Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína
20 de dezembro de 2017
QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.
O objetivo geral deste procedimento é identificar epítopos de Qa-1 em proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regulação imunológica e imunoterapia. As principais vantagens dessa técnica são que os peptídeos mapeados são conhecidos por estimular as células T CD8 restritas a Qa-1, e o procedimento é fácil de realizar.
As implicações dessa técnica se estendem a projetos terapêuticos para doenças imunomediadas, como a esclerose múltipla. Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação imunológica mediada por Qa-1 em animais, ele também pode ser aplicado à regulação imunológica mediada por HLA-E em humanos. Para iniciar o procedimento, projete uma biblioteca de peptídeos de 15 meros, nos quais os peptídeos adjacentes se sobrepõem em 11 aminoácidos.
Obtenha e reconstitua os peptídeos em condições estéreis. Para cada peptídeo, combine cinco miligramas do peptídeo com 100 microlitros de dimetilsulfóxido. Combine 10 microlitros de cada estoque de peptídeos em um tubo criogênico limpo de 1 mililitro para preparar o estoque da piscina OLP.
Em seguida, carregue 20 microlitros de cada estoque de peptídeo em uma placa de 96 poços com fundo em V e dilua cada estoque com 80 microlitros de água estéril. Armazene os estoques de peptídeos restantes de 50 miligramas por mililitro e a placa de estoques de peptídeos de 10 miligramas por mililitro a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 microlitros da solução estoque de pool OLP a um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de células dendríticas irradiadas em meio livre de soro, diluindo assim o DMSO duzentas vezes.
Armazene o estoque restante do pool OLP a 20 graus Celsius. Incube os DCs com o pool OLP em temperatura ambiente por três horas. Agite suavemente as células a cada 15 minutos com a mão.
Durante a incubação, use um kit para purificar as células T CD8 + de um baço ou linfonodos de camundongo colhidos. Prepare cinco mililitros de uma solução com 10 milhões de células T por mililitro de meio livre de soro com 50 unidades por mililitro de interleucina 2 e 100 unidades por mililitro de interleucina 7. As células T CD8 purificadas devem estar livres de grânulos ou intocadas.
Coloque 0,5 mililitros da solução de células T em cada um dos 10 poços de uma placa de 48 poços. Quando a incubação da solução DC pulsada em pool OLP estiver concluída, adicione 10 mililitros de meio sem soro aos DCs. Centrifugue as células a 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, reconstitua as células em cinco mililitros de meio sem soro. Adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada um dos 10 poços. Incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono por quatro dias.
Em seguida, remova 400 microlitros do meio de cultura de cada poço. Adicione 500 microlitros de meio fresco sem soro contendo 100 unidades por mililitro de IL-2 e IL-7 a cada poço. Incube as células por mais dois a três dias antes de reestimular as células preparadas para o pool de OLP.
Antes da reestimulação, obtenha e irradie macrófagos peritoneais de camundongos. Ajustar a concentração de macrófagos a cinco milhões de células por mililitro de meio isento de soro. Combine 10 microlitros do estoque do pool OLP com dois mililitros dos macrófagos peritoneais irradiados para uma concentração final de DMSO de 0,5% em volume.
Suplementar esta solução com 100 unidades por mililitro de factor estimulador de colónias de macrófagos murinos. Encha uma placa de 48 poços com 200 microlitros da solução de macrófagos do pool OLP em cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas.
Em seguida, lave suavemente cada poço com 200 microlitros de meio RPMI-0 pré-aquecido. A solução de macrófagos conterá muitas contas. Antes de adicionar as células T CD8 preparadas com pool OLP, a placa deve ser verificada ao microscópio para garantir que todos os poços estejam livres de contas.
Em seguida, colete e agrupe as células T CD8 + preparadas para pool de OLP que estão prontas para reestimulação. Ajuste a concentração de células T para um milhão de células por mililitro em meio livre de soro contendo 25 unidades por mililitro de IL-2 e 50 unidades por mililitro de IL-7. Adicione um mililitro da solução de células T agrupadas a cada poço contendo macrófagos pulsados em pool OLP.
Cultive as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono por quatro dias. Em seguida, remova cerca de 400 microlitros do meio de cada poço. Adicione a cada poço 500 microlitros de meio fresco sem soro contendo 100 unidades por mililitro de IL-2 e IL-7.
Retomar a incubação nas mesmas condições. Após três a quatro dias, examine as células reestimuladas para uma resposta restrita de Qa-1 específica do pool de OLP com um ensaio de ponto imunológico ligado à enzima interferon-gama. Atualize o meio de células T CD8 + a cada três ou quatro dias enquanto aguarda os resultados.
Realize um ensaio ELISPOT com os estoques de peptídeos diluídos para determinar quais peptídeos produzem a secreção restrita de interferon-gama Qa-1 específica do pool de OLP. Por fim, avalie uma série de peptídeos truncados com ELISPOT para identificar o epítopo Qa-1 ideal. Um ensaio ELISPOT de interferon-gama mostrou um aumento significativo nas células formadoras de manchas quando as células T CD8 + estimuladas pela biblioteca de peptídeos sobrepostos MOG agrupados foram combinadas com C1R.
Células Qa-1b. Isso sugeriu que as células T responderam aos peptídeos de ligação Qa-1 e que o MOG_pool continha um ou mais epítopos de ligação Qa-1. Outro ensaio foi realizado para rastrear os peptídeos individuais na piscina.
Três peptídeos apresentaram respostas pelo menos três vezes maiores do que a resposta na presença de C1R. Células Qa-1b sem peptídeos. Destes, o peptídeo com maior resposta foi selecionado para avaliação posterior.
Uma biblioteca de peptídeos truncados com base no peptídeo de interesse de 15 mer foi avaliada para identificar o epítopo Qa-1 ideal. O epítopo seria idealmente de oito a 10 mer, com nove mer preferidos. Além disso, o epítopo ideal mostraria uma resposta de interferon-gama semelhante ou mais forte do que o peptídeo de 15 meros.
O peptídeo truncado N-terminal de nove mer se encaixa melhor nesses critérios, tornando-o o epítopo Qa-1 ideal. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regulação imunológica descobrirem novos epítopos de Qa-1 para o estudo da regulação imunológica em outros tecidos, como o pâncreas. Não se esqueça, trabalhar com radiação pode ser extremamente perigoso.
Os pesquisadores devem seguir rigorosamente a política institucional e ser devidamente treinados.
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Visão Geral
Este artigo discute um método para identificar epítopos Qa-1 em proteínas, o que é crucial para compreender a regulação imunológica. A técnica envolve o planejamento de uma biblioteca de peptídeos sobrepostos que podem estimular linfócitos T CD8 restritos ao Qa-1.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Autoimunidade
- Desenho Terapêutico
Contexto
- Qa-1 é uma molécula não clássica do complexo principal de histocompatibilidade.
- A imunização com epítopos que se ligam ao Qa-1 pode melhorar a regulação imune.
- Este método possui aplicações potenciais no tratamento de doenças autoimunes.
- Pode ser aplicado tanto a modelos animais quanto à regulação imune humana.
Objetivo do Estudo
- Identificar epítopos Qa-1 em proteínas.
- Aprimorar o entendimento da regulação imunológica e da imunoterapia.
- Desenvolver estratégias terapêuticas para doenças mediadas pelo sistema imunológico.
Métodos Utilizados
- Elaboração de uma biblioteca de peptídeos de 15 resíduos.
- Garantir que os peptídeos adjacentes tenham sobreposição de 11 aminoácidos.
- Mapeamento de peptídeos para estimular linfócitos T CD8 restritos por Qa-1.
- Aplicação do método em estudos com animais e humanos.
Resultados Principais
- A técnica é simples e eficaz.
- Os peptídeos mapeados estimulam com sucesso linfócitos T CD8 restritos à Qa-1.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar o desenvolvimento terapêutico para doenças como a esclerose múltipla.
- Potencial para aplicações mais amplas na regulação imunológica.
Conclusões
- Este método fornece informações valiosas sobre a regulação imunológica mediada por Qa-1.
- Ele apresenta potencial para o desenvolvimento de terapias para doenças autoimunes.
- Pesquisas futuras poderiam ampliar suas aplicações na imunoterapia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de epítopos funcionais de Qa-1 permite a desmistificação mecanicista de alvos imunorregulatórios em programas de doenças autoimunes. Esta abordagem apoia a validação de alvos ao associar sequências peptídicas à ativação de linfócitos T CD8+ restritos a Qa-1, fornecendo confiança preditiva para imunomodulação específica de epítopos. O método acelera a identificação de candidatos promissores em pipelines de imunoterapia, mapeando rapidamente regiões imunogênicas dentro de proteínas relevantes para a doença, como a glicoproteína oligodendrocítica da mielina.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da identificação de epítopos ligantes ao Qa-1 que induzem respostas de linfócitos T reguladores CD8+.
- Valor Operacional: Utiliza bibliotecas de peptídeos sobrepostos para escanear sistematicamente sequências proteicas em busca de regiões imunogênicas, com validação funcional por meio de ELISPOT de IFN-γ.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao confirmar a regulação imune específica por epítopos em modelos de doenças, como a encefalomielite alérgica experimental.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantitativos de IFN-γ para classificar candidatos a peptídeos conforme a intensidade estimulatória em relação aos controles.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível de triagem utilizando células dendríticas e macrófagos irradiados para apresentar peptídeos a linfócitos T CD8+.
- Valor Científico: Permite análise de truncamento para definir epítopos mínimos (8–10 mer) com atividade ótima para aplicações posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mapeia epítopos em antígenos relevantes para doenças (por exemplo, MOG) para estudar a regulação imunológica em tecidos como o pâncreas e o SNC.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma transferível do sistema Qa-1 de camundongo para o sistema HLA-E humano, permitindo a validação cruzada de espécies.
- Valor Científico: Apoia a seleção de modelos pré-clínicos ao identificar epítopos que potencializam a regulação imunológica específica para mielina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta para orientar a identificação de compostos líderes, particularmente para terapias imunomoduladoras que visam vias autoimunes.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre regulação imunológica ao associar regiões proteicas à ativação de células T restritas ao Qa-1.
- Triagem: Fornece pools de peptídeos prontos para ensaios e peptídeos individuais com atividade imunoestimuladora validada.
- Análise: Utiliza ELISPOT para quantificar células formadoras de manchas, permitindo a priorização de epítopos com base em dados.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o mapeamento de epítopos com resultados funcionais em modelos de doenças autoimunes.
- Reutilização em Escala: Estabelece um fluxo de trabalho de mapeamento de epítopos reutilizável, aplicável a múltiplos antígenos relevantes para doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao validar epítopos funcionais que impulsionam a regulação imunológica.
- Valor Operacional: Padroniza a descoberta de epítopos por meio do design de peptídeos sobrepostos e estimulação celular controlada.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico no desenvolvimento de imunoterapias ao confirmar precocemente o mecanismo de ação.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos baseados em epítopos com efeitos imunomoduladores demonstrados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imunologia, manipulação de peptídeos e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso a linhagens de células T CD8+ restritas a Qa-1 e células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, macrófagos).
- Necessita reagentes padronizados, incluindo IL-2, IL-7 e M-CSF para o cultivo de células T e diferenciação de macrófagos.
- Envolve considerações de biossegurança para o manuseio de células irradiadas e estoques de peptídeos em DMSO.
- Depende de infraestrutura para ELISPOT para detecção sensível da secreção de IFN-γ como leitura funcional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
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Overlapping Peptide (OLP) Library Generation and T Cell Priming with OLP Pool-pulsed Dendritic Cells (DCs) Protocol
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Re-stimulation of OLP Pool-primed CD8+ T Cells Using Macrophages Pulsed with the OLP Pool
6:19
Results: Identification of a 9-mer Qa-1 Epitope in Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)
7:32
Conclusion
