fazer por fim é conectar dois filtros estéreis ao reservatório de meio e uma porta estéril de amostragem.Para a medição da tensão real de oxigênio no circuito fechado, inseriremos dois sensores de oxigênio simplesmente acoplando-os entre esses dois conectores. O bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura. O sistema bactor está agora pronto para ser preenchido com meio de cultura celular, o que é realizado conectando-se simplesmente o circuito fechado à bomba de roletes.Com isso, reduziremos simultaneamente toda a circulação do bactor. Como você pode ver aqui na janela do Ector, é possível observar o meio subindo a partir da parte inferior, cada vez mais, e saindo do bactor na parte superior. Antes de colocar o sistema Bactor no incubador, verificamos o preenchimento livre de bolhas do circuito de circulação.Agora o sistema está completamente preenchido com meio de cultura celular e podemos transferir o biorreator para a incubadora. Agora colocaremos o biorreator na câmara de incubação. Para isso, inicialmente, o biorreator é conectado à bomba peristáltica, como você já viu brevemente antes, e agora o biorreator é perfundido ativamente por este meio proveniente do frasco.E para manter a concentração ambiente de oxigênio, conectamos o reservatório de meio à fonte de gás. E, finalmente, conectaremos dois sensores de oxigênio ao circuito para monitorar em tempo real a tensão de oxigênio no sistema. Agora a montagem está completa e pode funcionar pelo tempo que você tiver planejado para o experimento.Uma das ferramentas mais poderosas durante a análise das funções organotípicas das células dentro dos recipientes MicroCon é o microscópio de varredura a laser, que você pode ver aqui. O microscópio de varredura a laser nos dá a oportunidade de observar cada recipiente MicroCon individualmente, sem destruí-lo. E como os recipientes MicroCon ou o chip podem ser utilizados para métodos convencionais de coloração imunológica por imunofluorescência, somos capazes de detectar todos os tipos de marcadores e funções organotípicas dentro dos microrecipientes.Como é possível observar aqui na animação deste chip, a parte inferior está completamente preenchida com células, assim como as paredes do recipiente MicroCon. Temos uma grande quantidade de células bastante viáveis e um número muito, muito pequeno de células mortas. A próxima imagem mostra que podemos detectar todos os tipos de funções organotípicas dentro do recipiente MicroCon.Por exemplo, para hepatócitos, a produção de albumina ou a expressão de E pode ser observada nas células, o que pode ser visto nitidamente aqui na sobreposição. Os núcleos são corados em azul. O ECO aqui é corado em verde, e a albumina é expressa ou corada em vermelho.E, como você pode ver aqui claramente, todas as funções organotípicas que se espera de hepatócitos são bem expressas neste tipo de cultura tridimensional. Além disso, analisamos outro marcador de hepatócito, a citoceratina 18, e esta imagem mostra que a citoceratina 18 também é bem expressa nesse tipo de cultura. E isso esperançosamente o convence de que esse tipo de função organotípica pode ser útil também para outras culturas organotípicas.Após o término do experimento no biorreator, o chip pode ser utilizado para o isolamento de todos os tipos de componentes celulares, como, por exemplo, RNA total. Como é possível observar aqui, mostramos o RNA total obtido, que foi isolado do sistema de biorreator. Esse RNA total pode então ser usado em aplicações posteriores, como, por exemplo, PCR em tempo real ou, como é possível ver aqui, análise por microarranjo.Além disso, células intactas podem ser isoladas a partir do sistema e essas células podem então ser utilizadas para análise convencional por citometria de fluxo. Como você pode ver aqui, espero que tenhamos conseguido demonstrar que o sistema pode ser útil para todos os tipos de aplicações nas quais reações organotípicas são necessárias e que o sistema pode ser útil para todos aqueles tipos de aplicações que ainda não consideramos até o momento, como, por exemplo, aplicações com células-tronco.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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