Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

O objetivo geral deste experimento é investigar a eficácia de agentes genotóxicos em células cancerígenas usando um ensaio de eletroforese de célula única, também chamado de ensaio cometa. Este procedimento é um sentido para medir os quatro estudos toxicológicos genéticos. E é aplicável a diferentes avaliações, como a seleção anterior de candidatos a medicamentos e a pesquisa fundamental em danos e reparos no DNA.

Essa técnica fornece uma maneira direta de avaliar quantitativamente o dano ao DNA. E é eficiente, fácil de executar e relativamente barato. Prepare a agarose para o revestimento da lâmina derretendo um por cento de agarose no micro-ondas por dois a três minutos ou até que a agarose esteja completamente derretida.

Mergulhe uma lâmina de microscópio de vidro na agarose e use um pano sem fiapos para limpar um lado da lâmina. Coloque a lâmina em uma superfície plana para secar ao ar. Um filme transparente de agarose deve ser formado após a secagem.

Coloque as lâminas revestidas a 37 graus Celsius antes de usar. O efeito terapêutico da quimioterapia é avaliado em células de glioma U251 cultivadas em meio DMEM/Ham F-12 suplementado com 10% de FBS, 100 unidades por mililitro de penicilina e 10 microgramas por mililitro de estreptomicina. Digerir as células com um mililitro de tripsina durante três minutos e, em seguida, neutralizar a tripsina com meio DMEM/Ham F-12 com FBS.

Recolha as células num tubo de 15 mililitros. E gire a 300 vezes G por quatro minutos. Aspire o meio.

E suspenda as células em duas vezes 10 elevado à quinta células por mililitro em 1x PBS. Células e devem ser preparadas imediatamente antes de iniciar o ensaio. E o deve ser tratado no escuro.

Tudo com pouca luz para evitar danos. Combine a suspensão celular com um por cento de agarose de baixo ponto de fusão fundido em uma proporção de volume de um para 10. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.

E pipete imediatamente 30 microlitros em uma lâmina. Use a corrediça da ponta da pipeta para espalhar a mistura de agarose para garantir a formação de uma camada fina. Coloque as lâminas planas a quatro graus Celsius, no escuro, por 10 minutos.

Mergulhe as lâminas em solução de lise de quatro graus Celsius, no escuro por uma hora a durante a noite. Para o ensaio de cometa alcalino, remova suavemente as lâminas da solução de lise, drene o excesso de líquido e mergulhe suavemente as lâminas em AES, no escuro a quatro graus Celsius por uma hora para permitir o desenrolamento do DNA. Adicione AES pré-resfriado na bandeja de lâminas de eletroforese.

Não exceda 0,5 centímetros acima dos slides. Coloque as lâminas dentro e cubra com uma tampa. Defina a tensão da fonte de alimentação para um volt por centímetro e funcione a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Quando a eletroforese estiver concluída, drene o excesso de AES das lâminas. Mergulhe suavemente as lâminas duas vezes em água destilada em temperatura ambiente por cinco minutos de cada vez. Depois disso, mergulhe suavemente as lâminas em etanol 70% em temperatura ambiente por cinco minutos.

Para o ensaio de cometa neutro, remova suavemente as lâminas da solução de lise, drene o excesso de líquido e mergulhe suavemente em NES no escuro, a quatro graus Celsius por 30 minutos. Adicione NES pré-resfriado na bandeja de lâminas de eletroforese, não excedendo 0,5 centímetros acima das lâminas. Coloque as lâminas dentro e cubra com uma tampa.

Defina a tensão da fonte de alimentação para um volt por centímetro e funcione a quatro graus Celsius por 45 minutos. Drene o excesso de tampão das lâminas. Mergulhe suavemente as lâminas em solução de precipitação de DNA em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após 30 minutos, mergulhe suavemente as lâminas em etanol a 70% em temperatura ambiente por 30 minutos. Comece este procedimento secando as lâminas no escuro a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, coloque 50-100 microlitros de solução de coloração de ácido nucleico fluorescente verde na agarose seca de cada lâmina e pinte por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Enxágue as lâminas brevemente em água destilada e seque completamente a 37 graus Celsius no escuro. Realize a aquisição e análise de imagens imediatamente após a coloração das lâminas do cometa. Coloque uma lâmina sob um microscópio fluorescente com um suporte de lâmina.

Selecione a lente objetiva 10X e certifique-se de que o gel de agarose esteja voltado para a lente objetiva. Capture aleatoriamente imagens de cada lâmina de cometa manchada. Evite as bordas e as áreas ao redor de bolhas de ar.

Certifique-se de que cada cauda de cometa esteja distribuída horizontalmente. As cabeças dos cometas devem se originar da esquerda e a cauda da direita. Salve cada imagem em um formato binário com mancha de DNA brilhante e fundo escuro.

Para análise de imagem, primeiro carregue todas as imagens no software de ensaio de cometa, usando o botão Selecionar arquivos para analisar, localizado à esquerda da barra de ferramentas. Uma janela de visualização de imagem deve aparecer. Desenhe um quadro de medição na tela e ajuste seu tamanho de acordo com o cometa da célula.

Clique em ajustar para configurar o limite da cabeça, cometa e cauda, de acordo com a imagem. Em seguida, clique em Iniciar medições. Selecione uma célula usando o quadro e ative a medição clicando no botão Testar o Cometa.

Uma imagem de intensidade aparecerá na janela de perfis, com os parâmetros de medição selecionados. Salve os resultados clicando no botão Armazenar resultados. Analise pelo menos 50 células por tratamento.

Os resultados dos ensaios de cometas alcalinos e neutros mostram que as caudas dos cometas das células UT51 tratadas com doxorrubicina eram mais longas e tinham maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado. A análise quantitativa para o ensaio de cometa alcalino ou neutro mostrou um aumento significativo na formação de cauda de cometa, após tratamentos com doxorrubicina, indicando danos ao DNA. Um tratamento combinado de um inibidor de PARP, olaporibe, e um agente alquilante, temozolomida, aumentou significativamente o dano ao DNA nas células do glioma, refletido pelo aumento do comprimento e da intensidade do sinal da cauda do cometa.

Olaporib sozinho, não introduziu danos ao DNA. Onde como potencializou o efeito genotóxico da temozolomida. Imagens representativas de células de glioma sob tratamentos simples e combinados, mostraram as caudas de cometa mais longas e de maior intensidade das células tratadas com temozolomida e olaporibe.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas, se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da genotoxicidade medirem quebras de cadeias de DNA em muitos tipos de células ukaryóticas. Como células cultivadas ou células isoladas de organismos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o ensaio cometa para investigar a eficácia de um agente genotóxico no nível de uma única célula. Não se esqueça de que trabalhar com o reagente de danos pode ser extremamente perigoso. E os cuidados, como usar jaleco e luvas, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.