Ensaio de invasão usando matrizes 3D
Cientistas desenvolveram modelos 3D para estudar com mais precisão os processos de invasão e migração celular. Enquanto a maioria dos sistemas tradicionais de cultura celular são 2D, as células em nossos tecidos existem dentro de uma rede 3D de moléculas conhecidas como matriz extracelular ou ECM. Embora muitos dos processos mecanicistas necessários para a motilidade celular em 2D e 3D sejam semelhantes, fatores como a rigidez reduzida do ECM em comparação com superfícies plásticas, a adição de uma terceira dimensão para a migração e o obstáculo físico de se mover através da malha de polímeros longos no ECM, todos apresentam diferentes desafios à célula em comparação com a migração bidimensional.
Este vídeo introduzirá brevemente a função básica e a estrutura do ECM, bem como os mecanismos pelos quais as células modulam e migram através dele. Em seguida, discutiremos um protocolo geral usado para estudar a invasão de células endoteliais. Por fim, destacaremos várias aplicações de matrizes 3D para o estudo de diferentes questões biológicas.
Vamos começar examinando a composição do ECM, e como as células interagem com ele.
O ECM desempenha muitas funções, como fornecer suporte para as células, facilitar a comunicação intercelular e separar tecidos. A composição do ECM varia entre diferentes tecidos e possui diferentes propriedades biológicas, mas pode ser classificada em dois tipos amplos. A membrana do porão serve para ancorar e separar tecidos, enquanto a matriz intersticial envolve e suporta as células dentro de um tecido. A matriz intersticiais é composta principalmente pelo colágeno de proteína fibrosa, mas também inclui elastina e fibronectina.
Vários processos biológicos precisam ocorrer para que as células migrem através do ECM. A primeira é a adesão à matriz celular, que envolve proteínas transmembranas chamadas integrins. Estes ligam o ECM ao andaime interno da célula, conhecido como citoesqueleto.
Outro processo é o rearranjo estrutural do citoesqueleto da célula. Isso leva à formação de estruturas especializadas chamadas invadopodia, que são saliências da célula em sua matriz circundante. O passo final é a modulação do ECM. Isso normalmente envolve moléculas degradativas conhecidas como metaloproteases matricial ou MMPs, que se acumulam na invadopodia e degradam o ECM circundante, facilitando a invasão celular. Ensaios de invasão de matriz 3D permitem que os cientistas visualizem e estudem esse processo complexo.
Agora que você está familiarizado com o ECM e sua interação com as células, vamos passar por um protocolo para estudar a invasão do ECM por células endoteliais para formar túbulos. Ao cultivar células endoteliais em um ambiente 3D, pode-se simular o processo biológico de crescimento dos vasos sanguíneos, também conhecido como angiogênese, que é importante durante o desenvolvimento normal, bem como o câncer.
Primeiro, as células endoteliais são cultivadas, e uma única suspensão celular é preparada tratando as células com proteases como trippsina, e passando-as através de um filtro de malha para quebrar aglomerados celulares. A matriz 3D, comumente composta de colágeno, fibrina, laminina ou combinações mais complexas desses componentes — que podem ser preparados em laboratório ou encomendados de fornecedores comerciais — é então descongelada no gelo. Como a maioria dos preparações de ECM polimerizam em temperaturas mais altas, é útil manter outros equipamentos e reagentes frios também. A suspensão celular é misturada com a solução matricial descongelada para incorporar células, e essa mistura é colocada em uma incubadora de cultura celular onde a temperatura mais alta fará com que a matriz se polimerize.
Uma vez definida a matriz contendo células, a mídia cultural contendo fatores angiogênicos é adicionada ao prato de matriz. Usando o software de microscopia de lapso de tempo, as células individuais podem então ser rastreadas para observar sua migração através da matriz. As imagens resultantes são analisadas, e as posições das células são usadas para calcular a direção de movimento e a distância em mícrons. Esses valores podem então ser plotados para determinar a atividade locomotória — a taxa média de migração das células. Finalmente, a formação da rede de tubos é observada e analisada usando software de visualização para identificar recursos como nódulos, tubos e loops.
Agora, vamos explorar algumas aplicações de matrizes 3D em experimentos específicos.
A migração celular é mediada pela modulação ativa do citoesqueleto celular. Neste experimento, as matrizes de colágeno foram preparadas e misturadas com uma mancha contendo proteína fluorescente vermelha para permitir a visualização. Esferoides de células individuais, que são aglomerados de células flutuantes livres, foram isolados e incorporados na matriz de colágeno. Após a incubação, as células incorporadas foram manchadas para componentes citoesqueléticos específicos e imagens por microscopia de fluorescência. Os pesquisadores observaram componentes citoesqueléticos e suas alterações à medida que as células migravam através do ECM.
Os cientistas também podem estudar como as propriedades do ECM afetam a migração. Usando um sistema de gel concêntrico, onde as células estão embutidas em uma matriz de gel interior cercada por matrizes externas de concentrações variadas, os cientistas podem rastrear células usando microscopia de lapso de tempo para estudar sua migração do gel interno para o gel externo inicialmente livre de células. Os pesquisadores observaram que a maior rigidez dos géis de maior concentração resultou em aumentos tanto no deslocamento celular quanto na distância geral da migração celular.
Finalmente, ensaios de invasão matricial podem ser realizados dentro de um animal vivo para estudar angiogênese em um contexto específico de órgãos. Aqui, géis de fibrina — comumente usados na engenharia de tecidos devido à sua natureza biodegradável — foram gerados, seguidos pela implantação em pulmões de camundongos onde os géis eram mantidos no lugar por uma "cola" feita do fibrinogênio proteico. A migração celular e a formação de novos vasos sanguíneos foram permitidas nos seguintes 7 a 30 dias, após os quais os pulmões e géis fibrinas foram colhidos, fixos e seccionados. Imagens dessas seções revelaram a formação de vasos sanguíneos e alvéolos nos géis implantados, dando aos pesquisadores uma visão sobre esse aspecto crucial do desenvolvimento pulmonar em seu cenário in vivo.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre ensaios de invasão de matriz extracelular. Este vídeo discutiu a composição do ECM e como as células migram através dele, apresentou um protocolo simples para estudar a migração celular endotelial através de uma matriz 3D, e destacou vários processos celulares atualmente sendo estudados no contexto das interações célula-ECM. Como a migração de células endógenas ocorre no espaço 3D, essas condições biológicas são melhor simuladas por técnicas de cultura 3D. Melhorias na composição matricial continuarão a permitir que os cientistas repliquem com mais precisão e estudem a migração celular em laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!
A matriz extracelular (ECM) é uma rede de moléculas que fornecem uma estrutura estrutural para células e tecidos e ajuda a facilitar a comunicação int…
Cientistas desenvolveram modelos 3D para estudar com mais precisão os processos de invasão e migração celular. Enquanto a maioria dos sistemas tradicionais de cultura celular são 2D, as células em nossos tecidos existem dentro de uma rede 3D de moléculas conhecidas como matriz extracelular ou ECM. Embora muitos dos processos mecanicistas necessários para a motilidade celular em 2D e 3D sejam semelhantes, fatores como a rigidez reduzida do ECM em comparação com superfícies plásticas, a adição de uma terceira dimensão para a migração e o obstáculo físico de se mover através da malha de polímeros longos no ECM, todos apresentam diferentes desafios à célula em comparação com a migração bidimensional.
Este vídeo introduzirá brevemente a função básica e a estrutura do ECM, bem como os mecanismos pelos quais as células modulam e migram através dele. Em seguida, discutiremos um protocolo geral usado para estudar a invasão de células endoteliais. Por fim, destacaremos várias aplicações de matrizes 3D para o estudo de diferentes questões biológicas.
Vamos começar examinando a composição do ECM, e como as células interagem com ele.
O ECM desempenha muitas funções, como fornecer suporte para as células, facilitar a comunicação intercelular e separar tecidos. A composição do ECM varia entre diferentes tecidos e possui diferentes propriedades biológicas, mas pode ser classificada em dois tipos amplos. A membrana do porão serve para ancorar e separar tecidos, enquanto a matriz intersticial envolve e suporta as células dentro de um tecido. A matriz intersticiais é composta principalmente pelo colágeno de proteína fibrosa, mas também inclui elastina e fibronectina.
Vários processos biológicos precisam ocorrer para que as células migrem através do ECM. A primeira é a adesão à matriz celular, que envolve proteínas transmembranas chamadas integrins. Estes ligam o ECM ao andaime interno da célula, conhecido como citoesqueleto.
Outro processo é o rearranjo estrutural do citoesqueleto da célula. Isso leva à formação de estruturas especializadas chamadas invadopodia, que são saliências da célula em sua matriz circundante. O passo final é a modulação do ECM. Isso normalmente envolve moléculas degradativas conhecidas como metaloproteases matricial ou MMPs, que se acumulam na invadopodia e degradam o ECM circundante, facilitando a invasão celular. Ensaios de invasão de matriz 3D permitem que os cientistas visualizem e estudem esse processo complexo.
Agora que você está familiarizado com o ECM e sua interação com as células, vamos passar por um protocolo para estudar a invasão do ECM por células endoteliais para formar túbulos. Ao cultivar células endoteliais em um ambiente 3D, pode-se simular o processo biológico de crescimento dos vasos sanguíneos, também conhecido como angiogênese, que é importante durante o desenvolvimento normal, bem como o câncer.
Primeiro, as células endoteliais são cultivadas, e uma única suspensão celular é preparada tratando as células com proteases como trippsina, e passando-as através de um filtro de malha para quebrar aglomerados celulares. A matriz 3D, comumente composta de colágeno, fibrina, laminina ou combinações mais complexas desses componentes — que podem ser preparados em laboratório ou encomendados de fornecedores comerciais — é então descongelada no gelo. Como a maioria dos preparações de ECM polimerizam em temperaturas mais altas, é útil manter outros equipamentos e reagentes frios também. A suspensão celular é misturada com a solução matricial descongelada para incorporar células, e essa mistura é colocada em uma incubadora de cultura celular onde a temperatura mais alta fará com que a matriz se polimerize.
Uma vez definida a matriz contendo células, a mídia cultural contendo fatores angiogênicos é adicionada ao prato de matriz. Usando o software de microscopia de lapso de tempo, as células individuais podem então ser rastreadas para observar sua migração através da matriz. As imagens resultantes são analisadas, e as posições das células são usadas para calcular a direção de movimento e a distância em mícrons. Esses valores podem então ser plotados para determinar a atividade locomotória — a taxa média de migração das células. Finalmente, a formação da rede de tubos é observada e analisada usando software de visualização para identificar recursos como nódulos, tubos e loops.
Agora, vamos explorar algumas aplicações de matrizes 3D em experimentos específicos.
A migração celular é mediada pela modulação ativa do citoesqueleto celular. Neste experimento, as matrizes de colágeno foram preparadas e misturadas com uma mancha contendo proteína fluorescente vermelha para permitir a visualização. Esferoides de células individuais, que são aglomerados de células flutuantes livres, foram isolados e incorporados na matriz de colágeno. Após a incubação, as células incorporadas foram manchadas para componentes citoesqueléticos específicos e imagens por microscopia de fluorescência. Os pesquisadores observaram componentes citoesqueléticos e suas alterações à medida que as células migravam através do ECM.
Os cientistas também podem estudar como as propriedades do ECM afetam a migração. Usando um sistema de gel concêntrico, onde as células estão embutidas em uma matriz de gel interior cercada por matrizes externas de concentrações variadas, os cientistas podem rastrear células usando microscopia de lapso de tempo para estudar sua migração do gel interno para o gel externo inicialmente livre de células. Os pesquisadores observaram que a maior rigidez dos géis de maior concentração resultou em aumentos tanto no deslocamento celular quanto na distância geral da migração celular.
Finalmente, ensaios de invasão matricial podem ser realizados dentro de um animal vivo para estudar angiogênese em um contexto específico de órgãos. Aqui, géis de fibrina — comumente usados na engenharia de tecidos devido à sua natureza biodegradável — foram gerados, seguidos pela implantação em pulmões de camundongos onde os géis eram mantidos no lugar por uma "cola" feita do fibrinogênio proteico. A migração celular e a formação de novos vasos sanguíneos foram permitidas nos seguintes 7 a 30 dias, após os quais os pulmões e géis fibrinas foram colhidos, fixos e seccionados. Imagens dessas seções revelaram a formação de vasos sanguíneos e alvéolos nos géis implantados, dando aos pesquisadores uma visão sobre esse aspecto crucial do desenvolvimento pulmonar em seu cenário in vivo.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre ensaios de invasão de matriz extracelular. Este vídeo discutiu a composição do ECM e como as células migram através dele, apresentou um protocolo simples para estudar a migração celular endotelial através de uma matriz 3D, e destacou vários processos celulares atualmente sendo estudados no contexto das interações célula-ECM. Como a migração de células endógenas ocorre no espaço 3D, essas condições biológicas são melhor simuladas por técnicas de cultura 3D. Melhorias na composição matricial continuarão a permitir que os cientistas repliquem com mais precisão e estudem a migração celular em laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!
Cientistas desenvolveram modelos 3D para estudar com mais precisão os processos de invasão e migração celular. Enquanto a maioria dos sistemas tradicionais de cultura celular são 2D, as células em nossos tecidos existem dentro de uma rede 3D de moléculas conhecidas como matriz extracelular ou ECM. Embora muitos dos processos mecanicistas necessários para a motilidade celular em 2D e 3D sejam semelhantes, fatores como a rigidez reduzida do ECM em comparação com superfícies plásticas, a adição de uma terceira dimensão para a migração e o obstáculo físico de se mover através da malha de polímeros longos no ECM, todos apresentam diferentes desafios à célula em comparação com a migração bidimensional.
Este vídeo introduzirá brevemente a função básica e a estrutura do ECM, bem como os mecanismos pelos quais as células modulam e migram através dele. Em seguida, discutiremos um protocolo geral usado para estudar a invasão de células endoteliais. Por fim, destacaremos várias aplicações de matrizes 3D para o estudo de diferentes questões biológicas.
Vamos começar examinando a composição do ECM, e como as células interagem com ele.
O ECM desempenha muitas funções, como fornecer suporte para as células, facilitar a comunicação intercelular e separar tecidos. A composição do ECM varia entre diferentes tecidos e possui diferentes propriedades biológicas, mas pode ser classificada em dois tipos amplos. A membrana do porão serve para ancorar e separar tecidos, enquanto a matriz intersticial envolve e suporta as células dentro de um tecido. A matriz intersticiais é composta principalmente pelo colágeno de proteína fibrosa, mas também inclui elastina e fibronectina.
Vários processos biológicos precisam ocorrer para que as células migrem através do ECM. A primeira é a adesão à matriz celular, que envolve proteínas transmembranas chamadas integrins. Estes ligam o ECM ao andaime interno da célula, conhecido como citoesqueleto.
Outro processo é o rearranjo estrutural do citoesqueleto da célula. Isso leva à formação de estruturas especializadas chamadas invadopodia, que são saliências da célula em sua matriz circundante. O passo final é a modulação do ECM. Isso normalmente envolve moléculas degradativas conhecidas como metaloproteases matricial ou MMPs, que se acumulam na invadopodia e degradam o ECM circundante, facilitando a invasão celular. Ensaios de invasão de matriz 3D permitem que os cientistas visualizem e estudem esse processo complexo.
Agora que você está familiarizado com o ECM e sua interação com as células, vamos passar por um protocolo para estudar a invasão do ECM por células endoteliais para formar túbulos. Ao cultivar células endoteliais em um ambiente 3D, pode-se simular o processo biológico de crescimento dos vasos sanguíneos, também conhecido como angiogênese, que é importante durante o desenvolvimento normal, bem como o câncer.
Primeiro, as células endoteliais são cultivadas, e uma única suspensão celular é preparada tratando as células com proteases como trippsina, e passando-as através de um filtro de malha para quebrar aglomerados celulares. A matriz 3D, comumente composta de colágeno, fibrina, laminina ou combinações mais complexas desses componentes — que podem ser preparados em laboratório ou encomendados de fornecedores comerciais — é então descongelada no gelo. Como a maioria dos preparações de ECM polimerizam em temperaturas mais altas, é útil manter outros equipamentos e reagentes frios também. A suspensão celular é misturada com a solução matricial descongelada para incorporar células, e essa mistura é colocada em uma incubadora de cultura celular onde a temperatura mais alta fará com que a matriz se polimerize.
Uma vez definida a matriz contendo células, a mídia cultural contendo fatores angiogênicos é adicionada ao prato de matriz. Usando o software de microscopia de lapso de tempo, as células individuais podem então ser rastreadas para observar sua migração através da matriz. As imagens resultantes são analisadas, e as posições das células são usadas para calcular a direção de movimento e a distância em mícrons. Esses valores podem então ser plotados para determinar a atividade locomotória — a taxa média de migração das células. Finalmente, a formação da rede de tubos é observada e analisada usando software de visualização para identificar recursos como nódulos, tubos e loops.
Agora, vamos explorar algumas aplicações de matrizes 3D em experimentos específicos.
A migração celular é mediada pela modulação ativa do citoesqueleto celular. Neste experimento, as matrizes de colágeno foram preparadas e misturadas com uma mancha contendo proteína fluorescente vermelha para permitir a visualização. Esferoides de células individuais, que são aglomerados de células flutuantes livres, foram isolados e incorporados na matriz de colágeno. Após a incubação, as células incorporadas foram manchadas para componentes citoesqueléticos específicos e imagens por microscopia de fluorescência. Os pesquisadores observaram componentes citoesqueléticos e suas alterações à medida que as células migravam através do ECM.
Os cientistas também podem estudar como as propriedades do ECM afetam a migração. Usando um sistema de gel concêntrico, onde as células estão embutidas em uma matriz de gel interior cercada por matrizes externas de concentrações variadas, os cientistas podem rastrear células usando microscopia de lapso de tempo para estudar sua migração do gel interno para o gel externo inicialmente livre de células. Os pesquisadores observaram que a maior rigidez dos géis de maior concentração resultou em aumentos tanto no deslocamento celular quanto na distância geral da migração celular.
Finalmente, ensaios de invasão matricial podem ser realizados dentro de um animal vivo para estudar angiogênese em um contexto específico de órgãos. Aqui, géis de fibrina — comumente usados na engenharia de tecidos devido à sua natureza biodegradável — foram gerados, seguidos pela implantação em pulmões de camundongos onde os géis eram mantidos no lugar por uma "cola" feita do fibrinogênio proteico. A migração celular e a formação de novos vasos sanguíneos foram permitidas nos seguintes 7 a 30 dias, após os quais os pulmões e géis fibrinas foram colhidos, fixos e seccionados. Imagens dessas seções revelaram a formação de vasos sanguíneos e alvéolos nos géis implantados, dando aos pesquisadores uma visão sobre esse aspecto crucial do desenvolvimento pulmonar em seu cenário in vivo.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre ensaios de invasão de matriz extracelular. Este vídeo discutiu a composição do ECM e como as células migram através dele, apresentou um protocolo simples para estudar a migração celular endotelial através de uma matriz 3D, e destacou vários processos celulares atualmente sendo estudados no contexto das interações célula-ECM. Como a migração de células endógenas ocorre no espaço 3D, essas condições biológicas são melhor simuladas por técnicas de cultura 3D. Melhorias na composição matricial continuarão a permitir que os cientistas repliquem com mais precisão e estudem a migração celular em laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!
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Q1: What is the extracellular matrix and what are its main functions?
The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provides structural support for cells and facilitates intercellular communication. It performs several functions including anchoring and separating tissues through the basement membrane, and surrounding and supporting cells via the interstitial matrix. The interstitial matrix is primarily composed of collagen, but also includes elastin and fibronectin.
Q2: How do cells migrate through the extracellular matrix?
Cell migration through the ECM involves three key processes. First, integrins—transmembrane proteins—mediate cell-matrix adhesion by linking the ECM to the cytoskeleton. Second, the cytoskeleton undergoes structural rearrangement, forming invadopodia, which are cellular protrusions into the surrounding matrix. Finally, matrix metalloproteases (MMPs) accumulate in invadopodia and degrade the ECM, facilitating cell invasion.
Q3: Why are 3D matrices better than 2D culture systems for studying cell invasion?
While cells in tissues exist within a 3D ECM network, traditional 2D culture systems use rigid plastic surfaces. Three-dimensional matrices better simulate the biological environment by presenting reduced stiffness compared to plastic, adding a third dimension for migration, and creating physical hindrance from the mesh of long polymers. These factors present different challenges that more accurately reflect how cells migrate in vivo.
Q4: What are the main steps in preparing cells for a 3D invasion assay?
Endothelial cells are first cultured, then treated with proteases such as trypsin and passed through a mesh filter to create a single cell suspension and break up clumps. The 3D matrix—typically composed of collagen, fibrin, laminin, or combinations thereof—is thawed on ice to prevent premature polymerization. The cell suspension is mixed with the thawed matrix and placed in an incubator where higher temperature causes the matrix to polymerize.
Q5: How are cell migration and tube formation measured in 3D matrix assays?
Time-lapse microscopy software tracks individual cells through the matrix to observe migration patterns. Cell positions are analyzed to calculate movement direction and distance in microns, which are plotted to determine locomotory activity—the average migration rate. Tube network formation is visualized and analyzed using software to identify structural features such as nodes, tubes, and loops.
Q6: What do studies on ECM stiffness reveal about cell migration behavior?
Using concentric gel systems with varying matrix concentrations, researchers observed that greater stiffness in higher concentration gels resulted in increased cell displacement and overall migration distance. This demonstrates that ECM mechanical properties directly influence how cells migrate through the matrix, with stiffer environments promoting greater cell movement and invasion.
Q7: How can 3D matrix assays be used to study angiogenesis in living animals?
Fibrin gels, valued for their biodegradable nature, are implanted into mouse lungs and held in place with fibrinogen protein glue. Over 7 to 30 days, cell migration and blood vessel formation occur within the implanted gels. After harvesting and sectioning the lungs, imaging reveals blood vessel and alveoli formation, providing insights into angiogenesis in its in vivo organ-specific context.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:16
ECM Composition and Cell-ECM Interaction
3:01
Endothelial Cell Tube Formation Assay
5:01
Applications
7:08
Summary
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