Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um ensaio para estudar o efeito de pequenas moléculas na modulação da agregação de proteínas mal dobradas de maneira dependente do tempo e da dose. Este método pode ajudar a responder às questões-chave para o desenvolvimento de ensaios celulares e seu uso é para técnicas de triagem de alto conteúdo. A principal vantagem dessa técnica é fornecer um método simples para detectar e quantificar a agregação de proteínas que ocorre em vários distúrbios neurodegenerativos.

A implicação desta técnica estende-se para a potencial terapia de doenças neurodegenerativas, como a ELA, pois propõe um método simples que permite desenvolver ensaios celulares e realizar o rastreio de moderadores de pequenas moléculas. Para iniciar a produção do vírus, antes da transfecção do plasmídeo, divida as células T HEK-293 em 30 a 40% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e 10 mililitros de meio de cultura de células. Incube a placa de cultura em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, prepare a solução de transfecção de DNA com plasmídeos de embalagem vetor lentiviral, 125 microlitros de cloreto de cálcio molar e adicione água destilada para ajustar o volume para 500 microlitros. Adicione suavemente 500 microlitros de tampão HEPS 0,05 molar e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, substitua o meio de células T HEK-293 por 10 mililitros de meio de cultura fresco pré-aquecido sem antibióticos misturado com um mililitro de solução de transfecção de DNA.

Incubar a 37 graus Celsius e 5% de incubadora de dióxido de carbono durante a noite. Substituir o sobrenadante celular por meio de cultura fresco no dia seguinte e incubar novamente durante a noite. Finalmente, no dia seguinte, colher o sobrenadante e transferir para um tubo de 15 mililitros.

Para remover as células mortas e detritos, centrifugue o tubo a 500 vezes g por cinco minutos. Para purificar ainda mais o sobrenadante, passe-o por um filtro de 0,45 micrômetro usando uma seringa de 60 mililitros. Em seguida, dispense imediatamente o sobrenadante filtrado em alíquotas de uso único de 300 microlitros.

Para preparar as células para a transdução, divida-as para serem infectadas a 60% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de seis poços em dois mililitros de DMAM suplementado com 10% de FBS. Incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, descongelar uma alíquota do lentivírus congelado no gelo para cada utilização.

Enquanto isso, aqueça o meio de cultura celular que contém o soro compatível com a linhagem celular de interesse. Assim que o vírus estiver totalmente descongelado, dilua-o em DMEM em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, ajuste o volume para um mililitro com meio de soro reduzido.

Em seguida, adicione dois microlitros de polibreno a um mililitro de vírus por meio e misture bem por pipetagem. Adicione um mililitro desta mistura às células e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova o vírus contendo meio e substitua-o por DMEM normal suplementado com 10% de FBS e retorne as células à incubadora.

Monitore o crescimento celular e troque o meio a cada dois dias Quando as células atingirem a confluência, expanda cada poço da placa de seis poços em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros. Mova as placas para a incubadora. Finalmente, economize 1,5 vezes 10 para as 4ª células por poço e 50 microlitros de DMEM em 384 placas de ensaio de poço.

Em seguida, verifique o nível de expressão da proteína marcada com YFP ao microscópio. Se a expressão mostrar uma relação sinal-ruído igual ou superior a três, prepare o estoque de células para a linha celular correspondente. Para a transferência de compostos, em uma placa de polipropileno de armazenamento de 384 poços, adicione diluições seriais de compostos pela série de diluição padrão de uma a três.

Em seguida, usando um manipulador de líquidos equipado com uma cabeça capilar de 384, distribua 0,25 microlitros de inibidores de proteassoma em placas de ensaio pretas vazias de fundo plano de 384 poços. Em seguida, semeie 1,5 vezes 10 para as 4ª células nessas placas. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Antes de obter imagens da linhagem celular tratada com inibidores de proteassoma, adicione 10 microlitros de DMEM pré-aquecido com solução de coloração e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a coloração, inicie o software de operação do microscópio automatizado selecionando a guia do microscópio. Primeiro, selecione a guia de configuração e, em seguida, selecione 20 vezes a objetiva no tipo de placa correto.

Para permitir o foco adequado com diferentes tipos de placa, certifique-se de que o chamador esteja definido com o valor correto na objetiva. Em seguida, selecione a exposição um. Defina a altura do foco para zero micrômetros e selecione o foco.

Uma vez focado, exponha a câmera um. Para otimizar o plano de exposição, ajuste a altura do foco e clique em pegar altura. Altere os tempos de exposição e a potência do laser para uma intensidade máxima de pixels de aproximadamente 3000 e salve os parâmetros de exposição.

Selecione a guia de definição do experimento, crie um layout e um sublayout. Em seguida, arraste e solte a exposição do layout relevante, a imagem de referência, o arquivo de corte inclinado e o sublayout. Em seguida, salve o experimento.

Por fim, selecione a guia de experimento automático e adquira imagens. Para imagens de dois canais, primeiro selecione o algoritmo do software para segmentar os objetos primários, como núcleos, citosol e agregados. Primeiro, distribua 0,25 microlitros de inibidor de proteassoma dissolvido em 100% de DMSO ou DMSO em placas de fundo plano de 384 poços.

Na mesma placa, semeie manualmente 1,5 vezes 10 para as 4ª células por poço em 50 microlitros de DMEM. Em seguida, configure a unidade de controle ambiental do sistema de microscópio para 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Opere o microscópio no modo de florescência de campo amplo e como configurações de software, escolha LWD 20 vezes o modo não confocal objetivo, quatro campos por poço e intervalo de captura de uma hora.

Em seguida, selecione o algoritmo apropriado para segmentar o objeto primário, como citosol e agregados. Ajuste o limite de fundo e os parâmetros de contraste, se necessário. As linhagens celulares testadas transduzidas com SOD-1 tipo selvagem e mutante SOD-1 A4V permaneceram saudáveis, mostraram altos níveis de expressão e ampla marcação phi a longo prazo, independentemente da forma SOD.

O tratamento com inibidor de proteassoma ALLN por 24 horas promoveu o acúmulo de agregados SOD-1 A4V YFP em células HEK-293, mas não em células transduzidas por SOD-1 Wild Type YFP. Além disso, houve níveis muito baixos de agregação nas linhagens celulares U2 OS e SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP transduzidas com os mesmos vetores. Após a semeadura das células na presença ou ausência de ALLN, elas foram monitoradas quanto à formação de agregados por um período de 50 horas.

A formação de agregados ALLN atingiu um platô em 24 horas e permaneceu estável nas 12 horas seguintes. Além disso, a densidade celular diminuiu significativamente após 28 horas como resultado do efeito citotóxico do ALLN, enquanto o número de células aumentou no controle negativo tratado com DMSO. As células SOD-1 A4V YFP cultivadas na presença de inibidores de proteassoma por 24 horas foram coradas com solução de Hoechst.

A toxicidade relativa para três inibidores de proteassoma diferentes foi quantificada medindo o número de linhas celulares aderentes remanescentes no poço marcado com corante Hoechst. O número total de células diminuiu em resposta ao aumento da dose de inibidores de protease. Inversamente, a porcentagem de células que expressam agregados SOD-1 A4V aumentou com a concentração de inibidor de protease.

Ao fazer esse processo, é importante lembrar que a qualidade da célula influenciará drasticamente no seu resultado. Portanto, é importante determinar se as células estão livres de microplasma e são saudáveis ao longo das etapas. Após esse processo, outro método de imagem pode ser usado para responder a perguntas adicionais sobre a degradação da proteína ou a interação da proteína com outras usando a transferência de energia de ressonância.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar as ferramentas para testar o destino da proteína em várias células vivas usando análise de imagem de alto conteúdo. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a agregação de proteínas como ocorre em modelos celulares simples. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como neurônios diferenciados de células-tronco pluripotentes induzidas específicas do paciente.