Name: Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a implantar sondas de silicone crônicas no hipocampo de camundongos para registrar atividade de células de lugar durante corrida em esteira enriquecida. Este método permite monitorar centenas de neurônios simultaneamente com alta resolução temporal.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Coreia da ciência e tecnologia programa institucional (n º de projetos 2E26190 e 2E26170) e o programa de ciência de fronteira humana (RGY0089/2012).

todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de Coreia da ciência e tecnologia e cuidado Animal.
 1. preparando a unidade de Micro e eletrodo <ol><li>montar o micro drive.
	<ol><li>Imprimir as peças do micro-drive (controle deslizante, corpo e shell) 14 usando uma impressora 3D de alta resolução. Certifique-se as peças sem defeitos.</li>
		<li>Consertar o controle deslizante para o corpo de micro-drive com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).</li>
		<li>Soldar uma porca (tamanho 000-120 120 000/64 Hex) para a ponta do parafuso.</li>
		<li>Gire o parafuso no sentido horário para mover o controle deslizante até ou anti-horário para movê-lo para baixo.</li>
		<li>Corrigir o shell para o corpo com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).</li>
	</ol></li> <li>a sonda de montagem na unidade micro.
	<ol><li>Reparar o micromovimentação na posição horizontal, sob um microscópio binocular.</li>
		<li>Use um agrafo plana com enchimento de borracha para pegar o cabo flex da sonda silício, enquanto desanexando cuidadosamente a sonda do gabinete da expedição com fórceps. Fixar o grampo de jacaré para um manipulador.</li>
		<li>Usando o manipulador, colocar a sonda de silicone no controle deslizante micro drive, paralelamente à direção do movimento.</li>
		<li>Aplicar uma gota de cimento dental (temperatura de cura acrílica dental reparar material) para fixar a sonda para o controle deslizante. Corrija a posição da sonda se mudou. Cola não é recomendada, pois ele cura muito rápido e torna difícil reajustar a posição do eletrodo.</li>
		<li>Consertar o conector da sonda para o C-suporte (suporte conector) com cimento dental.</li>
	</ol></li> <li>Limpeza e colocar corante na sonda.
	<ol><li>Fix a sonda/Microdrive assemblage no dispositivo de limpeza de sonda. O dispositivo é equipado com 2 pequeno giro esponjas de espuma (amostras não-estéril). Ajustar a lacuna por manipulator.</li>
		<li>Embeber as esponjas com detergente.</li>
		<li>Mova lentamente a sonda em cima e para baixo entre as esponjas, que permite um toque suave. Monitorar o processo de limpeza sob um microscópio.</li>
		<li>Lavar a sonda com água destilada. Mergulhe a sonda em álcool para esterilização.</li>
		<li>Aplicar Dil (corante lipofílico fluorescente) na parte de trás dos desvios da sonda, usando um cotonete de espuma. Isto permitirá a visualização dos locais de haste no cérebro em uma fase posterior.</li>
	</ol></li> <li>Montagem do chapéu <ol><li>imprimir as peças do chapéu (cabeça-placa, titular de conector e tampa) 14 usando uma impressora 3D. As 3 partes se encaixam para formar um gabinete selado.</li>
		<li>Inserir porcas (tamanho M2 e 00-90 90 00/4) nas ranhuras da cabeça-placa e fixar com cola e cimento dental.</li>
		<li>Inserir uma anilha na ranhura da tampa e fixe com cimento dental.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cirurgia para fixação do chapéu no crânio todas as ferramentas utilizadas para a cirurgia são esterilizadas previamente em autoclave. É utilizado um dispositivo de grânulos de calor seco forto esterilizar ferramentas que tornam-se contaminadas e precisam ser esterilizados durante a cirurgia.
<ol><li>Definir o nível de isoflurano para 4% para o início da anestesia. Coloque o mouse na câmara de anestesia 5 min.</li>
	<li>Instalar o mouse em um aparelho estereotáxica.</li>
	<li>Reduzir o nível de isoflurano 1,5-2%. Ajustar o nível durante a cirurgia de acordo com o estado animal, taxa de respiração e corpo temperatura 20.</li>
	<li>Aplicar a pomada sobre os olhos.</li>
	<li>Raspar o couro cabeludo e limpar a cabeça do animal com anti-séptico (iodopovidone). Manter condições assépticas durante todas as etapas da cirurgia.</li>
	<li>Inject bupivacaína (1 mg/kg), sob o couro cabeludo. Cortar e remover parte da pele da cabeça do mouse usando a tesoura bem para expor o crânio em suas bordas parietal. Usar soro fisiológico e uma esponja hemostática de limpar e controlar o sangramento durante a cirurgia.</li>
	<li>Remover o periósteo usando uma ferramenta de raspador.</li>
	<li>Encontrar os pontos de referência sobre o crânio 21: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Ajustar a cabeça &#39; s ângulo ao longo do eixo sagital, tal que o Bregma e o lambda pontos estão à mesma altura.</li>
	<li>Dois furos (~0.5 mm de diâmetro) no crânio para os eletrodos de referência e o chão. Os furos devem ser de aproximadamente 1 mm caudal e lateral de 1 mm do Lambda.</li>
	<li>Os eléctrodos do chão e referência (tamanho miniatura 000-120 000-120/16 aço inoxidável parafusos fio acoplados aos conectores de pino).</li>
	<li>Aplicar raios ultravioleta (UV) ativador de dentina no crânio de ligação e em seguida, aplicar a luz UV para s. 45-60</li>
	<li>Aplique uma camada de cimento dental nas bordas do crânio. Evitar a propagação de cimento sobre a pele e os cabelos dos ratos.</li>
	<li>Fixe a chapa de cabeça para um manipulador estereotáxica e posicione-o acima do crânio. Lentamente Abaixe a cabeça-placa até toca ligeiramente o crânio e aplique o cimento dental na junção com o crânio. Deixe-a cura do cimento dental durante 15 min.</li>
	<li>Remover a anestesia. Consertar um conector-titular e um boné na cabeça-placa. Coloque o mouse em sua jaula depois de dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg</li>
	<li>Dar injeções sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg para os dois próximos dias e monitor cuidadosamente por qualquer sinal de dor. Os ratos normalmente acordam da anestesia dentro de 20-40 min. O implante de chapéu é relativamente luz (3,34 g), tal que os ratos não têm problemas para levantar sua cabeça, correr em labirintos e subir nas bordas de sua gaiola em casa.</li>
</ol> 3. Treinamento comportamental <ol><li>após um período de recuperação pós-operatório de 7 dias, iniciar a restrição de água a 1 mL por dia.</li>
	<li>Para fazer o cinto de esteira, corte um pedaço de tecido de veludo (5 cm por 1-2 m) e consertar pequenos objetos nele usando cola quente. Anexar objetos erigidos nas bordas da correia para não interferir com o movimento do mouse.</li>
	<li>Fixar o cinto nas rodas da esteira de sutura juntos nas duas extremidades.</li>
	<li>Instalar o mouse de cabeça-fixo na esteira inserindo e apertar os dois parafusos da placa de cabeça nas ranhuras da placa de fixação de cabeça.</li>
	<li>Iniciar o mouse para correr de cabeça-contido na esteira para a recompensa de água de formação. Entrega a recompensa de água através de uma porta de lamber. Inicialmente, coloque o mouse sobre a esteira por períodos de 10 minutos, 3 vezes por dia.</li>
	<li>Conforme o mouse se acostuma com a cabeça-fixação e começa a se mover a cintura (normalmente depois de ~ 3 dias), aumentar o treino duração de 30 min. Após 2-3 semanas, alguns ratos executar mais de 100 ensaios em 30 min (uma prova ser uma rotação completa do cinto).</li>
	<li>Escolher os ratos apresentando as melhores performances comportamentais para os experimentos de gravação.</li>
</ol> 4. Implantação da sonda silício <ol><li>colocar o rato sob anestesia.</li>
	<li>Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Limpe a superfície do crânio com solução salina.</li>
	<li>Encontrar marcadores estereotáxicos: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Medir a distância até o ponto de inserção e marcá-lo</li>
	<li>Perfurar o osso cuidadosamente até que se torne fina e transparente. Umedecer e limpe com soro fisiológico durante a perfuração.</li>
	<li>Remover cuidadosamente o osso diluído e a dura-máter usando força de precisãoPS. Mantenha a superfície do cérebro molhado com soro fisiológico, o tempo todo.</li>
	<li>Corrigir a montagem de sonda Microdrive/silício para um manipulador estereotáxica. Traga a sonda de silicone acima a craniotomia. Dane-se o titular de conector de sonda de silicone na cabeça-placa.</li>
	<li>Ligar os eléctrodos de terra/referência e amplificador de gravação. Escudo do mouse com folha de alumínio para proteger de ruído eletromagnético. Iniciar o sistema de gravação para monitorar a atividade elétrica do cérebro.</li>
	<li>, Lentamente, introduzir a sonda de silicone no cérebro usando o micromanipulador. Verificar continuamente os sinais elétricos, a distância de manipulador viajado e os desvios da sonda (certifique-se que penetram no cérebro). Actividade da unidade é visível no córtex enquanto matéria branca por baixo é relativamente silenciosa. Actividade da unidade reaparece quando as canelas de tocar a camada piramidal do hipocampo. A partir deste ponto, retrair o silício sonda 200 µm (usar o micro-drive no dia seguinte para trazer a haste de volta para a camada piramidal).</li>
	<li>Cobrir a superfície do cérebro com uma mistura de cera para osso e óleo mineral.</li>
	<li>Consertar o micro-drive para a placa de cabeça usando cimento dental. Deixe a cura do cimento dental por 15 min. Então desanexar o microcarro do manipulador estereotáxica e ponha a chapéu boina.</li>
	<li>Colocar o mouse de volta à sua jaula e dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg. Verifique se há qualquer sinal de dor. Esta cirurgia é muito menos invasiva do que a primeira e ratos são normalmente ativos dentro de 45 min, depois eles acordar da anestesia. No entanto, deixe o mouse recuperar um dia inteiro, como a sonda de silicone precisa estabilizar no cérebro.</li>
</ol> 5. Gravação de <ol><li>instalar o mouse cabeça fixa na esteira. Remova o boné chapéu</li>
	<li>Ligar o amplificador de gravação e iniciar a gravação.</li>
	<li>No primeiro dia, usar o micro-drive para mover a sonda de silicone para a camada piramidal do hipocampo. Cada volta anti-horário do parafuso move o shanks 200 µm mais profundo. Ajustar a posição da haste lentamente (~ 20-50 µm de cada vez) até que apareçam ripple oscilações 13 e unidade atividade.</li>
	<li>Nos próximos dias, ajustar a posição da haste e esperar ~ 1 h antes da gravação da atividade hippocampal enquanto o mouse é executado no cinto. Para manter a qualidade de sinal boa gravação por vários dias, remover objectos duros e baixo teto do mouse &#39; gaiola s para minimizar a possibilidade do chapéu solavancos em superfícies duras.</li>
</ol> 6. Recuperando a sonda <ol><li>colocar o rato sob anestesia.</li>
	<li>Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Remova o boné chapéu</li>
	<li>Trazer manipulator estereotáxica logo acima do micro-drive. Conserte o micro-drive para o manipulador. Desaperte o porta-conector da placa de cabeça. Remova o parafuso conectando a concha e o corpo do micro-drive.</li>
	<li>Sob a supervisão do microscópio binocular, lentamente levante a montagem de microunidade / silicon sonda com o manipulador estereotáxica, deixando a parte casca.</li>
	<li>Limpe a sonda de silicone com o dispositivo de limpeza.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Gravação crônica da atividade neuronal é fundamental para a compreensão de processos neurais como lugar hippocampal campos. Nossa abordagem para executar implantantation de sonda de silicone crônica se distingue de outros métodos7,18,19,20 pelo fato de que é relativamente simples recuperar o pacote do eletrodo em o final do experimento. Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas em mov...

Sondas de silicone apresentam diversas vantagens para gravações eletrofisiológicas, incluindo o fato de que eles são projetados com perfis afiadas, minimizando danos nos tecidos e que apresentam um layout preciso de densamente gravação sites1, 2,3,4. Eles são usados para estudar vários sistemas em diferentes espécies, incluindo5,seres humanos3,6, com diversas abordagens1,7. Ainda, seu uso recorrente é ainda relativamente limitado por causa de seu custo, fragilidade e o fato de que métodos convenientes para experimentos crônicos faltam8. Recentes avanços na tecnologia de impressão 3D tornaram possível o projeto personalizado de dispositivos como unidades de micro e cabeça-placas para permitir uma manipulação mais fácil desses eletrodos delicados. Em uma primeira etapa, descreveremos como construir e usar um conjunto de ferramentas que desenvolvemos para a implantação de silicone crônica sondas14.
Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas usando animais movimentando-se livremente, correr em labirintos, recentemente eles foram também investigados em ambientes virtuais15 e na esteira apparatii9 (figura 1A). Estes métodos experimentais oferecem a vantagem de que os animais podem ser cabeça-imobilizados, fazendo o uso de microscópio 2-fóton15, remendo-braçadeira16e optrode9,10,11 técnicas mais fácil, além de proporcionar maior controle sobre comportamento animal e pistas ambientais12. Em uma segunda etapa, apresentaremos os procedimentos para a formação de ratos e atividade de célula de lugar de gravação em um aparelho de esteira.

<table><tbody><tr><td>Sonda de Silício</td><td>Neuronexus</td><td>Buzsabi32</td><td>Eletrodo de gravação</td></tr><tr><td>Sistema de gravação</td> Impressora 3D <td>Intantech</td><td>RHD2132/RHD2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Asiga</td><td>Pico Plus 27</td><td>Impressora de alta resolução para</td></tr><tr><td>impressora 3D</td> micro-drive <td>Stratasys</td><td>Mojo</td><td>Impressora de baixa resolução para componentes de chapéu</td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>Modelo 963</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td> de esteira <td>Nós os construímos</td></tr></tbody></table>

implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Um requisito importante para a compreensão do funcionamento do cérebro é a identificação do comportamento e atividade das células correlaciona. Sondas de silicone são avançadas eletrodos para gravação eletrofisiológico em larga escala da atividade neuronal, mas os procedimentos para sua implantação crônica são ainda subdesenvolvidos. A atividade das células do hipocampo lugar chama-se correlacionar com a posição do animal no ambiente, mas os mecanismos subjacentes não são ainda claras. Para investigar o lugar células, aqui descrevemos um conjunto de técnicas que vão desde a fabricação de dispositivos para sonda de silicone crônica de implantes para o monitoramento da atividade de campo lugar em um aparelho de esteira cue-enriquecido. Uma unidade de microe um chapéu são construídos por encaixe e fixação juntos as peças de plástico 3D-impresso. Uma sonda de silicone é montada na unidade micro, limpos e revestida com corante. Uma primeira cirurgia é realizada para corrigir o chapéu no crânio de um rato. Pequenos pontos de referência são fabricados e anexados ao cinto de uma escada rolante. O mouse é treinado para executar cabeça-fixo na esteira. Uma segunda cirurgia é realizada para implantar a sonda de silicone no hipocampo, que banda larga sinais eletrofisiológicos são registrados a seguir. Finalmente, a sonda de silicone é recuperada e limpo para reutilização. A análise da atividade das células lugar na esteira revela uma diversidade de mecanismos de campo, o benefício da abordagem de estrutura de tópicos.

Um rato primeiro foi treinado para ser executado em uma correia longa de dois metros desprovido de tacos (Figura 1). Pós-implante de eletrodo, uma nova correia do mesmo comprimento, mas apresentando 3 pares de sugestões foi instalado na esteira, a fim de gerar representações espaciais de allocentric12,14. Sinais de banda larga foram registrados a uma taxa de amostragem de 30.000 Hz, usando um sistema ...

Descrevemos as medidas diversas para implante de silicone crônica sondas e gravar lugar células em ratos que são cabeça running-fixo em um aparelho de esteira cue-enriquecido.

Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

O objetivo geral deste procedimento é implantar sondas de silício crônicas no hipocampo do camundongo e registrar a atividade das células do local em camundongos que estão correndo com a cabeça fixa em uma esteira enriquecida com tacos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os mecanismos subjacentes da atividade das células de lugar. No entanto, pode ser aplicado a uma ampla gama de outros sistemas.A principal vantagem das sondas de silício é que centenas de células de lugar podem ser monitoradas simultaneamente com resolução temporal de um único potencial de ação e com informações sobre a configuração especial das células. A demonstração visual é fundamental, pois envolve uma série de etapas manuais que são delicadas e precisam ser praticadas. Comece a preparação da sonda retirando cuidadosamente a sonda do invólucro de remessa.Ao trabalhar sob um microscópio binocular, use um clipe jacaré plano com acolchoamento de borracha para agarrar o cabo flexível da sonda de silicone e levantá-lo do gabinete enquanto segura o gabinete com uma pinça. Fixe o clipe jacaré em um manipulador e, em seguida, use o manipulador para colocar a sonda de silicone no controle desli

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Gravações extracelular da atividade neuronal utilizando sondas de silício no rato anestesiado serão descritas. Esta técnica permite obter informação através de múltiplas áreas do cérebro de mais de 100 neurônios simultaneamente. Ele fornece informações com resolução única célula neuronal sobre a dinâmica conjuntos em vários circuitos locais.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Descrevemos os métodos de larga escala de gravação de várias unidades e potencial de campo local, comportando roedores com sondas de silício. Unidade de fabricação, o apego sonda para a unidade e os processos de implantação de teste são ilustrados em detalhes suficientes para a replicação fácil.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

Este vídeo descreve um protocolo para implantar uma sonda de silício linear de várias hastes no cérebro do camundongo para medir os potenciais de campo local. O procedimento envolve prender a sonda a uma unidade estereotáxica, posicioná-la com precisão sobre a região alvo do cérebro, inseri-la no cérebro e prendê-la com cimento dentário. Após a implantação, o conjunto é protegido com um invólucro. Após a recuperação, a configuração permite registrar potenciais de campo locais, fornecendo...

Registrando a atividade elétrica cerebral em camundongos que se comportam usando sondas de silício linear de haste múltipla

Este vídeo demonstra a implantação estereotáxica de um feixe de eletrodos de fio e uma fibra óptica no hipocampo de um modelo de camundongo.

Implantando um feixe de eletrodos e fibra óptica no hipocampo do camundongo

Fonte: Slezia, A. et al. A entrega eletroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) no foco epiléptico previne convulsões em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega eletroforética de ácido gama-aminobutírico (GABA) para inibir a atividade convulsiva em um camundongo anestesiado. Ele descreve as etapas envolvidas na implantação da sonda, registro da atividade neural, indução de convulsões e entrega controlada de GABA por meio de uma bomba de íons microfluídica para avaliar...

Entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico de um camundongo anestesiado

Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

O protocolo aqui apresentado fornece informações sobre o eletroencefalograma (EEG) simultâneo e avaliação comportamental em tempo real. Discutimos todas as etapas envolvidas neste protocolo como uma solução atraente para pesquisadores em muitos campos da neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória.

Monitoramento Simultâneo da Eletrofisiologia Wireless e Teste Comportamental de Memória como Ferramenta para Estudo da Neurogênese do Hipocampo

Aqui, descrevemos um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia que permitem gravações crônicas de campo e unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos jovens e adolescentes através de uma janela crítica de desenvolvimento do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além.

Um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis

Microdrives personalizados permitem a segmentação submilimétrica de locais de gravação corticais com matrizes lineares de silício.

Eletrofisiologia da Atividade Cortical Laminar no Sagui-comum

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Aprenda a implantar sondas de silicone crônicas no hipocampo de camundongos para registrar atividade de células de lugar durante corrida em esteira enriquecida. Este método permite monitorar centenas de neurônios simultaneamente com alta resolução temporal.

Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

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