Name: Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar osteoclastos in vitro a partir de medula óssea de camundongo para investigar o papel do mTORC1 na diferenciação celular. Este método gera grandes osteoclastos multinucleados em uma semana.

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Os autores Obrigado Dr. Minghan Tong e S. Kato para ratos e gentilmente fornecendo reagentes. Agradecemos os membros do laboratório Zou para debates úteis. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções de 973 programa do ministério chinês da ciência e tecnologia (a maioria) [2014CB964704 e 2015CB964503], programa de pesquisa clínica do Hospital do povo 9, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Obrigado pela ajuda de instalação de núcleo de biologia celular e facilidade do núcleo para a biologia química, CAS centro de excelência em Molecular célula ciência, Shanghai Instituto de Bioquímica e biologia celular, Academia Chinesa de Ciências.

Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo painel administrativo de Stanford no laboratório Animal conta (APLAC) e foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de bioquímica de Shanghai e célula e cuidado Animal Biologia.
1. preparação
<ol><li>Gerar osteoclast específico Raptor exclusão ratos (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, outra vida RapCtsk) pelo acasalamento Raptorfl/fl ratos com ratos Ctsk-cre . Use os Raptorfl/fl ratos como o controle WT neste estudo.</li>
	<li>Tem um recipiente com gelo para manter os ossos isolados.</li>
	<li>
Prepare o meio de cultura.
	<ol>
<li>Prepare o meio de cultura de α-MEM completando alfa mínima essencial média (α-MEM) com 1 x de glutamina, penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bezerro.</li>
		<li>Prepare o suporte de indução de macrófagos da medula óssea consistindo de 50 mL de meio de α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.</li>
		<li>Prepare o suporte de indução de osteoclast consistindo de M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, respectivamente, em 50 mL de meio de α-MEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os seguintes buffers antes de armadilha de coloração.
	<ol>
<li>Prepare a solução de correção consistindo de 6,5 mL de acetona, 2,5 mL de solução de citrato e 0,8 mL de solução de formaldeído (vol/vol) de 37%.</li>
		<li>Prepare a armadilha solução de coloração.<ol>
<li>Escaldar com água destilada a 37 ° C.</li>
			<li>Adicione 100 µ l de solução de base rápido Granada GBC e 100 µ l de solução de nitrito de sódio em um microtubo de 1,5 mL e misture gentilmente por inversão de 30 s. deixe a mistura repousar por 2 min.</li>
			<li>Escaldar a 9 mL de água destilada a 37 ° C. Adicione 200 µ l de solução de base diazotada rápido Granada GBC da etapa 1.4.2.2, 100 µ l de solução de fosfato de naftol AS-BI, 400 µ l de solução de acetato e 200 µ l de solução de tartarato.</li>
			<li>Manter a armadilha coloração solução de mistura em um banho-maria a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare a seguinte reserva antes de quantificação de atividade de armadilha do meio de cultura.
	<ol>
<li>Preparar o tampão de tartarato (50 mL): 2 mL de ácido L-tartárico de 0,33 M, 48 mL de 0,33 M de tartarato de sódio dibásico desidratar. Ajuste o valor de pH de 4,9.</li>
		<li>Preparar o tampão de 4-nitrofenil fosfato dissódico (pNPP) (200 mL): 1,502 g de glicina, 41 mg de MgCl2, 27,2 mg de ZnCl2e 180 mL de água desionizada. Ajuste o valor de pH de 10.4 com 3 M de NaOH e o volume de 200 mL com água desionizada.</li>
		<li>Preparar pNPP buffer com substrato de fosfatase (para uma placa de 96 poços): 49,37 mg de substrato de fosfatase e 175 µ l de tampão pNPP de passo 1.5.2.</li>
		<li>Preparar o tampão de substrato (9 mL/96-placa): 6,24 mL de água desionizada, 360 μL de solução de acetato e 2,4 mL de tampão de tartarato. Misture por vórtice e pré-aqueça a 37 ° C antes do uso.</li>
		<li>Adicionar 90 μL de tampão de pNPP com fosfatase substrate(1.5.3) a 9ml de substrato pré-aquecido buffer(1.5.4) tornar-se uma mistura de substrato e vórtice por 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissecação (dia -1)
<ol><li>Eutanásia em 3 um mês de idade WT e RapCtsk ratos fêmeas separadamente pelo CO2 . Realize inalação de CO2 com equipamento adequado por pessoal treinado.</li>
	<li>Mergulhe 6 ratos em um copo com 100 mL de etanol a 75% (vol/vol) por 5 min evitar a contaminação bacteriana e coloque em um tabuleiro de dissecação em posição supina. Fazer uma incisão na distal da tíbia verticalmente e dissecar a pele ao longo do membro posterior com tesoura oftálmica.</li>
	<li>Corte do ligamento articular da articulação do quadril com uma tesoura e deslocar os membros posteriores do tronco.</li>
	<li>Cortar o ligamento articular da articulação do joelho e cuidadosamente desassociar a tíbia e o fêmur da articulação do joelho. Remova cuidadosamente o tecido mole com uma tesoura.</li>
	<li>Coloque todos os ossos de um genótipo em de um rato em cada poço de um seis--placa com 2 mL de α-MEM no gelo. Nota: Para preservar a viabilidade celular, o osso deve ser mantido nestas condições para menos de 1 h.</li>
</ol>3. isolamento (dia -1)
<ol><li>Encha um poço de uma placa de seis com 75% de etanol (3 mL) e os outros 5 poços com meio de α-MEM (3 mL).</li>
	<li>Coloque todos os ossos de um genótipo na lavagem etanol por 15 s e lavagem de ossos 5 vezes com meio de α-MEM de 10 s de cada vez.</li>
	<li>Corte as epífises com a tesoura e inserir uma agulha de seringa de 0.45 mm na cavidade e flush medula óssea fora com meio de α-MEM em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Lave a cavidade óssea, usando o mesmo método da outra extremidade do osso. Repita pelo menos duas vezes para lavar a cavidade óssea completamente até que o osso é pálido.</li>
	<li>Centrifugue a medula óssea, para obter um centrifugado a 800 x g e 4 ° C por 5 min. Aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 3 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue no tubo de centrífuga e pipeta suavemente para Ressuspender a medula óssea. Mantenha o tubo de centrífuga no gelo durante 8 min lisar células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Adicione 6 mL de meio de α-MEM no tubo de centrífuga para parar a lise celular. Centrifugar a 500 x g e 4 ° C por 10 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda em 3 mL de meio de cultura de α-MEM e colocar as células em uma placa de seis (geralmente um rato por alvéolo).</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 durante a noite.</li>
</ol>4. chapeamento (dia 0)
<ol><li>Transferi o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar as células solteira na manhã seguinte.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g e 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda em 4 mL de meio de cultura de α-MEM.</li>
	<li>Pegue 20 µ l da solução de célula e misture com 20 µ l de Trypan azul. Adicionar 10 µ l da mistura para a câmara de contagem e obter a contagem de células por mL de solução.</li>
	<li>Adicione um volume adequado do meio de cultura de α-MEM para obter uma solução de célula de 500.000 células/mL.</li>
	<li>Adicione 500 µ l e 50 µ l de meio de indução de macrófagos da medula óssea em cada poço de uma 24-placa e placa de 96 poços, respectivamente.</li>
	<li>Adicione 500 µ l e 50 µ l de solução de célula para cada poço de uma 24-placa e placa de 96 poços, respectivamente.</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 3 dias.</li>
</ol>5. diferenciação (dias 3-7)
<ol><li>Três dias depois do chapeamento, coletar meio de 50 µ l de cada poço da placa de 96-bem congelar a-20 ° C e em seguida, Aspire o meio residual.</li>
	<li>Adicione 1 mL e meio de indução 100 µ l osteoclast em cada poço de uma placa de 24 e uma placa de 96 poços, respectivamente.</li>
	<li>Incube a 37 ° C por 2 dias.</li>
	<li>Coletar 50 µ l do meio de cada poço e aspire o meio residual.</li>
	<li>Adicione meio de indução osteoclast em cada poço.</li>
	<li>Incube a 37 ° C por 1 dia. Nota: Neste ponto do tempo, grandes, multinucleados osteoclastos devem ser vistos sob um microscópio invertido (Figura 2A).</li>
	<li>Se osteoclastos não são vistos, mudar o meio de indução de osteoclasto e observar diariamente até osteoclastos são vistos.</li>
	<li>Colete 50 µ l do meio de cada poço da placa de 96 poços depois de osteoclastos se formaram.</li>
</ol>6. tartarato de coloração de fosfatase ácida resistente (TRAP)
Nota: Os osteoclastos maduros podem estar presentes após 6-7 dias de em vitro cultura (passo 4).
<ol><li>Aspire médio e lave delicadamente 3 vezes com 1X PBS.</li>
	<li>Corrigir as células em cada poço da placa de 96 poços com 100 µ l de solução por 30 s, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a fixação, aspirar a solução de correção e lave delicadamente 3 vezes com água desionizada pré-aquecido a 37 ° C. Aspire água desionizada.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de mancha de armadilha em cada poço da placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min e escudo de luz.</li>
	<li>Depois da coloração, aspirar a mancha de armadilha e delicadamente lavar 3 vezes com água desionizada.</li>
	<li>Osteoclastos de imagem usando um microscópio invertido na ampliação de X 40.</li>
</ol>7. quantificação de atividade armadilha de meio de cultura
<ol><li>Coletar 30 cultura µ l sobrenadante de cada poço da placa de 96 poços da etapa 5.1, 5.4 e 5.8; Use 30 µ l de meio de indução não-cultivadas osteoclast como controlo negativo. Coloca as amostras em uma nova placa de 96 poços.</li>
	<li>Adicione 90 μL de substrato mixture(1.5.5) em cada poço da placa de 96 poços.</li>
	<li>Coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por 1 h e escudo de luz.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 50 µ l de 3 M de NaOH para cada poço da placa de 96 poços.</li>
	<li>Medir a theabsorbance no comprimento de onda de 405 nm.</li>
</ol>8. mancha ocidental
Nota: Depois de 6-7 dias de cultura em vitro na placa de 24, osteoclastos maduros devem ser visíveis.
<ol><li>Aspire o meio.</li>
	<li>Lave suavemente com pre-cooled 1X PBS 3 vezes.</li>
	<li>Aspire PBS.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de SDS do lysis buffer contendo inibidor da protease cocktail de 1x.</li>
	<li>Lisados de calor a 105 ° C durante 10 minutos e centrifugar 12.000 × g e 4 ° C por 10 min. recolher os sobrenadantes contendo proteínas.</li>
	<li>Separar os lysates contendo 30 µ g de proteína por 10% SDS-PAGE11 ... e então transfira para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno.</li>
	<li>Bloquear as membranas com leite desnatado 5% durante 30 min.</li>
	<li>Incube as membranas com anti-Raptor anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina 1:1,000 diluição em leite desnatado 5% a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave as membranas com Tris Buffered Saline com Tween-20 (TBST) durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita a etapa 8,9 duas vezes.</li>
	<li>Incubar as membranas com peroxidase de rábano (HRP)-conjugado antirato ou coelho anticorpos IgG 1:5,000 diluição em leite desnatado 5% por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as membranas 3 vezes com TBST durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para a deteção quimioluminescente, adicionar ocidental substrato quimioluminescente de HRP sobre as membranas e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Escorra o excesso substrato e expor as manchas para filme de raio-x.</li>
</ol>

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</ol>

Todos os autores afirmam que eles não têm nenhum conflito de interesses.

O ensaio de osteoclastogenic é o método mais utilizado para isolar e cultura osteoclastos em vitro12,13. Enquanto várias induções baseadas em RANKL osteoclast têm sido descritos13,14,15, o presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.
No estudo anterior, BMMs foram chapeamento imediata...

Osso é um órgão em constante mudança e é remodelado por osteoblastos e osteoclastos ao longo da vida. Osteoclastos são responsáveis pela reabsorção de matriz mineralizada e osteoblastos sintetizam e segregam o novo osso matrizes1. O equilíbrio entre a reabsorção óssea e formação óssea é crucial para a saúde óssea, incluindo a manutenção do osso em massa e resposta à estimulação e lesão. Se esse equilíbrio é perturbado, pode ocorrer uma série de doenças metabólicas do osso, incluindo osteoporose e doenças periodontais. Estas doenças, perda de massa óssea resultante da reabsorção óssea osteoclástica excede o osso formando a capacidade de osteoblastos2,3. Assim, a fim de desenvolver metas farmacêuticas para tratar distúrbios esqueléticos, tais como osteoporose, é fundamental para compreender a geração e a biologia dos osteoclastos4.
Osteoclastos são únicas células multinucleadas gigantes localizadas em ou perto da superfície do osso e pertencem à família de monócitos/macrófagos1. Ibbotson K. J. et al. relatou um método para gerar células osteoclasto em vitro com meio contendo 1,25-diidroxi-vitamina D35. A identificação do fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e ativador do receptor para o ligante de B fator nuclear-κ (RANKL) como fatores essenciais da formação do osteoclast aumentou drasticamente a eficiência do osteoclastogenesis em vitro 1 , 6 , 7. a capacidade de cultura osteoclastos em vitro melhorou a nossa compreensão da geração e regulação dos osteoclastos.
Mamíferos/mecanicista alvo de rapamicina (mTOR) funções em dois complexos estruturalmente e funcionalmente distintos, ou seja, mTORC1 e mTORC28,9. Os dois complexos de proteínas multi são distintos uns dos outros devido a seus diferentes componentes e substratos a jusante. mTORC1 contém a proteína reguladora associada exclusiva de mTOR (Raptor), enquanto mTORC2 contém o companheiro rapamicina diferenciação da mTOR (Rictor)9. mTORC1 pode integrar e transmitir sinais importantes que regulam crescimento celular, proliferação e diferenciação. Recentemente, temos demonstrado que mTORC1 desempenha um papel fundamental na rede de reabsorção óssea catabólica pela exclusão de Raptor para inactivar mTORC1 em osteoclastos10. No entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, um método baseado em RANKL osteoclastogenic foi usado para gerar os osteoclastos de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) do selvagem-tipo (WT) e RapCtsk ratos e estudar a influência de inativação de mTORC1 no osteoclasto formação.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl ratos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre</td><td></td><td></td><td>um presente de S. Kato, Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Proteína M-CSF de camundongo recombinante</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Proteína RANKL de camundongo recombinante</td><td>R & D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>RBC lise buffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de fosfatase ácida, leucócitos (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC Solução de base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Solução de nitrito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fosfato de naftol AS-BI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tartarato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-tartárico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Tartarato de sódio dibásico desidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato de fosfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>proteína anti-P ribossômica S6 (S235 / 236)</td> <td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>proteína anti-ribossomal S6</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta;-actina</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeído</td><td>Xilong membrana científica</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>fluoreto de polivinilideno (PVDF)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato HRP Quimioluminescente Ocidental (ECL)</td> <td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Seringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um baseado em rankl osteoclast cultura ensaio de mouse medula óssea para investigar o papel de mtorc1 na formação de osteoclast

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclastos são único osso-resorbing células que diferenciam-se da linhagem de monócitos/macrófagos da medula óssea. Disfunção dos osteoclastos pode resultar em uma série de doenças metabólicas ósseas, incluindo osteoporose. Para desenvolver metas farmacêuticas para a prevenção da perda de massa óssea patológica, devem-se compreender os mecanismos pelos quais osteoclastos diferenciarem dos precursores. A capacidade de isolar e cultura de um grande número de osteoclastos em vitro é fundamental para determinar o papel de genes específicos na diferenciação do osteoclast. Inactivação do alvo da rapamicina complexo 1 (TORC1) em osteoclastos mamíferos/mecanicista pode diminuir o número de osteoclasto e aumento da massa óssea; no entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, é descrito um protocolo baseado em RANKL isolar e cultura osteoclastos da medula óssea de rato e estudar a influência de inativação de mTORC1 na formação do osteoclast. Este protocolo com sucesso resultou em um grande número de osteoclastos gigantes, normalmente dentro de uma semana. Exclusão de Raptor deficiente formação osteoclasto e diminuiu a atividade secretora fosfatase ácida tartarato-resistente, indicando que mTORC1 é fundamental para a formação do osteoclast.

Utilizando o presente protocolo, um grande número de osteoclastos gigantes foram visto no dia 6; se osteoclastos gigantes não são vistos, mais um dia de diferenciação osteoclast pode ser necessário (Figura 1). Formação osteoclast sucesso foi confirmada pela armadilha de coloração (Figura 2A). Os osteoclastos foram células gigantes de vinho vermelho/roxo com mais de 3 núcleos. Mais de 250 osteoclastos foram obtidos em cada poço da...

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar e cultivar osteoclastos in vitro da medula óssea de camundongos e estudar o papel do alvo mamífero do complexo de rapamicina na formação de osteoclastos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na formação de osteoclastos, como o papel do mTORC1 na diferenciação dos osteoclastos. A principal vantagem dessa técnica é resultar em um grande número de osteoclastos gigantes em uma semana.As implicações dessa técnica se estendem à terapia da osteoporose, pois é útil estudar o mecanismo pelo qual o osteoclasto se diferencia de seus precursores. Para iniciar este procedimento, faça uma incisão vertical na extremidade distal da tíbia de um camundongo sacrificado e disseque a pele ao longo dos membros posteriores. Em seguida, corte o ligamento articular das articulações do quadril com uma tesoura e desloque os membros posteriores do tronco.Corte o ligamento articular da articulação do joelho e dissocie cuidadosamente a tíbia e o fêmur. Remova suavemente o tecido mole com uma tesoura. Coloque todos os ossos de um camundongo em cada poço de uma placa de seis poços com dois mililitros de alfa-MEM no gelo.Para isolamento, encha um poço de uma placa de seis poços com etanol a 75% e os outros cinco poços com alfa-MEM. Coloque todos os ossos de um camundongo na lavagem com etanol por 15 segundos e, em seguida, lave os ossos cinco vezes com alfa-MEM por 10 segundos de cada vez. Corte as epífises com a tesoura e insira uma agulha de seringa de 0,45 milímetros na cavidade óssea.Lave a medula com alfa-MEM em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, lave a cavidade óssea usando o mesmo método da outra extremidade do osso. Repita pelo menos duas vezes para lavar bem a cavidade óssea até que o osso esteja pálido.Em seguida, centrifugue a medula óssea para obter um grânulo celular a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois, aspire o sobrenadante. Adicione três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo da centrífuga e pipete suavemente para ressuspender a medula óssea.Em seguida, mantenha o tubo da centrífuga no gelo por oito minutos para lisar os glóbulos vermelhos. Após oito minutos, adicione seis mililitros de alfa-MEM no tubo da centrífuga para interromper a lise celular. Centrifugar a 800 g e quatro graus Celsius durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.Em seguida, ressuspenda em três mililitros de meio de cultura alfa-MEM e coloque as células em uma placa de seis poços. Incube a 37 graus Celsius durante a noite. Nesta etapa, transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 mililitros para coletar as células soltas na manhã seguinte.Em seguida, centrifugue a 800 g e quatro graus Celsius por cinco minutos e aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em quatro mililitros de meio de cultura alfa-MEM. Pegue 20 microlitros da solução celular e misture com 20 microlitros de Trypan Blue.Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura à câmara de contagem e obtenha a contagem de células por mililitro de solução. Em seguida, adicionar um volume adequado de meio de cultura alfa-MEM para obter uma solução celular de 500 000 células por mililitro. Em seguida, adicione 500 microlitros e 50 microlitros de meio de indução de macrófagos da medula óssea em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente.Depois, adicione 500 microlitros e 50 microlitros de solução celular em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente. Incube a 37 graus Celsius por três dias. Três dias após o revestimento, colete 50 microlitros de meio de cada poço da placa de 96 poços e congele-o a 20 graus Celsius negativos.Em seguida, aspirar o meio residual. Adicione um mililitro e 100 microlitros de meio de indução de osteoclastos em cada poço de uma placa de 24 poços e uma placa de 96 poços, respectivamente. Incubar a 37 graus Celsius por dois dias.Após dois dias, colete 50 microlitros de meio de cada poço e aspire o meio residual. Em seguida, adicione o meio de indução de osteoclastos em cada poço e incube a 37 graus Celsius por um dia. Após a formação dos osteoclastos, colete 50 microlitros de meio de cada poço da placa de 96 poços.Nesta etapa, aspire o meio e lave a amostra suavemente três vezes com 1X PBS. Em seguida, fixe as células em cada poço da placa de 96 poços com 100 microlitros de solução fixa por 30 segundos em temperatura ambiente. Após a fixação, aspire a solução fixa e lave as células suavemente três vezes com água deionizada pré-aquecida a 37 graus Celsius.Em seguida, aspire a água deionizada e adicione 100 microlitros de coloração TRAP em cada poço da placa de 96 poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos e proteja-a da luz. Após a coloração, aspire a coloração TRAP e lave suavemente três vezes com água deionizada.Posteriormente, imagem dos osteoclastos em microscópio invertido com ampliação de 40X. Em seguida, transfira 30 microlitros do meio coletado antes para uma nova placa de 96 poços. Em seguida, adicione 90 microlitros de mistura de substrato em cada poço da placa de 96 poços.Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora e proteja-se da luz. Após uma hora, pare a reação adicionando 30 microlitros de hidróxido de sódio de três molares em cada poço da placa de 96 poços. Em seguida, meça a absorbância no comprimento de onda de 405 nanômetros pelo EnVision Multilabel Plate Reader.Aqui está a visão representativa dos osteoclastos observados em campo claro no sexto dia. A linha vermelha delineava a borda dos osteoclastos. E mostrado aqui é um osteoclasto tipicamente gigante, multinucleado e positivo para TRAP.A seta preta indicava dois núcleos do osteoclasto multinucleado. Esta figura mostra a coloração TRAP de BMMs no sexto dia. Imagens de alta ampliação dos quadrados em grupos de nocaute do tipo selvagem e Ctsk-Cre Raptor são mostradas, respectivamente.Estes eram osteoclastos menos gigantes e positivos para TRAP formados nos BMMs knockout Ctsk-Cre Raptor em comparação com o grupo do tipo selvagem. Esta figura mostra a atividade TRAP de BMMs nocautes do tipo selvagem cultivado e Ctsk-Cre Raptor. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de uma semana se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a viabilidade dos macrófagos da medula óssea, pois a densidade ideal de semeadura de macrófagos viáveis da medula óssea é crítica. Recomenda-se manter o osso no gelo por não mais de uma hora e ressuspender as células suavemente. Este procedimento pode ser combinado com outros métodos, como o ensaio de reabsorção de osteoclastos com cortes ósseos, para estudar a fisiologia normal e patológica dos osteoclastos.Com este método, descobrimos que o mTORC1 desempenha um papel importante na formação de osteoclastos, que pode atuar como um potencial alvo farmacológico para o tratamento de distúrbios metabólicos ósseos, como a osteoporose, no futuro.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.

A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

A diferenciação de células precursoras em osteoclastos é regulada por citocinas e fatores de crescimento. Aqui, uma nova técnica de transferência de genes para diferenciação de osteoclastos in vivo e protocolos de cultura de células para diferenciar células precursoras em osteoclastos in vitro como um método para estudar os efeitos das citocinas na osteoclastogênese são descritos.

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

A sinalização Notch é uma forma de comunicação celular que depende do contato direto entre as células. Para induzir adequadamente a sinalização Notch in vitro, os ligantes Notch devem ser apresentados às células em estado imobilizado. Este protocolo descreve métodos para estimulação in vitro da sinalização Notch em precursores de osteoclastos de camundongos.

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Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

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Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Este protocolo inclui a dissecação de murino de ossos longos e isolamento de medula óssea, para gerar os macrófagos da medula óssea e produzir osteoclastos usando macrófago da colônia fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a sua detenção por anticorpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro

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Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Aprenda a isolar e cultivar osteoclastos in vitro a partir de medula óssea de camundongo para investigar o papel do mTORC1 na diferenciação celular. Este método gera grandes osteoclastos multinucleados em uma semana.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

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