Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

O objetivo geral deste estudo em um modelo de camundongo semelhante ao IPF é monitorar longitudinalmente a fibrose pulmonar com técnicas de imagem não invasivas, como FMT e micro-CT. Este método pode avançar qual sequência em relação a esses eventos moleculares específicos que ocorrem na fibrose pulmonar. A principal vantagem dessas técnicas é que as alterações anatômicas de eventos moleculares específicos podem ser monitoradas de forma não invasiva.

As aplicações dessas tecnologias se estendem à terapia da patologia da FPI, pois a fusão de FMT e micro-CT representa a possibilidade de estudar a progressão da doença e a avaliação de novas terapias. Comece posicionando um mouse anestesiado na plataforma de intubação, pendurando-o pelos incisivos colocados no fio. Ligue o laringoscópio, pegue uma pinça de ponta romba e abra suavemente a boca.

Coloque a lâmina do laringoscópio na parte de trás da boca até que a abertura da traqueia seja visualizada. Use a outra mão para inserir o tubo de entrega conectado à extremidade do tubo de PE na traqueia. Gire a válvula de três vias para fornecer 50 microlitros de bleomicina.

Após a instalação, remova rapidamente o tubo da traqueia para evitar asfixia. Segure os mouses na posição vertical por alguns segundos. Para injeção de sonda, pegue o mouse pela cauda e deixe-o segurar a tampa da gaiola.

Em seguida, segure os ombros e segure o mouse pela nuca. Mergulhe a cauda em um copo de água morna para fazer com que as veias inchem para facilitar a visualização e a inserção da agulha. Encontre as duas veias caudais em ambos os lados da cauda, não a artéria na parte inferior da cauda.

Insira a agulha de calibre 26 da seringa de 1 mililitro carregada com MMP na veia e injete a solução da sonda MMP a 10 mililitros por quilograma de peso corporal. Para começar, inicialize o software de aquisição de data e abra um novo estudo no banco de dados para o experimento. Antes de iniciar a imagem, transfira o mouse raspado e anestesiado para o meio do de imagem.

Mantenha o mouse plano, seguro e suavemente comprimido contra ambas as janelas do de imagem. Em seguida, na janela de digitalização do software, clique em Assunto"e, em seguida, visualize para ver a imagem ao vivo. Desenhe a região de varredura suficientemente grande para que os tecidos ao redor da área de fluorescência prevista sejam capturados.

Depois que o ROY for desenhado, clique em Adicionar à fila de reconstrução e, em seguida, clique em Digitalizar para criar a imagem do mouse. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, remova o mouse do de imagem e coloque-o de volta na gaiola inicial. Quantifique os picomoles de fluorescência usando a ferramenta ROY e reduza o ROY em torno de 700 a 800 milímetros cúbicos no sinal proveniente da região pulmonar.

Repita a imagem a cada sete dias ou conforme necessário. Para obter imagens por micro-CT, primeiro ligue o micro-CT pressionando o botão liga / desliga verde e inicie o software para aquecer a fonte de raios-x. Crie o banco de dados clicando em Novo banco de dados"e construa o navegador com base no número de ratos no experimento.

Antes de iniciar a varredura, selecione os parâmetros de aquisição na janela de controle do software da seguinte maneira. Defina a tensão do tubo de raios X para 90 quilovolts, a corrente do tubo de raios X do TC para 160 micro angstroms, a corrente do tubo de raios X ao vivo para 80 micro angstroms e o campo de visão para 36 milímetros. Selecione nenhuma técnica de gating "e alta resolução" e quatro minutos para a técnica de varredura.

Depois de anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano a 3%, coloque-o no leito do animal inserido no pequeno orifício com um cone de nariz fornecendo um suprimento constante de anestésico. Imobilize as patas com fita adesiva na cama para permitir que o peito fique exposto. Ao lado, a porta do instrumento se fecha e ativa o modo ao vivo para ver a posição do mouse em tempo real pressionando o botão de captura.

Mova a cama do animal para alinhar o tórax com o campo de view usando os botões no instrumento de TC. Quando o mouse estiver centralizado, gire o pórtico para confirmar a posição ideal da cama selecionando 90 graus e clicando em Definir"Em seguida, clique no botão de tomografia computadorizada. Clique em Sim"para a mensagem que informa que a fonte de raios X será ligada.

Após a imagem, coloque os animais de volta na gaiola e monitore até que se recuperem totalmente da anestesia. Repita a imagem a cada sete dias ou conforme necessário. A coloração com tricrômico de Masson revela a morfologia do tecido pulmonar.

As fotos do grupo tratado com bleomicina mostraram um padrão pronunciado de fibrose a partir do sétimo dia, principalmente como massas fibróticas únicas, e progrediram no dia 14 para conglomerados confluentes de colágeno substituído e permaneceram inalterados até o dia 21. A micro-TC repetida permitiu quantificar e segmentar as vias aéreas nos lobos pulmonares com fibrose. As vias aéreas foram divididas em uma parte central e distal.

A parte distal das vias aéreas é o trato intrapulmonar e se divide nos lobos pulmonares como lobo craniano direito, lobo médio direito, lobo caudal direito, lobo acessório direito e pulmão esquerdo. A quantificação do raio das vias aéreas mostrou aumento do raio nos camundongos tratados com bleomicina em comparação com os controles salinos. Cada ponto representa o erro padrão médio da média de cinco animais para um total de 30 camundongos.

A quantificação da fibrose pulmonar total de camundongos tratados com veículo ou bleomicina em diferentes momentos demonstra que esses parâmetros de micro-CT concordam com os achados histológicos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada para triagem de drogas rotineiramente. Após o seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para os investigadores no campo da fibrose pulmonar explorarem as eficácias do tratamento repetido em modelos animais semelhantes à FPI.