Name: Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a estababelecer modelos de infecção cerebral por vírus Zika em camundongos em estágios embrionários, neonatais e adultos. Este método permite estudar patogenia viral e microcefalia induzida.

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Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Abdellatif Benraiss na Universidade de Rochester para sua orientação e discussões relevantes para a aprendizagem do adulto cirúrgico e técnicas em recém-nascidos. Os autores também gostaria de reconhecer o Dr. James Lauderdale na UGA para o uso de seus equipamentos estereotáxicos e discussões relacionadas a criação de metodologia para esta técnica e o avanço para a Fundação de pesquisa faculdade cientistas (arcos) para sua suporte e apoio ao NIH (NINDS concede R01NS096176-02, 01-R01NS097231, & F99NS105187-01).

Todo animal usar protocolos siga as orientações de cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia e da Universidade da Geórgia. Métodos de eutanásia para barragens grávidas e adultos são executados de acordo com protocolos aprovados: asfixia de dióxido de carbono, seguida por deslocamento cervical como um método secundário para garantir a eutanásia. Filhotes neonatais são sacrificados por decapitação.
Atenção: O seguinte protocolo envolve lidar com um vírus patogênico. Precaução adequada deve ser tomada durante a manipulação do vírus. Todos os protocolos devem ser aprovados por prévia Comissão institucional adequado para usar.
1. embrionária inoculação Intracerebral de vírus Zika
<ol><li>Para acasalamento grávida cronometrado, considere meio dia do dia após o acasalamento como E0.5. Par de ratos no final do dia e verificar fichas no início da manhã para reduzir a variabilidade da época do acasalamento.</li>
	<li>Prepare a agulha de vidro antes da cirurgia. Puxe a agulha e corte em 1/3 de seu comprimento e, em seguida, nitidez em um ângulo de 45° usando um moedor de micropipeta com um gotejamento de água até o poro é dimensionado para 50-70 µm. cheque as pontas agulha sob um estereoscópio para qualidade e ruptura.</li>
	<li>Manter o vírus alíquota no gelo. Apenas antes da cirurgia, carrega o mix de injeção ZIKV para a agulha de injeção de vidro preparado. Montar a seringa de injeção hermética (volume de 50 µ l), fixação do conector luer-lock e tubulação e saturar a seringa montada com o tubo com óleo mineral. Uma vez saturado, anexar a agulha e desenhar ~ 6-7 µ l ZIKV para a agulha (~ 1 µ l é 1,7 × 106 TCID50/mL).</li>
	<li>Injetar C57BL/6J grávida ou 129S1/SvImJ ratos com embriões E14.5 dia embrionário (injectável intracraniana) ou embriões E10.5 (para injeção intra-uterina) com cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluído em solução salina estéril intraperitonealmente para induzir anestesia na mãe. Alternativamente, anestesia as mães com isoflurano monitorados isoflurano fornecido por inalação, com eliminação de gases residuais, se necessário. Injete buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por via subcutânea para induzir analgesia.</li>
	<li>Teste do beliscão anestesiados mães na ponta do dedo do pé ou cauda e depois colocá-los em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento animal-aprovado (almofada térmica de 2,5 100 x 200 mm). A pinça de aperto do dedo do pé não é estéreis e não está acostumada a lidar com tecidos em cirurgia. Alternativamente, as mãos enluvadas podem ser usadas para testar o reflexo de retirada de pitada de dedo do pé. Nota: Consulte seu pessoal veterinário institucional para o perioperatório preferencial método de aquecimento. A capa foi colocada entre esta almofada de aquecimento e o animal.</li>
	<li>Adicione pomada oftálmica nos olhos.</li>
	<li>Raspar a superfície do abdômen e esterilizar com iodo e álcool três vezes. Alternam as toalhitas de iodo e álcool; Limpe em um movimento circular, longe do local cirúrgico.</li>
	<li>Cubra a pele ao redor do sítio cirúrgico com panos esterilizados para evitar a contaminação da incisão e os instrumentos. Nota: A abertura da cortina não deve ser maior do que o sítio cirúrgico preparado; o cabelo não deve ser visto na abertura da cortina.</li>
	<li>Beliscar a pele da mãe longe de seu abdômen com fórceps e cortar a parte inferior do abdome em uma linha de 1-1,5 cm na linha sagital medial com tesoura cirúrgica estéril. Isso corta a pele e para dentro da cavidade abdominal para que os embriões estão agora expostos. Nota: Tesouras cirúrgicas são usadas para incisão da pele e camada peritoneal. Luvas e instrumentos esterilizados são utilizadas para cada cirurgia.</li>
	<li>Cortar uma fenda no meio de uma pequena gaze estéril e aplique em cima da abertura cirúrgica. Hidratar com soro fisiológico estéril. Puxe os embriões através da fenda para descansar sobre a gaze estéril, com cuidado para não remover mais de 4-5 embriões focando um corno uterino de uma só vez.</li>
	<li>Hidrate os embriões com solução salina estéril antes e durante a inoculação para garantir que eles não secam. Manter o controle de quais embriões são injetados e sua localização dentro do corno uterino. Embriões individuais, portanto, são tratados como experimentos separados, como embriões não altera a posição enquanto o desenvolvimento no útero. (Continue para a etapa de 1,15 para injeção intra-uterina).</li>
	<li>Coloque delicadamente uma espátula sob a cabeça do embrião. Ilumine os embriões com uma lâmpada para visualizar as suturas da cabeça e o crânio. Nota: Técnica asséptica é seguida, incluindo instrumentos e luvas cirúrgicas estéreis. Depois de itens não-estéril (tais como a lâmpada) são manipuladas, as luvas devem ser substituídas por novas luvas estéreis antes de manipulação de instrumentos esterilizados e áreas.</li>
	<li>Posição da cabeça através da manipulação do embrião com a lâmpada (atrás da cabeça para a visibilidade) e dedos livre até a cabeça do embrião é empurrada para cima diretamente contra a parede uterina e mantida no lugar com a mão não dominante. Nota: Posicionamento do embrião é uma parte crítica e a técnica que leva a mais prática. Muita pressão do dedo pode danificar as membranas embrionários levando a letalidade e pressão suficiente não pode dificultar a injeção.</li>
	<li>Use os vasos sanguíneos que corre ao longo da sutura do crânio como um guia. Injetar o vírus ZIKV (~ 1 µ l, 1,7 × 106 isolar mexicano TCID50/mL MEX1-44) em um dos ventrículos laterais do cérebro do embrião E14.5 com o montado de seringa e agulha. Use o controle de mídia como uma injeção de Souza.</li>
	<li>Para melhorar a retenção da gravidez, evite injeção viral de dois embriões ao lado os ovários e os dois embriões ao lado da vagina superior (figura 1A). Em geral, não mais que 6 embriões são injetados por ninhada para reduzir o tempo da cirurgia e evitar a perda de embrião.</li>
	<li>Coloque as barragens grávidas os embriões injetados e encher a cavidade abdominal com ~ solução salina estéril 0,5 mL. Para fechar, primeiro suturar os dois o músculo abdominal peritoneal e em seguida de sutura em segundo lugar a camada externa da pele com 4,0 suturas estéreis. É preferível usar suturas interrompidas; Há possibilidade de deiscência de ferida, se o rato rói a sutura.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola parcialmente repousando em uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário. Monitore as mães enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia. Desenvolva os embriões após cirurgia para variadas vezes de acordo com as experiências individuais.</li>
	<li>
Injeção intrauterina
	<ol>
<li>Com um corno uterino e embriões expostos, usar uma agulha de seringa e 27G de 1 mL para injetar o vírus de Zika 100 μL (106 TCID50 unidades suspensas em 100 μL DMEM), ou meio de controle, para o espaço intra-uterino ou no tecido placentário. Observe que embriões foram injetados para dissecções de fase embrionária. Ver trabalho anteriormente publicado para mais detalhes,18.</li>
		<li>Coloque as barragens grávidas embriões injetados e encher a cavidade abdominal com ~ solução salina estéril 0,5 mL. Para fechar, primeiro da sutura do músculo abdominal peritoneal e em seguida de sutura em segundo lugar a camada externa da pele com 4,0 suturas estéreis. É preferível usar suturas interrompidas; Há possibilidade de deiscência de ferida, se o rato rói a sutura.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma gaiola parcialmente repousando em uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário. Monitore as mães enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia. Desenvolva os embriões após cirurgia para variadas vezes de acordo com as experiências individuais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. neonatal inoculação Intracerebral de vírus Zika: P1/P0
<ol><li>Certifique-se de que as agulhas e seringas de injeção hermética (volume de 10 µ l) não estão entupidas. Limpar e testar carregando três seringas descartáveis de 20 mL com agulhas de calibre 26: um com soro fisiológico, um com 70% de etanol e um com ar para limpar as soluções. Esterilize com água sanitária 10% se usado anteriormente para a injeção do vírus.</li>
	<li>Manter o vírus no gelo. Carregar a seringa enchendo-o com soro fisiológico para reduzir o volume morto na seringa e desenhar 0,75 µ l de ar para separar o material de injeção de solução salina.</li>
	<li>Prepare uma câmara de recuperação umidificado aquecido para filhotes injetados. Usando um bloco de aquecimento, coloque um recipiente closeable (como uma caixa vazia de ponta) com uma gaze estéril e umidificar com solução salina. Pré-aqueça a ele antes de começar as injeções.</li>
	<li>Configure o microinjector, incluindo a bomba e o controlador. Determinar o código do tipo de dispositivo para a seringa específica (ou seja, para uma seringa de 10 µ l, o tipo de dispositivo é "D"). Determine a velocidade de injeção.</li>
	<li>Recolha os filhotes dia pós-natal 0 ou 1 (P1/P0) perto da instalação cirúrgica. Carrega a seringa de injeção com o vírus. Desinfectar o monte de cabeça de cachorro com 70% EtOH.</li>
	<li>Embrulhe os filhotes em uma fina camada de gaze e enterrá-los completamente em gelo para conseguir um estado anestésico. Filhotes são cryoanesthetized por 5 min. Certifique-se de que os filhotes são suficientemente anestesiados para injeção, realizando uma pitada de cauda toe sem resposta. Isto rende aproximadamente 15 min de um estado anestésico.</li>
	<li>Coloque o filhote no Monte cabeça, esterilizar a superfície da cabeça com iodo e, etanol (três vezes) e depois seque com uma limpeza sterile (isopropanol ou 70% EtOH).</li>
	<li>Lambda de marcar com um marcador preto e gravar as coordenadas em lambda usando o instrumento estereotáxica. Medir a distância de lambda para a borda do olho e início das coordenadas estereotáxicos de lambda calcular a distância de 2/5 da lambda a olho (para ambos os hemisférios, se você está injetando ambos).</li>
	<li>Re-Verifique a profundidade anestésica antes da criação de um buraco para o local da injeção. Use uma agulha de calibre 26 cuidadosamente e superficialmente perfurar o couro cabeludo e o crânio no local da injeção (o crânio é muito suave em neonatos) para criar uma abertura para a agulha de injeção.</li>
	<li>Abaixe a agulha de injeção o local perfurado e uma vez que a agulha quebrou apenas a pele, calcular uma profundidade de 1 mm para o local da injeção (ventrículo lateral) usando o instrumento estereotáxica.</li>
	<li>Uma vez que a agulha é abaixada até a profundidade de injeção, programar o microinjector para injetar: 1 µ l de vírus, a uma taxa de 10 nL/s, injetando aproximadamente 1 µ l mais de 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Quando termina a injeção, espere 30 s e retrair a agulha em incrementos de 0,5 mm, rodando o parafuso (dorsalmente), esperando 30 s após cada incremento. Nota: Isso reduz o vazamento de vírus injetado.</li>
	<li>Uma vez removido, ou carregar rapidamente a agulha e a seringa com mais vírus (vírus diferentes ou controles de simulação devem ser carregadas na seringas/agulhas separadas) ou remover o filhote da montagem da cabeça para a câmara previamente aquecida e umidificada. Monitore o filhote em poucos minutos para avaliar a recuperação. Substitua os filhotes com sua ninhada.</li>
</ol>3. adulta inoculação Intracerebral de vírus Zika
<ol><li>Injecte ratos adultos intraperitonealmente com cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluídos em solução salina estéril para induzir anestesia. Injete buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por via subcutânea para induzir analgesia. Dedo do pé/cauda beliscar o mouse para garantir seu estado anestésico e posteriormente montá-lo no instrumento estereotáxica (com uma almofada de aquecimento) para imobilizar a cabeça durante a cirurgia.</li>
	<li>Adicione pomada oftálmica nos olhos para evitar os olhos do rato sequem durante a cirurgia. Raspe o couro cabeludo começando atrás dos olhos para o início das orelhas. Esterilizar a pele exposta com iodo e 70% EtOH três vezes. Alternam as toalhitas de iodo e álcool; Limpe em um movimento circular, longe do local cirúrgico.</li>
	<li>Re-Verifique a profundidade anestésica antes da incisão da pele. Usando um bisturi, faça uma incisão de 0,5 cm ao longo da linha sagital medial da cabeça no local esterilizado, expondo o bregma. Usando um movimento de rolamento com um cotonete, limpe a superfície do crânio dos tecidos meníngeos, enquanto simultaneamente, empurrando a pele longe dos locais de injeção.</li>
	<li>A partir de bregma, alinhe o bocado de broca cirúrgica e identificar os locais de injeção, utilizando as seguintes coordenadas: AP-0,50 mm, ML: + /-1,5 mm. usando o pedal de controle, furar o crânio lentamente quanto apenas perfurar o osso até um buraco foi liberado para a agulha.</li>
	<li>Substitua a broca com a bomba de microinjector e seringa hermética (volume de 10 µ l) sobre o estereotáxica. Deixando uma bolha de ar pequena entre o vírus e a solução salina, desenhar ~ 4-5 µ l de vírus. Determine o código do tipo de dispositivo para o volume da seringa específica (ou seja, D para seringa de volume 10 μL). Abaixe a agulha para DV:-1,50 mm da superfície do cérebro. Para injetar 1 µ l de vírus, programe uma taxa de 10 nL/s, injetando aproximadamente 1 µ l mais de 1,5 min.</li>
	<li>Quando termina a injeção, espere 30 s e remova a agulha em incrementos de 0,5 mm, esperando 30 s após cada turno. Isto reduz o refluxo e escapamento do vírus injetado.</li>
	<li>Quando os injection(s) está acabados, use fórceps para soltar a pele e recuperar o crânio exposto. Sutura no couro cabeludo de volta juntos usando 4,0 suturas e remova o mouse do instrumento estereotáxica. Lugar o mouse em uma gaiola parcialmente descansando sobre uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário e monitorar enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrito aqui é um método de inoculação intracerebral do ZIKV em fases embrionárias, Neonatais e adultos para a investigação de danos ZIKV-induzida no desenvolvimento do cérebro. Embora simples, há algumas considerações que os investigadores devem tomar para garantir a qualidade do estudo e a segurança dos envolvidos.
DENV está intimamente relacionado com a ZIKV do gênero flavivirus. DENV não tem sido associada causalmente com desordens cerebrais pediátricos nos seres humanos. DENV2 com êxito ...

Microcefalia é uma condição resultante do desenvolvimento do cérebro defeituoso caracterizado por menor do que o tamanho médio da cabeça em recém-nascidos. Crianças com microcefalia apresentam uma gama de sintomas que podem incluir atraso de desenvolvimento, convulsões, deficiência intelectual, perda de audição, problemas de visão e problemas com movimento e equilíbrio, entre outros, dependendo da gravidade da doença e causa a1,2,3. Esta condição é multifatorial na natureza, com o agente infeccioso, genética e fatores ambientais relacionados ao causar microcefalia4,5,6,7,8, 9. Antes da eclosão de 2015-2016 ZIKV, 8 crianças fora do 10.000 nascimentos foram diagnosticadas com microcefalia nos Estados Unidos de acordo com o CDC10. 1 de fevereiro nost de 2016, a Organização Mundial de saúde declarou o vírus Zika uma emergência de saúde pública internacional preocupação devido ao aumento alarmante no diagnóstico de microcefalia associada com infecção ZIKV em mães11, 12. Um estudo recente do CDC em casos ZIKV nos Estados Unidos sugere que resultados de infecção maternos ZIKV em um 20-fold aumento do risco de uma criança desenvolver microcefalia em comparação com indivíduos não infectados e 4% das mães infectada de ZIKV dos EUA resultaram em crianças com microcefalia11. A taxa de defeitos de nascimento associada a microcefalia durante a gravidez de infecção de ZIKV no Brasil foram relatados para ter afetado até 17% dos bebês de mães infectadas, indicando que outros fatores na América Latina podem estar contribuindo para o aumento do risco 13. enquanto nós sabemos que o ZIKV pode causar microcefalia e patogênese em progenitoras neurais celular (NPC) população7,8,14, completa patogênese da ZIKV no desenvolvimento do cérebro Ainda não se alcançou. É importante desenvolver modelos animais para investigar os mecanismos de doença subjacente as anormalidades do cérebro associadas com infecção ZIKV.
Para estudar diretamente o efeito que o ZIKV tem no desenvolvimento do cérebro, nós primeiro desenvolveu um modelo de rato usando inoculação intracerebral do cérebro de (E14.5) 14,5 dia embrionário com ZIKV7. Nesta fase foi escolhida como considera-se representante do fim do primeiro trimestre de gestação humana14. Filhotes podem sobreviver até dia pós-natal 5 (P5) com este método de injeção intracerebral embrionário (~ 1 µ l de 1.7 x 106 cultura do tecido dose infecciosa (TCID50/mL)). Esses filhotes pós-natal exibem uma variedade de fenótipos da mesma forma observada em lactentes humanos infectados, incluindo ventrículos alargados, perda neuronal, rarefação axonal, astrogliosis e microglial ativação12,15. Um cérebro de rato recém-nascido é relativamente imaturo, semelhante à fase de desenvolvimento do cérebro humano no meio da gestação16, e desenvolvimento do cérebro do rato inclui um componente importante de pós-natal. Para estudar mais tarde infecções de fase de gestação, um método para infecção pós-Natal também é descrito. Neonatos infectados com ZIKV no P1 são capazes de sobreviver à pós-injeção de 13 dias. Infecção do sangue-nascido em fase adulta tem sido descrita no mouse anteriormente17 mas exige o uso de fatores de transcrição de fator regulador (IRF) o interferon (IFN) IRF-3, -5, estirpe de nocaute triplo-7. Este protocolo descreve um método de inoculação de ZIKV intraventricularly para contornar desativando a resposta antiviral do modelo murino no adulto. Enquanto isto contorna o sistema imunológico murino, esta via de injeção não imitar diretamente a rota típica de infecção. Para resolver esta discrepância, diretamente, o experimentador pode executar uma infecção intra-uterina de ZIKV em vez da rota intracraniana. Adotado a partir de trabalho anterior18, brevemente descrevemos esta técnica neste protocolo infecção embrionária.
As estirpes de vírus Zika implementadas com esta técnica incluem o mexicano isolado de7,MEX1-4419 e o africano isolar senhor-766 isolado em 194720. Zika MEX1-44 foi isolado em Chiapas, no México, em janeiro de 2016 de um infectado Aedes aegypti mosquito. Obtivemos deste vírus com permissão através da University of Texas Medical Branch em Galveston (UTMB). Além disso, o sorotipo do vírus Dengue (DENV2) de 2 foi inoculado usando esta técnica em um estudo de comparação. DENV2, estirpe S16803 (sequência GenBank GU289914), foi isolada a partir de uma amostra do paciente da Tailândia em 1974 e passadas em células C6/36. O vírus foi passado duas vezes em células Vero, pelo centro de referência mundial de vírus emergentes e arbovírus (WRCEVA) antes de injeções de rato. Isto demonstra que esta técnica funciona igualmente bem para diversas cepas de ZIKV e outros flavivírus que podem ter um impacto no desenvolvimento do cérebro.

<table><tbody><tr><td>Eixo de transmissão flexível Broca Suspensão Motor</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microsseringa Controlador de bomba</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp Tubulação</td><td></td> Schott-Luer-lock <td></td><td></td></tr><tr><td>(calibre 19)</td> <td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Ponto de fusão capilar</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Agulha de vidro</td></tr><tr><td>Fluoro-Max: Microesferas fluorescentes vermelhas</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Sem diluição; Use para prática de injeções</td></tr><tr><td>10 &micro; L, Modelo 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>para inoculação embrionária</td></tr><tr><td>10 &micro; L, Modelo 1701 RN SYR, Pequeno NDL Removível, 26s ga, 2 pol, estilo de ponta 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>para recém-nascido/adulto</td></tr><tr><td>4-0 Suturas de Nylon</td><td></td> <td>Etônico-Óleo</td><td></td></tr> <tr><td>Mineral</td><td>VWR</td> Extrator <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>injeta com 0,5% < anticorpos > corante</td></tr><tr><td><forte/forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de antígeno do grupo Flavivirus</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Figura 2, Figura 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

estabelecer modelos de mouse para doenças neurológicas induzida por vírus zika usando estratégias de injeção intracerebral: embrionárias, neonatal e adulto

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

O vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus atualmente endêmica na América do Sul, Central e do Norte. Agora está estabelecido que o ZIKV pode causar microcefalia e anormalidades cerebrais adicionais. No entanto, o mecanismo subjacente a patogênese da ZIKV no cérebro em desenvolvimento permanece obscuro. Intracerebrais métodos cirúrgicos são frequentemente usados em pesquisas de neurociência para responder a perguntas sobre o desenvolvimento normal e anormal do cérebro e a função cerebral. Este protocolo utiliza técnicas cirúrgicas clássicas e descreve os métodos que permitem que um modelo associado a ZIKV humana doença neurológica no sistema nervoso do rato. Enquanto inoculação direta do cérebro não modelar o modo normal de transmissão do vírus, o método permite que os investigadores perguntas específicas relativas a consequência após infecção ZIKV do cérebro em desenvolvimento. Este protocolo descreve estágios embrionários, Neonatais e adultos de inoculação intraventricular de ZIKV. Uma vez dominado, este método pode tornar-se uma técnica simples e reprodutível que leva apenas algumas horas para executar.

Imagens representativas de nossos métodos de injeção para a inoculação de ZIKV do cérebro embrionário são mostradas em diagramas com injeções intracerebrais (figura 1A) e intra-uterina e injeções de intraplacental (figura 1B), ilustrando a maneira a barragem grávida e embriões devem ser vistos e orientados para a cirurgia (protocolo de inoculação embrionárias). Figura 2A apresenta infecção ZIKV (MEX1...

Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

O objetivo geral dos métodos cirúrgicos aqui apresentados é estabelecer modelos in vivo de infecção intracraniana pelo vírus Zika. Este método pode ajudar a abordar a questão-chave no campo, como patologia e o mecanismo da infecção pelo vírus Zika no cérebro, tanto no estágio inicial quanto no estágio posterior do desenvolvimento, bem como no estágio adulto. A principal vantagem dessa técnica é que a direção da infecção do cérebro pode ser facilmente alcançada.As implicações dessa técnica se estendem a terapias ou diagnósticos de microcefalia induzida pelo vírus Zika ou outros distúrbios do neurodesenvolvimento. Embora esse método possa fornecer informações sobre a patogênese do vírus Zika, ele também pode ser aplicado para estudar outras infecções por flavivírus no cérebro, como o vírus da dengue. Pouco antes da cirurgia, coloque a mistura de injeção do vírus Zika em uma agulha de injeção de vidro preparada, montando primeiro o acessório e o tubo de injeção de 50 microlitros à prova de gás, o acessório Luer-lock e o tubo.Sature a seringa e o tubo montados com óleo mineral. Depois de saturado, coloque a agulha e puxe aproximadamente seis a sete microlitros de vírus para dentro da agulha. Depois de anestesiar uma mãe grávida com embriões E14.5, teste a profundidade da anestesia beliscando o dedo do pé ou a cauda.Quando um plano cirúrgico de anestesia for alcançado, certifique-se de que a barragem esteja deitada em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Raspe a superfície do abdômen e esterilize com iodo e álcool três vezes. Cubra a pele ao redor do local da cirurgia com panos estéreis para evitar a contaminação da incisão e dos instrumentais.Aperte e levante a pele do abdômen com uma pinça, depois use uma tesoura estéril para fazer um corte de 1 a 1 1/2 centímetro na parte inferior do abdômen na linha médio-sagital e expor os embriões. Em seguida, corte uma fenda no meio de uma pequena gaze estéril e coloque sobre a abertura cirúrgica. Hidrate a abertura e a gaze com solução salina estéril.Em seguida, puxe os embriões pela fenda para descansar na gaze, tomando cuidado para não remover mais de quatro ou cinco embriões de uma vez. Hidrate os embriões com solução salina estéril antes e durante a inoculação para garantir que não sequem. Ilumine o embrião a ser injetado com uma lâmpada para visualizar as suturas da cabeça e do crânio, em seguida, coloque suavemente uma espátula sob a cabeça do embrião a ser injetado e manipule o embrião até que a cabeça seja empurrada diretamente contra a parede uterina.Segure o embrião no lugar com a mão não dominante. Use a seringa para injetar o vírus Zika ou meio de controle nos ventrículos laterais do cérebro embrionário. Para a injeção intrauterina no estágio E11.5, use uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 27 para injetar o vírus Zika ou um meio de controle no espaço intrauterino.Para melhorar a retenção da gravidez, evite injetar os dois embriões próximos aos ovários e os dois embriões próximos à parte superior da vagina. Se realizar uma injeção intrauterina, injete no espaço intrauterino ou na placenta. Coloque os embriões de volta na mãe grávida e preencha a cavidade abdominal com aproximadamente 0,5 mililitros de solução salina estéril.Suturar o músculo peritoneal abdominal e a camada externa da pele com suturas estéreis 4-0. Mantenha a barragem em uma almofada de aquecimento e monitor enquanto se recupera da anestesia. Descongele o vírus no gelo e, em seguida, carregue a seringa enchendo-a com solução salina para reduzir o volume morto na seringa.Retire até 0,75 microlitros de ar para separar a solução salina do material de injeção. Para configurar uma câmara de recuperação aquecida e umidificada, coloque um recipiente que possa ser fechado com uma gaze estéril em uma caixa de aquecimento ajustada a 37 graus Celsius e mergulhe com solução salina. Depois de configurar a bomba microinjetora e o controlador, carregue a seringa de injeção com vírus e esterilize o suporte da cabeça da bomba da configuração cirúrgica com etanol a 70%.Então, após a crioanestesia dos filhotes neonatais por cinco minutos, garanta anestesia suficiente para injeção pela falta de resposta a uma pitada da cauda ou do dedo do pé. Coloque o filhote no suporte de cabeça. Esterilize a superfície da cabeça com iodo, depois etanol e, em seguida, seque com um lenço umedecido com álcool.Marque lambda com um marcador preto, meça a distância de lambda até a borda do olho e, usando coordenadas estereotáxicas, calcule a distância de 2/5 de lambda até o olho. Em seguida, use uma agulha de calibre 26 para perfurar cuidadosa e superficialmente o couro cabeludo e o crânio no local da injeção e crie uma abertura para a agulha de injeção. Agora abaixe a agulha de injeção no local da punção e, uma vez que a agulha tenha acabado de romper a pele, calcule uma profundidade de um milímetro para injeção no ventrículo lateral usando o instrumento estereotáxico.Assim que a agulha for abaixada até a profundidade de injeção, injete um microlitro de vírus a uma taxa de 10 nanolitros por segundo. Aguarde 30 segundos após a injeção e, em seguida, retraia a agulha em incrementos de 0,5 milímetros, girando o parafuso dorsalmente, aguardando 30 segundos após cada incremento para reduzir o vazamento do vírus injetado. Depois de terminar a injeção, transfira o filhote para a câmara pré-aquecida e umidificada e monitore até se recuperar.Imobilize a cabeça de um camundongo adulto anestesiado no instrumento estereotáxico e coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse. Depois de beliscar o dedo do pé ou a cauda para garantir um plano cirúrgico de anestesia, raspe o couro cabeludo começando atrás dos olhos até o início das orelhas. Esterilize a pele exposta com iodo e etanol 70%.Depois de fazer uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da linha médio-sagital da cabeça no local esterilizado para expor o bregma, limpe a superfície do crânio dos tecidos meníngeos e, ao mesmo tempo, afaste a pele dos locais de injeção. Alinhe a broca cirúrgica com o bregma e, em seguida, identifique o local da injeção pelas coordenadas estereotáxicas. Usando o pedal de controle, perfure lentamente o crânio até que o orifício esteja livre para a agulha.Substitua a broca pela bomba microinjetora e pela seringa estanque a gás de 10 microlitros. Deixe uma pequena bolha de ar entre a solução salina e o vírus e retire de quatro a cinco microlitros de vírus. Abaixe a agulha para 1,5 milímetros abaixo da superfície do cérebro a partir da superfície do cérebro e injete um microlitro de vírus a uma taxa de 10 nanolitros por segundo, injetando um microlitro em 1 minuto e meio.Depois de remover a agulha do cérebro em incrementos como antes, use uma pinça para soltar a pele e cobrir novamente o crânio exposto. Uma vez que o couro cabeludo tenha sido suturado com suturas 4-0, remova o mouse do stereotax e monitore em uma almofada de aquecimento até se recuperar. As células neuroprogenitoras são imunomarcadas com Pax6, visto em vermelho, e Zika vírus via antígenos de flavivírus, visto em verde, quatro dias após a injeção em E18.5.O cérebro embrionário é infectado com a cepa MEX1-44 do vírus Zika em todas as camadas do neocórtex em desenvolvimento. O ensaio TCID50 usando tecido do tecido cerebral do terceiro dia pós-natal inoculado em E14.5 mostra que o vírus Zika pode se replicar e crescer com eficiência em cérebros em desenvolvimento. Esta imagem mostra a infecção pelo vírus Zika MEX1-44 no córtex cerebral P13 após a injeção de P0.O zika é detectado usando o anticorpo contra o antígeno do grupo flavivírus visto em vermelho. Essas imagens mostram as esferas fluorescentes que foram usadas para praticar a localização da injeção e o sucesso da injeção do ventrículo lateral em adultos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de acompanhar os embriões injetados, ter controles apropriados e manter as feridas cirúrgicas pequenas.Após esse procedimento, outros métodos, como injeção intraperitoneal ou arterial, podem ser realizados para responder à pergunta adicional, como como o vírus Zika atravessa a placenta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar o modelo de camundongo in vivo da infecção pelo vírus Zika no cérebro.

establishing-mouse-models-for-zika-virus-induced-neurological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a geração de um modelo experimental de camundongo com malária cerebral. Esporozoítos isolados de mosquitos fêmeas infectados com Plasmodium berghei são injetados nas veias da cauda de um camundongo contido, levando à ruptura da barreira hematoencefálica e inflamação cerebral, causando malária cerebral. Este modelo de camundongo infectado oferece uma ferramenta valiosa para estudar a patologia microvascular in vivo associada à malária cerebral.

Geração de um modelo de camundongo de malária cerebral experimental usando esporozoítos derivados de mosquitos hospedeiros

Este vídeo demonstra o estabelecimento de um modelo in vitro de infecção pelo zika vírus em um cérebro em desenvolvimento. Organoides cerebrais humanos contendo rosetas de células-tronco, células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios são infectados com o vírus Zika. O vírus infecta NPCs e desencadeia a apoptose, interrompendo o desenvolvimento de organoides.

Desenvolvimento de um modelo in vitro de infecção pelo vírus Zika em organoides cerebrais

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de camundongo com uma infecção do SNC. Um filhote de leite é injetado com o vírus tanto intracraniana quanto intraperitonealmente. O vírus se espalha, infectando o SNC, causando morte e inflamação das células neuronais. O filhote é avaliado quanto a sintomas de infecção à medida que a doença progride.

Geração de um Modelo Murino com Infecção do Sistema Nervoso Central

O vídeo demonstra a injeção intracerebral da suspensão do zika vírus em um camundongo adulto para induzir a neurodegeneração. Um camundongo anestesiado é preso em uma estrutura estereotáxica e um orifício é perfurado no crânio exposto para injeção. Uma suspensão do vírus Zika é injetada no tecido cerebral. A infecção viral causa inflamação, levando à neurodegeneração.

Estabelecendo um modelo de neurodegeneração induzida pelo vírus Zika em um camundongo adulto

Este vídeo demonstra um procedimento para infectar células-tronco neurais fetais humanas com o vírus Zika. As células infectadas podem ser usadas para estudos adicionais.

Infecção pelo vírus Zika de células-tronco neurais fetais

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Este protocolo descreve uma técnica usada para modelar a infecção de vírus Zika do cérebro humano em desenvolvimento. Usando sua ou linhas de células-tronco projetado, pesquisadores podem usar essa técnica para descobrir os vários mecanismos ou tratamentos que podem afetar o início infecção cerebral e microcefalia resultante em embriões de Zika infectado por vírus.

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

Este artigo detalha os métodos que são usados para expandir as células-tronco neurais cérebro fetal humano na cultura, bem como diferenciá-los em vários subtipos neuronais e astrócitos, com ênfase na utilização de células-tronco neurais para estudar a infecção pelo vírus Zika.

Infecção por vírus Zika do cérebro Fetal humano culta células-tronco neurais para análise de Immunocytochemical

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para criar um modelo murino imuno-competente do ICR (Instituto do cancer da pesquisa) da infecção do sistema nervoso central para indicar o desenvolvimento da neuropatia. A monitoração de desordens encefalalitic virais agudas por contagens idênticas da doença podia ser executada mostrando a neuropatia vírus-induzida dengue in vivo.

Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

Aprenda a estababelecer modelos de infecção cerebral por vírus Zika em camundongos em estágios embrionários, neonatais e adultos. Este método permite estudar patogenia viral e microcefalia induzida.

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

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