4.6: Ensaio de invasão usando matrizes 3D

Os cientistas desenvolveram modelos 3D para estudar com mais precisão os processos de invasão e migração celular. Embora a maioria dos sistemas tradicionais de cultura de células seja 2D, as células em nossos tecidos existem dentro de uma rede 3D de moléculas conhecida como matriz extracelular ou ECM. Embora muitos dos processos mecanicistas necessários para a motilidade celular em 2D e 3D sejam semelhantes, fatores como a rigidez reduzida da ECM em comparação com as superfícies plásticas, a adição de uma terceira dimensão para migração e o impedimento físico de se mover através da malha de polímeros longos na ECM, todos apresentam desafios diferentes para a célula em comparação com a migração bidimensional.

Este vídeo apresentará brevemente a função básica e a estrutura da MEC, bem como os mecanismos pelos quais as células modulam e migram através dela. A seguir, discutiremos um protocolo geral usado para estudar a invasão de células endoteliais. Por fim, destacaremos várias aplicações de matrizes 3D para estudar diferentes questões biológicas.

Vamos começar examinando a composição da ECM e como as células interagem com ela.

A ECM desempenha muitas funções, como fornecer suporte para as células, facilitar a comunicação intercelular e separar tecidos. A composição da MEC varia entre os diferentes tecidos e tem diferentes propriedades biológicas, mas pode ser classificada em dois grandes tipos. A membrana basal serve para ancorar e separar os tecidos, enquanto a matriz intersticial envolve e sustenta as células dentro de um tecido. A matriz intersticial é composta principalmente pela proteína fibrosa colágeno, mas também inclui elastina e fibronectina.

Vários processos biológicos precisam ocorrer para que as células migrem através da MEC. A primeira é a adesão célula-matriz, que envolve proteínas transmembranares chamadas integrinas. Estes ligam o ECM ao andaime interno da célula, conhecido como citoesqueleto.

Outro processo é o rearranjo estrutural do citoesqueleto da célula. Isso leva à formação de estruturas especializadas chamadas invadopodia, que são saliências da célula em sua matriz circundante. A etapa final é a modulação ECM. Isso normalmente envolve moléculas degradativas conhecidas como metaloproteases de matriz ou MMPs, que se acumulam nos invadopódios e degradam a ECM circundante, facilitando a invasão celular. Os ensaios de invasão de matriz 3D permitem que os cientistas visualizem e estudem esse processo complexo.

Agora que você está familiarizado com a MEC e sua interação com as células, vamos examinar um protocolo para estudar a invasão da MEC por células endoteliais para formar túbulos. Ao cultivar células endoteliais em um ambiente 3D, pode-se simular o processo biológico de crescimento dos vasos sanguíneos, também conhecido como angiogênese, que é importante tanto durante o desenvolvimento normal quanto no câncer.

Primeiro, as células endoteliais são cultivadas e uma única suspensão celular é preparada tratando as células com proteases como a tripsina e passando-as por um filtro de malha para quebrar os aglomerados celulares. A matriz 3D, comumente composta de colágeno, fibrina, laminina ou combinações mais complexas desses componentes - que podem ser preparadas em laboratório ou encomendadas de fornecedores comerciais - é então descongelada no gelo. Como a maioria das preparações de ECM polimeriza em temperaturas mais altas, é útil manter outros equipamentos e reagentes frios também. A suspensão celular é misturada com a solução de matriz descongelada para incorporar células, e essa mistura é colocada em uma incubadora de cultura de células onde a temperatura mais alta fará com que a matriz polimerize.

Uma vez que a matriz contendo células é definida, meios de cultura contendo fatores angiogênicos são adicionados à placa da matriz. Usando o software de microscopia de lapso de tempo, as células individuais podem ser rastreadas para observar sua migração através da matriz. As imagens resultantes são analisadas e as posições das células são usadas para calcular a direção e a distância do movimento em mícrons. Esses valores podem então ser plotados para determinar a atividade locomotora - a taxa média de migração das células. Finalmente, a formação da rede de tubos é observada e analisada usando software de visualização para identificar recursos como nós, tubos e loops.

Agora, vamos explorar algumas aplicações de matrizes 3D em experimentos específicos.

A migração celular é mediada pela modulação ativa do citoesqueleto celular. Neste experimento, matrizes de colágeno foram preparadas e misturadas com um corante contendo proteína fluorescente vermelha para permitir a visualização. Esferoides celulares individuais, que são aglomerados de células flutuantes, foram isolados e incorporados na matriz de colágeno. Após a incubação, as células incorporadas foram coradas para componentes específicos do citoesqueleto e fotografadas por microscopia de fluorescência. Os pesquisadores observaram os componentes do citoesqueleto e suas alterações à medida que as células migravam através da MEC.

Os cientistas também podem estudar como as propriedades da ECM afetam a migração. Usando um sistema de gel concêntrico, onde as células são incorporadas em uma matriz de gel interna cercada por matrizes externas de concentrações variadas, os cientistas podem rastrear células usando microscopia de lapso de tempo para estudar sua migração do gel interno para o gel externo inicialmente livre de células. Os pesquisadores observaram que a maior rigidez dos géis de maior concentração resultou em aumentos no deslocamento celular e na distância geral da migração celular.

Finalmente, ensaios de invasão de matriz podem ser realizados dentro de um animal vivo para estudar a angiogênese em um contexto específico de órgão. Aqui, géis de fibrina - comumente usados na engenharia de tecidos devido à sua natureza biodegradável - foram gerados, seguidos de implantação em pulmões de camundongos, onde os géis foram mantidos no lugar por uma "cola" feito da proteína fibrinogênio. A migração celular e a formação de novos vasos sanguíneos foram permitidas nos 7 a 30 dias seguintes, após os quais os pulmões e os géis de fibrina foram colhidos, fixados e seccionados. A imagem dessas seções revelou a formação de vasos sanguíneos e alvéolos nos géis implantados, dando aos pesquisadores uma visão sobre esse aspecto crucial do desenvolvimento pulmonar em seu ambiente in vivo.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre ensaios de invasão de matriz extracelular. Este vídeo discutiu a composição da ECM e como as células migram através dela, apresentou um protocolo simples para estudar a migração de células endoteliais através de uma matriz 3D e destacou vários processos celulares atualmente sendo estudados no contexto das interações célula-ECM. Como a migração celular endógena ocorre no espaço 3D, essas condições biológicas são melhor simuladas por técnicas de cultura 3D. As melhorias na composição da matriz continuarão a permitir que os cientistas repliquem e estudem com mais precisão a migração celular em laboratório. Como sempre, obrigado por assistir!