Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células em diferentes fases do ciclo celular usando elutriação centrífuga. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo terapêutico do câncer. Porque o isolamento das células em fases separadas permite a interrogação dos efeitos dependentes da fase dos compostos anticancerígenos.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a separação de células em fases específicas usando propriedades físicas, em vez de perturbações químicas. Para iniciar o experimento, instale o conjunto estroboscópico na centrífuga de forma que o cabo de alimentação seja alimentado para fora da câmara através da porta à esquerda. Ajuste a lâmpada do flash estroboscópico para que fique alinhada com o viewjanela, quando a centrífuga estiver fechada.

Prenda o conjunto no lugar, apertando dois parafusos Phillips, na parte superior de cada suporte. E então apertando os parafusos de aperto manual na parte inferior do suporte. Conecte o cabo de alimentação na porta de alimentação estroboscópica, localizada na parte traseira da centrífuga.

Em seguida, coloque os rotores diretamente no cubo de acionamento da centrífuga e prenda-o firmemente com uma chave sextavada com cabo em T. Em seguida, coloque o conjunto contendo a câmara de eluição, contrapeso, conjunto de vedação rotativa e uma placa de montagem no rotor. Empurre para baixo uniformemente, colocando uma mão na câmara de eluição e a outra mão no contrapeso, até que os parafusos do rotor se encaixem no lugar.

Coloque o pino, localizado em uma extremidade do cabo, no orifício do conjunto de vedação rotativa. E prenda o orifício do olhal, na outra extremidade, com um dos parafusos Phillips, afixados no suporte para conectar o cabo de ancoragem. Para montar o sistema de fluxo, para bombear o tampão para dentro e para fora da câmara de elutriação, conecte a tubulação tamanho 16 a uma bomba de velocidade variável.

Insira uma extremidade livre deste tubo através de uma porta no canto superior esquerdo da câmara da centrífuga, de modo que entre na câmara. Conecte uma conexão à extremidade livre deste tubo e, em seguida, insira a conexão no orifício de entrada do conjunto de vedação rotativa. Por fim, insira a tubulação de saída, através de uma porta, para conectá-la ao tubo de transferência na parte superior do conjunto de vedação rotativa.

Uma vez montado o sistema de eluição, esterilize-o colocando a outra extremidade livre do tubo de entrada em uma garrafa de 500 mililitros, cheia de 5% de alvejante. E colocar a tubulação de saída em uma garrafa vazia de um litro de resíduos. Em seguida, ligue a bomba e deixe o alvejante fluir por todo o sistema de eluição, até que seja bombeado para o frasco de resíduos.

Agora, ligue a centrífuga e deixe-a atingir a velocidade máxima designada para liberar bolhas e contrapressão. Assim que a velocidade definida for atingida, pare a centrífuga. Depois que o rotor parar completamente, abra a tampa e inspecione a câmara quanto a vazamentos.

Em seguida, de maneira semelhante, conforme descrito anteriormente, passe água estéril pelo sistema por 10 minutos. Após a lavagem com água, substitua o reservatório de água por uma garrafa de vidro estéril cheia de 100 mililitros de tampão de elutriação. Coloque o tubo de entrada nesta garrafa, de modo que fique bem no fundo.

Ligue a centrífuga e deixe o tampão fluir pelo sistema. Depois que a garrafa do reservatório estiver quase vazia e a água for totalmente eliminada do sistema, mova a tubulação de saída da garrafa de resíduos para o reservatório para que o buffer seja continuamente reciclado pelo sistema. Por fim, ligue o estroboscópio lamp e gire o botão de eluição para a extrema esquerda.

Agora, ajuste a janela de visualização girando lentamente o botão para a direita, de modo que a câmara de elutriação seja claramente vista e a luz estroboscópica esteja em sincronia com a velocidade do rotor. Prepare a amostra de célula conforme descrito no protocolo de texto. Adicione as células ressuspensas ao reservatório que contém o tampão de elutriação de reciclagem.

Permitir que as células entrem no sistema e atinjam o equilíbrio dentro da câmara de eluição. Para garantir que todas as células sejam retidas na câmara, pegue uma gota do eluente em uma lâmina de vidro e visualize-a ao microscópio. Se a amostra estiver desprovida de células intactas, confirma a retenção na câmara.

Uma vez que todas as células tenham entrado na câmara, e um limite distinto na parte mais branca da câmara, contendo células e equilíbrio, seja visto, comece a coletar frações. Mova a tubulação de saída para um tubo cônico pré-resfriado de 50 mililitros, rotulado como W1. Colete 50 mililitros de tampão de eluitriação neste tubo e armazene no gelo. Logo após coletar a fração W1, diminua a velocidade da centrífuga para 821 G. E mova o tubo de saída para o tubo cônico, rotulado como W2, e colete mais 50 mililitros nessa velocidade.

Continue alterando a velocidade e coletando frações. Certifique-se de que haja meio no tanque do reservatório e sempre armazene as frações coletadas no gelo. Depois que todas as frações forem coletadas, pare a centrífuga e colete 50 mililitros em um tubo cônico, rotulado como parada.

Células de pellets coletadas em cada uma das frações e usando análise a jusante, como citometria de fluxo ou western blotting, conforme necessário. Um gráfico de linhas exibindo o diâmetro médio das células em frações de elutriação sucessivas é mostrado. Observe que quanto maior o diâmetro da célula, maior o número de frações no qual ela elui.

Os resultados da análise de classificação de células ativadas por fluorescência mostram o conteúdo de DNA das células em cada uma das 20 frações de elutriação. As frações iniciais, F1 a F5, contêm quase exclusivamente células com conteúdo de DNA 2N representando células na fase G1. Uma mistura de células nas fases G1 e S, foi observada nas frações intermediárias, F6 a F9. E células com conteúdo de DNA 4N, representando células de G2 a M, foram observadas a partir de F10.

Mostrados aqui, são mostrados os resultados do western blot da sondagem dos níveis de proteínas relacionadas ao ciclo celular em frações agrupadas de células na fase G1 e na fase G2 a M. O pool G2 a M apresentou maiores teores de fosfo-Rb e ciclina B, em comparação com o pool G1, como esperado. O sinal da ciclina D um era fraco, mas mesmo assim era detectável no pool G1 e indetectável no pool G2 a M.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo e certificar-se de que o sistema de eluição esteja montado corretamente e que todos os materiais e soluções estejam preparados. Após este procedimento, outros métodos, como análise do ciclo celular, ensaios de viabilidade celular e immunoblots, podem ser realizados para interrogar como os compostos terapêuticos podem estar agindo de maneira dependente da fase do ciclo celular.