Name: Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de sequenciamento de transposons de alto rendimento para identificar mutantes de Leptospira interrogans com defeitos de fitness in vivo e in vitro. Este método permite rastrear genes de virulência em modelos de hamsters.

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Este trabalho foi apoiado por um prêmio de mérito de assuntos de veteranos (a D.A.H.) e um Instituto Nacional de saúde conceder R01 AI 034431 (a D.A.H.).

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora os resultados de nossa experiência piloto para hamster desafiada intraperitonealmente com 42 L. interrogans mutantes são apresentados17, esperamos que os maiores piscinas de mutantes podem ser rastreadas por Tn-Seq Porque a frequência de transconjugants é baixa (100-200 transconjugants/acasalamento), vários acasalamentos são necessários para gerar um número suficiente de mutantes para grandes experiências de Tn-Seq. Manter um grande número de mutantes em culturas líquidas apresenta...

Identificação de genes de virulência para algumas bactérias, tais como Leptospira spp., é difícil devido ao número limitado de ferramentas genéticas disponíveis. Uma abordagem comumente utilizada é a criação de uma colecção de mutantes por mutagênese aleatória transposon, seguido da identificação do local de inserção em cada mutante e virulência testes de mutantes transposon individuais em um modelo animal. Essa abordagem é demorado, caro e requer um grande número de animais.
Quando o mutagenesis aleatório foi desenvolvido para o patógeno Leptospira interrogans, genes envolvidos na virulência foram identificados pelo teste mutantes individuais em um modelo animal1. Os mutantes foram selecionados com base em critérios como suas potenciais funções na sinalização ou motilidade ou sua membrana externa prevista ou superfície local. Como a maioria dos leptospiral genes codificam proteínas hipotéticas de função desconhecida2, selecionando os mutantes baseiam em limites esses critérios a capacidade de detectar genes de virulência leptospiral romance.
Mais recentemente, piscinas de mutantes de transposon L. interrogans foram projectadas para infecciosidade no hamster e mouse modelos3. Cada animal foi desafiado com uma piscina de até 10 mutantes. Infecciosidade de um mutante foi marcada como positivo se foi detectado por PCR das culturas obtidos de sangue e rim. Teste de PCR foi trabalhoso porque necessitava de uma reação de PCR individual para cada mutante na piscina. Porque a frequência de cada mutante nas culturas não foi quantificada, a abordagem foi inclinada para identificação de mutantes altamente atenuadas.
Descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica, como uma estratégia para a tela de forma mais eficiente para genes de virulência. TN-seq consiste da criação de uma biblioteca de mutantes por mutagénese transposon seguido por sequenciamento paralelo maciço4,5,6. Brevemente, transposon mutantes são agrupados, inoculados em animais e posteriormente recuperados de diferentes órgãos (piscinas de saída). O DNA das piscinas saída é extraído e digerido com enzimas de restrição ou distorcido pelo sonication. São realizadas duas rodadas de PCR direcionamento das junções dos locais de inserção de transposon. Esta etapa permite a adição dos adaptadores necessários para o sequenciamento. Os produtos resultantes da PCR são analisados por sequenciamento de alto rendimento para identificar o local de inserção do transposon de cada mutante da piscina junto com a sua abundância relativa, que é comparada com a composição inicial do grupo de mutantes.
A principal vantagem desta abordagem é a capacidade de tela simultaneamente um grande número de mutantes com um pequeno número de animais. TN-Seq não exige o conhecimento prévio dos locais de inserção do transposon que aumenta as chances de descobrir novos Leptospira-genes específicos envolvidos na virulência com menos tempo e maior eficiência. Porque leptospiral fardo nos tecidos é relativamente alto em roedores modelos suscetíveis a letal infecção (tipicamente 104 108 bactérias/g de tecido)7,8,9 , bem como em hospedeiros reservatório 10,11, os tecidos podem ser analisados diretamente sem a necessidade de cultura, reduzindo preconceitos devido ao crescimento em vitro .
Em estudos de Tn-Seq com a maioria dos patógenos bacterianos descritos até à data, a alta frequência de mutagênese insercional permitido infecção com grandes piscinas contendo mutantes coletivamente tendo múltiplas inserções espaçadas transposon dentro de cada gene4 ,12,13,14. TN-Seq também foi desenvolvido para uma bactéria, para o qual a frequência de mutagênese é muito inferior6. Com Leptospira, uma biblioteca de mutantes transposon pode ser gerada introduzindo o transposon em um plasmídeo sequência por conjugação, como descrito por Slamti et al.15. No entanto, a frequência de mutagénese transposon de L. interrogans é baixa. Quando o transposon Himar1 foi introduzido em um plasmídeo conjugativo, a frequência de transconjugant foi relatada para ser apenas 8,5 x 10-8 por beneficiário da pilha com a cepa de Lai de L. interrogans16 e é provável que seja da mesma forma pobre com a maioria das outras cepas de L. interrogans. O protocolo descrito aqui é em parte com base no que desenvolvi para Borrelia burgdorferi, em que a frequência de mutagênese insercional transposon é também baixa6.
Para a nossa experiência piloto com o protocolo17, realizamos mutagênese transposon com L. interrogans sorovar Manilae estirpe L495 por causa do sucesso de outros grupos em isolamento de mutantes de inserção de transposon na estirpe juntamente com a sua baixa DL50 (dose letal) para virulência1. Nós selecionados 42 mutantes por Tn-Seq e identificou vários candidatos mutantes defeituosos em virulência, incluindo dois com inserções em um gene de adenilato ciclase de candidato. O teste individual dos dois mutantes em hamsters confirmou que eles estavam deficientes em virulência17.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de canamicina de Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2,6-diaminopimélico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de espectinomicina pentahidratado</td><td>Microscópio Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 com condensador de campo escuro</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de sangue e tecido DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>Purificação de PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 505 Desmembrador Sônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>Chifre de copo de 2,5</td>" <td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Etapa 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Terminal desoxinucleotidil transferase</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Preparação de bibliotecas genômicas, etapa 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identificação do local de inserção do transposão, passo 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>passo 3.6.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>etapa 3.6.</td></tr><tr>Tecnologias <td>de vida de</td> <td>tubos de ensaio Qubit</td><td>Q32856</td><td>etapa 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plástico K2 EDTA Tubos de 2 ml</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>seringa U-100 com 26G x &frac12; &rdquo; agulha</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>desafio IP, etapa 2.2.1.</td></tr><tr><td>Seringa de ponta Luer-Lok de 3 mL</td><td>309657 Punção</td><td></td><td>cardíaca, etapa 2.4.2.</td></tr><tr><td>25G X 5/8" agulha</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>Punção cardíaca, etapa 2.4.2.</td></tr><tr><td>Base de vidro frita de 25 mm com rolha</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Sistema de unidade de filtração, passo 1.1.7.</td></tr><tr><td>Braçadeira de mola de alumínio de 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Sistema de unidade de filtração, etapa 1.1.7.</td></tr><tr><td>Funil de vidro borosilado de 15 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Sistema de unidade de filtração, etapa 1.1.7.</td></tr><tr><td>Balão Erlenmeyer de 125 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Sistema de unidade de filtração, passo 1.1.7.</td></tr><tr><td>Filtro de acetato-celulose VVPP (tamanho dos poros 0,1 mm; diâmetro 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

elevado-throughput sequenciamento paralela à medida fitness de leptospira interrogans transposon inserção mutantes durante a golden sírio hamster infecção

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Este manuscrito, descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica para identificar e quantificar os mutantes de Leptospira interrogans alterados em fitness durante a infecção de hamsters sírios dourados. TN-Seq combina o mutagenesis aleatório transposon com o poder da tecnologia de sequenciamento de alta produtividade. Animais são desafiados com uma piscina de mutantes transposon (pool de entrada), seguida de colheita de sangue e tecidos alguns dias mais tarde para identificar e quantificar o número de mutantes em cada órgão (piscinas de saída). As piscinas de saída são comparadas com o pool de entrada para avaliar a aptidão na vivo de cada mutante. Esta abordagem permite a triagem de uma grande piscina de mutantes em um número limitado de animais. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser executado com qualquer modelo animal de leptospirose, modelos de hospedeiro reservatório tais como ratos e modelos de infecção aguda, tais como os hamsters, bem como estudos em vitro . TN-Seq fornece uma ferramenta poderosa para a tela para mutantes com defeitos de aptidão in vivo e in vitro .

Criação de uma biblioteca de mutantes transposon em L. interrogans por conjugação requer uma unidade de filtração, como mostrado na Figura 1. Recuperamos a 100-200 transconjugants de cada acasalamento.
O local de inserção do transposon é identificado em cada mutante pelo sequenciamento do produto do PCR gerado pelo PCR semi-aleatório que tem como alvo o fim do transposon e acolhimento adjac...

Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .

Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

O objetivo geral desta técnica de sequenciamento de transposons de alto rendimento é identificar e quantificar mutantes de transposons com defeitos de aptidão in vivo e in vitro e, assim, identificar genes de Leptospira envolvidos na virulência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Leptospira, como a identificação de genes envolvidos na colonização, disseminação e sobrevivência da bactéria no hospedeiro. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de mutantes pode ser rastreado com um número limitado de animais.Embora este método tenha sido projetado para examinar a aptidão de mutantes de Leptospira interrogans no modelo de hamster com leptospirose aguda, ele também pode ser aplicado por meio de modelos de infecção crônica, estudos in vitro e outras cepas de Leptospira. Demonstrando o procedimento estarão Kritel Lourdault e Karen Evangelista, ambas pós-doutorandas do meu laboratório. Primeiro, monte uma unidade de filtragem.Colocar a base num balão Erlenmeyer de braço lateral de 125 mililitros. Posicione um filtro de acetato de celulose na base e prenda um funil na base. Conecte a unidade de filtragem a um sistema de vácuo.Em seguida, adici

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Pró-nuclear injeção (PN) do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) e sistema CRISPR-associada da proteína-9 nuclease (CRISPR/Cas9) é um método altamente eficiente para produzir hamster sírio dourado geneticamente modificado. Aqui, descrevemos o protocolo de injeção PN detalhado para a produção de hamsters de gene nocaute com o sistema CRISPR/Cas9.

Produção de geneticamente modificados Hamsters sírios dourados por injeção pró-nuclear do complexo CRISPR/Cas9

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Aqui, é descrita a aplicação da interferência CRISPR (CRISPRi) para silenciamento genético específico em espécies de Leptospira. As células leptospira são transformadas pela conjugação com plasmídeos expressando dCas9 (catalyticamente "morto" Cas9) e um RNA de guia único (sgRNA), responsável pelo emparelhamento base ao alvo genômico desejado. São apresentados métodos para validar o silenciamento genético.

Aplicação de CRISPR Interference (CRISPRi) para Silenciamento genético em espécies patogênicas de Leptospira

Este é um método adaptado para identificar fatores de colonização de insetos candidatos em um simbionte benéfico da Burkholderia. O hospedeiro de besouro é infectado por uma biblioteca mutante aleatória gerada via mutagênese transposon, e a complexidade da biblioteca após a colonização é comparada a um controle cultivado in vitro.

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

Aqui apresentamos uma avaliação longitudinal de hamsters dourados infectados intraperitonealmente (IP) ou via intragengival (IG) com L. infantum-Luc por imagem bioluminescente e por PCR. Os hamsters foram avaliados 1 dia após a infecção (1 dpi), 1 semana após a infecção (8 dpi) e 3 semanas após a infecção (22 dpi) e eutanasiados aos 50dpi e 8 meses após a infecção.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho modular BSL-2 que combina ensaios de biomassa cristal-violeta, cinética de contraste de fase em time-lapse, mapeamento confocal 3D/matricial, ultraestrutura SEM e um módulo in vivo de infecção por hamster para cultivar, quantificar, caracterizar e investigar o papel funcional do biofilme de Leptospira , possibilitando avaliação padronizada de mutantes e intervenções anti-biofilme em laboratórios.

Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Aprenda a técnica de sequenciamento de transposons de alto rendimento para identificar mutantes de Leptospira interrogans com defeitos de fitness in vivo e in vitro. Este método permite rastrear genes de virulência em modelos de hamsters.

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Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

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