Sobreexpressão e purificação do ser humano Cis -preniltransferase em Escherichia coli

O objetivo geral deste protocolo é superexpressar e purificar a cis-preniltransferase humana otimizada para códons em condições não desnaturantes e testar sua atividade enzimática. O procedimento é demonstrado com a cis-preniltransferase desidrodolelil difosfato sintase eucariótica de cadeia longa, ou DHDDS. Este método pode avançar nossa compreensão da síntese de isoprenóides e fornecer informações importantes sobre o mecanismo fisiopatológico da retinite pigmentosa relacionado a mutações no DHDDS.

As principais vantagens dessa técnica é que ela é simples, econômica e economiza tempo. Também pode ser generalizado para produção em alta quantidade de outras proteínas cis-preniltransferase. Comece este procedimento com a clonagem de uma expressão de DHDDS humano, conforme descrito no protocolo de texto.

Ressuspenda as células no tampão A, um micrograma por mililitro de DNase I e uma mistura de inibidores de protease. Em seguida, homogeneizar as células ressuspensas usando um homogeneizador de vidro Teflon. Interrompa as células com um microfluidizer ou equivalente a 12.000 a 15.000 psi.

Em seguida, centrifugue o lisado celular a 40.000 vezes g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Recuperar o sobrenadante que contém a fracção solúvel. Carregar o sobrenadante numa coluna de cromatografia de afinidade metálica imobilizada com cobalto de cinco a 10 milímetros com imidazol 10 milimolar.

Depois de carregar numa máquina de cromatografia líquida rápida de proteínas, efectuar uma lavagem completa da coluna com tampão A em imidazol 10 milimolar, a fim de reduzir a ligação não específica às proteínas. Comece o programa FPLC. Eluir as proteínas superexpressas com tampão A suplementado com imidazol 250 milimolar.

Após a eluição, remova o imidazol usando 53 mililitros de uma coluna de dessalinização preparativa equilibrada com tampão A. Em seguida, adicione a protease TEV marcada com hexa-histidina às proteínas eluídas para remover sua fusão DHDDS de tiorredoxina marcada com hexahistidina. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, carregue as proteínas clivadas em uma coluna de cromatografia de afinidade de metal imobilizada com cobalto equilibrada com tampão A suplementado com cinco milimolares de imidazol.

Colete o fluxo para remover a tiorredoxina marcada com hexa-histidina clivada e a protease TEV. Concentre o fluxo entre três e quatro mililitros usando um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 30 quilodaltons. Em seguida, carregar a proteína concentrada numa coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superdex 200 equilibrada com tampão A para purificação final.

Coloque as amostras em um rack de 96 poços em um coletor de frações. A proteína elui como um dímero. Selecione frações relevantes comparando o perfil de eluição com uma curva de calibração de coluna.

Neste ponto, avalie a pureza da preparação usando SDS-PAGE. Finalmente, determine a concentração de proteína necessária para experimentação a jusante e congele rapidamente alíquotas de proteínas concentradas purificadas em nitrogênio líquido. Armazene as alíquotas a 80 graus Celsius negativos até o uso.

Para garantir a capacidade da proteína de suportar ciclos de congelamento e descongelamento, descongele uma alíquota das proteínas congeladas. Centrifugar a alíquota a 21 000 vezes g durante 10 minutos para remover os agregados insolúveis. Após centrifugação, recolher o sobrenadante.

Em seguida, carregue as proteínas em uma coluna analítica Superdex 200 pré-equilibrada com TNXB usando um sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho. Monitore a fluorescência do triptofano para detectar o perfil de eluição da proteína. Certifique-se de ter uma curva de calibração válida para avaliação do peso molecular, que está disponível através dos fabricantes de colunas SEC.

Para garantir a atividade da proteína purificada, primeiro misture cinco micromolares de DHDDS purificados com 10 micromolares FPP e 50 micromolares C14 IPP. Inicie a reação no tampão A com cloreto de magnésio 0,5 milimolar a 22 a 30 graus Celsius. Retirar amostras de 15 microlitros da reação em zero, duas, quatro e seis horas após a extinção imediata da reação pela adição de 15 microlitros de tampão A suplementado com EDTA 20 milimolares.

Em seguida, adicione um mililitro de 1-butanol saturado de água e vórtice completamente para extrair os produtos da reação. O protocolo pode ser interrompido aqui e as amostras podem ser mantidas para leitura posterior. Em seguida, adicione o coquetel de cintilação às amostras.

Usando um contador de cintilação, quantifique os produtos da reação na fase butanol abrangendo C14 juntamente com a radioatividade de 15 microlitros da reação, representando a radioatividade total. Finalmente, calcule a incorporação líquida de C14 IPP em cada ponto de tempo, calculando a porcentagem utilizada das concentrações totais de C14 IPP e plote os resultados em função do tempo. Espera-se um aumento na incorporação líquida de C14 IPP com o tempo.

As amostras obtidas em cada etapa de purificação são mostradas aqui. Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual do DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. Este cromatograma representa os resultados da cromatografia analítica de exclusão de tamanho da enzima purificada, revelando que a proteína é observada apenas como um homodímero.

Aqui, a seta indica o volume vazio. Um ensaio representativo de atividade dependente do tempo revela que a incorporação de C14 IPP aumenta claramente ao longo de seis horas, verificando se a enzima purificada é funcional. Uma vez dominada, esta preparação simples pode ser feita em dois a três dias, resultando em uma enzima altamente pura e ativa.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como superexpressar e purificar a cis-preniltransferase humana de E.coli e medir sua atividade de maneira dependente do tempo.