Name: Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda o fraccionamento subcelular para estudar a activação de ERK por peptídeos derivados de mitocôndrias em células SH-SY5Y e HEK293. Este método permite analisar a localização de fosfoproteínas e cascatas de sinalização.

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Este trabalho foi apoiado por uma comunhão de Ellison/AFAR pós-doutorado no programa de pesquisa de envelhecimento de SJK, e um prêmio da Fundação de Glenn e NIH concede ao PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Todos os autores aparecem no filme.

1. tratamento de peptídeos às células <ol><li>placa 2 milhões SH-SY5Y ou células HEK293 (2 x 10 6) em um 10 cm do prato e cultivá-las por 2 dias</li> <li>(opcional) no outro dia, lave as células com Dulbecco isento de soro &#39; s modificada Águia mídia médio (DMEM) uma vez e incubar com soro DMEM livre durante a noite, se o tratamento deve ser feito em meios livres de soro.</li>
	<li>No dia 3, dissolver peptídeos de S14G-humanin em 0,2 µm filtrado, água destilada e reconstituí-los como solução estoque de 1mM. 
	Nota: Os peptídeos devem ser dissolvidos em solvente apropriado, que pode ser determinado pelas características sequência do peptide (por exemplo, carga geral) e pode ser fornecido pelo fabricante se os peptídeos são comercialmente disponíveis. Por exemplo, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c se dissolvem na água. Alíquota os peptídeos em um volume adequado (por exemplo, 50 μL) para evitar congelar e descongelar ciclos. Uma vez descongelado, não usar outra vez.</li>
	<li>Alíquota do soro-contendo pré-aquecido ou media serum-free em um Erlenmeyer de 50 mL do tubo e adicionar 1 mM temperatura de solução para torná-lo em uma concentração de trabalho (por exemplo, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Substituir a mídia com 6 mL de solução de peptídeo da etapa 1.4. e incube as celulas para a quantidade adequada de tempo. 
	Nota: Escolher o tempo de incubação, dependendo de sua condição que ativa ERK.</li>
</ol> 2. Fraccionamento subcelular para o citoplasma e núcleo <ol><li>lavar as células duas vezes com 10 mL de PBS gelado, raspar as células no prato em 5 mL de PBS gelado e transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire a PBS e ressuspender o sedimento em 200 µ l de tampão de fracionamento gelada, (pH HEPES 10mm = 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glicerol, 1% não iónico (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), inibidores da protease/fosfatase). 
	Nota: Para manter as proteínas no seu estatuto de fosforilação, o inibidor da fosfatase como bem como protease inibidor deve ser adicionado recentemente e as amostras devem ser mantidas no gelo em todos os tempos. Repetição de congelamento e degelo ciclos de amostras devem ser evitados. Amostras de alíquotas em pequena quantidade (por exemplo, 50 μg) antes de congelá-los a -80 ° C.</li>
	<li>Incubar a pelota re-suspensa no gelo por 15 min e em seguida centrifugar a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Recolher o sobrenadante como a fração citoplasmática e manter a pelota para a fração nuclear.</li>
	<li>De centrifugação o sobrenadante para remover restos celulares e outros contaminantes a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e depois transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração do citosol.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em tampão de lavagem gelada 200 μL (pH HEPES 10mm = 7,6, 1,5 mM de MgCl 2, 420 mM de NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inibidores da protease/fosfatase) e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 100 μL gelada, nuclear solução tampão (pH HEPES 20 mM = 7,6, 1,5 mM de MgCl 2, 420 mM de NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inibidores da protease/fosfatase) e proceda à sonicação 10 vezes (5 s, 10 s fora, 30% amp.) na Ice.</li>
	<li>Centrifugar a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração nuclear.</li>
	<li>Quantify a quantidade de proteína usando um ensaio BCA</li></ol>
 3. fração mitocondrial bruto <ol><li>lavar as células em cada prato de 10 cm com 10 mL de PBS gelado, adicionar 5 mL PBS gelado e separar as células com uma espátula de celular. 
	Nota: Use três pratos de 10cm de células para obter um bom rendimento da mitocôndria para Western Bloting.</li>
	<li>Transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e combinar tudo a partir de três pratos de 10 cm em um tubo cônico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar as células a 600 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire a PBS e ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de isolamento de mitocôndrias gelada (10 mM Tris-MOPS, 1 mM Tris/EGTA, 200 mM de sacarose, ajustar o pH = 7,4).</li>
	<li>Homogeneizar as células com 25 golpes de um homogeneizador de 2 mL com pilão revestida de politetrafluoretileno na Ice. 
	Nota: Este passo é fundamental para manter a integridade mitocondrial e maximizar o rendimento da fração mitocondrial. O número de traços deve ser otimizado para cada tipo de célula. Precool o homogenizador antes de iniciar o procedimento.</li>
	<li>Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrifugadora e centrifugar, a 600 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover núcleos e células ininterrupta.</li>
	<li>Recolher o sobrenadante, transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugadora e centrifugá-lo em 7.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. 
	Nota: A pelota é solta, recolher o sobrenadante com cuidado e tente não perturbar a pelota.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 μL de tampão de isolamento de mitocôndrias gelada, transferir a solução para um tubo de microcentrifugadora novo. Centrifugar o tubo a 7.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	Repita o passo 3.8 para lavar o sedimento de <li>. Não é necessário transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga nesta etapa.</li>
	<li>Retire o pellet lavado o sobrenadante e ressuspender o sedimento contendo mitocôndria com 50 μL de tampão RIPA.</li>
	<li>Incubar a suspensão no gelo durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 16.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração mitocondrial.</li>
	<li>Quantificar a quantidade de proteína usando um ensaio BCA.</li>
</ol> 4. Mancha ocidental para Phospho-específicas proteínas <ol><li>realizar uma eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (gel de 8-16% premade) e a proteína de transferência para uma membrana PVDF 4.</li>
	<li>Incubar a membrana com 5% BSA em TBST (0,1% polissorbato 20) por 30 min à temperatura ambiente para bloquear sites de fundo inespecificas. 
	Nota: Para a deteção de proteína fosforilada, bloquear a membrana com BSA não leite. O leite contém caseína, um phosphoprotein abundante, o que resulta em alto sinal inespecífico.</li>
	<li>Incubar a membrana com o anticorpo primário (antifosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, lave a membrana com TBST (0,1% polissorbato 20) três vezes por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpo secundário (anticoelho HRP) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar a membrana com TBST (0,1% polissorbato 20) três vezes por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar a membrana com solução ECL e imagem da membrana no analisador de imagem.</li>
	<li>Tira a membrana com descascamento de buffer para 15 min a temperatura e a lavagem da membrana com TBST três vezes durante 5 min.</li>
	<li>Repita os passos 4.2 a 4.7 usando anticorpo anti-total ERK1/2.</li>
	<li>Para verificar a pureza de cada fração, executar SDS-PAGE e executar immunoblots usando anticorpos reconhecendo marcadores para cada compartimento (por exemplo, B1 jesuina para núcleo, GAPDH para o citosol e TOM20 para as mitocôndrias).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen é sócio e consultor para Kelvin CohBar, Inc., Yen atuou como consultor da CohBar, Inc.

Aqui, temos demonstrado que humanin mediada por peptídeo ERK1/2 ativação ocorre em dois diferentes tipos de células, e a Localização subcellular de ERK1/2 registrados pode ser diferente dependendo das condições (por exemplo, dose de peptídeo, ponto do tempo e célula tipo). Tem sido demonstrado que humanin sinais através de dois receptores diferentes22,23, que pode explicar as diferenças na sinalização entre as linhas de duas células, bem como a exigência...

Estudos emergentes mostram que peptídeos derivados mitocondriais (MDPs) desempenham importantes funções no metabolismo e cytoprotection1,2,3. Compreensão da via de transdução de sinal na presença de MDPs nos dá insight sobre o mecanismo pelo qual o MDPs modular várias funções. O primeiro PDM identificado, humanin, foi mostrado para aumentar a quinase de sinal-regulado extracellular 1/2 (ERK1/2) fosforilação através de seu receptor ligação4,5. No entanto, o efeito a jusante de ERK1/2 ativação é ainda underexplored.
A cascata de ERK1/2 serve como um mediador essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a proliferação, migração celular, metabolismo celular, sobrevivência e apoptose6,7,8. Para orquestrar todos estes processos celulares distintos, a atividade e Localização subcellular de ERK1/2 estão fortemente regulamentados por fosfatases e proteínas de andaime9,10. Além de modificação pós-traducional, o vaivém dinâmico de ERK1/2 também regula sua sinalização função, atividade e especificidade11,12. ERK1/2 é principalmente localizadas no citosol13. Um conjunto de proteínas de ancoragem e andaime ajudar a reter ERK1/2 elementos do citoesqueleto, na superfície das organelas, ou difusa no citoplasma13. Após a estimulação, ERK1/2 é fosforilada e torna-se dissociado de suas proteínas de ancoragem, permitindo a translocação de ERK1/2 para outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo, mitocôndrias, Golgi e lisossomos14, 15 , 16.
Embora humanin seja conhecido para ativar a via de sinalização ERK1/2, a ativação de ERK1/2 só é observada no lisado celular total. Conforme descrito anteriormente, desde que a Localização subcellular ERK1/2 desempenha um papel crucial em seu efeito a jusante, a análise de tanto a Localização subcellular e os níveis totais de fosforilada ERK1/2 é necessário para fornecer uma compreensão abrangente de ativação induzida por humanin de ERK1/2 e a ativação dos destinos a jusante.
Para entender as organelas do alvo do ativado ERK1/2, realizou-se o fraccionamento subcelular seguido pela mancha ocidental para fosforilada ERK1/2. Este método pode ser implementado facilmente como ele utiliza reagentes e equipamentos laboratoriais padrão. Os compartimentos subcellular isolados são de alta pureza, permitindo que o resultado deve ser interpretado direta. Immunostaining de ERK1/2 pode produzir resultados semelhantes. No entanto, certos compartimentos subcellular são relativamente difíceis de Visualizar e requerem métodos especiais de fixação e permeabilização. ERK1/2 níveis variam em compartimentos subcelulares, e esta variação pode causar sinais falsos positivos e falsos negativos quando se olha para o lisado celular total. Portanto, um immunoblot usando compartimentos subcellular isolados dá-em uma melhor compreensão da localização ERK1/2.
A versatilidade do método permite modificações do protocolo para investigar os efeitos de outros estimulantes, incluindo outros MDPs ou translocação de outras moléculas de sinalização como STAT3. Recentemente descobertos pequenos humanin, como peptídeos (corsários) são codificados da região de rRNA 16S onde humanin é codificado, e eles têm propriedades semelhantes mas distintas em relação ao HN17. Por exemplo, SHLP2 e SHLP3 ativam ERK1/2 após 8 h embora humanin ativa ERK1/2 dentro de 5 min. Localização subcellular exame de ERK1/2, em resposta a diferentes peptídeos nos dará uma melhor compreensão da biologia destes peptides. Emergentes evidências mostraram que a Localização subcellular das moléculas de sinalização desempenha um papel crucial em seus efeitos a jusante. Por exemplo, STAT3 é tradicionalmente conhecida para ser localizada principalmente no citosol em células de descanso, e então ele translocates até ao núcleo para ativar a expressão gênica em resposta a citocinas18. STAT3 também translocates à mitocôndria e regula o ciclo TCA e de produção de ATP19. Sobre regulamento de autofagia, diferente Localização subcellular de STAT3 modula autofagia em várias maneiras20. Por exemplo, nuclear STAT3 transcricionalmente regula genes relacionados autofagia e atua como um modulador de autofagia. Citoplasmáticos STAT3 constitutivamente inibe a autofagia interagindo com moléculas de sinalização de autofagia. Mitocondrial STAT3 inibe e impede mitophagy suprimindo o estresse oxidativo induzido por autofagia. Portanto, esse método de isolamento do compartimento subcellular é crucial para compreender o papel da outra sinalização moléculas bem como ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Sinalização celular</td><td>9102</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Sinalização celular</td><td>4370</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamina B1</td><td>Sinalização celular</td><td>12586</td><td>Marcador nuclear, diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>sinalização celular</td><td>5174</td><td>Marcador citoplasmático, diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marcador mitocondrial, Diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP conjugado</td><td>Sinalização celular</td><td>7074</td><td>Diluição 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lise e Tampão de Extração</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de Cultura</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptídeo</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm filtro de silagem</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&trade; Coquetel de Inibidor de Protease e Fosfatase (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pilão Moedor de Tecido Conjuntos com Pilões Lisos</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Géis</td> <td>de Proteína Pré-moldadosBIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Módulo Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini Kit de Transferência PVDF</td><td>BIO RAD</td> Clareza <td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Substratos de Blotting Western ECL</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restaurar Tampão</td> <td>de Decapagem Western blotThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

fraccionamento subcelular para activação de erk tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptídeos derivados mitocondrial (MDPs) são uma nova classe de peptídeos que são codificados por frames de leitura abertos pequenos dentro de outros genes conhecidos do genoma mitocondrial. MDPs têm uma grande variedade de efeitos biológicos como protegendo os neurônios da apoptose, melhorando marcadores metabólicos e protegendo as células da quimioterapia. Humanin foi o MDP primeiro a ser descoberto e o peptídeo mais estudado entre a família MDP. Os receptores de membrana e vias de sinalização a jusante de humanin foram cuidadosamente caracterizadas. MDPs adicionais tais como MOTS-c e SHLP1-6 foram descobertos mais recentemente e os mecanismos de sinalização ainda precisa ser elucidado. Aqui nós descrevemos um método de cultura com base de célula para determinar a função destes peptides. Em particular, técnicas de fracionamento celular em combinação com mancha ocidental permitem a determinação quantitativa da ativação e translocação de importante molécula de sinalização. Embora existam outros métodos de fracionamento celular, o descrito aqui é um método fácil e simples. Estes métodos podem ser usados para elucidar ainda mais o mecanismo de ação desses peptídeos e outros agentes terapêuticos.

Usando o procedimento apresentado aqui, tratamos de células HEK293 e SH-SY5Y com 1 μM e 100 μM S14G-humanin, um potente humanin analógico21, respectivamente, em completa mídia para os períodos de tempo indicado (Figura 1A e Figura 1 B). em seguida examinamos a forma fosforilada e total de ERK1/2 em Thr202/Tyr204 de extratos de proteínas totais. S14G-...

Este protocolo descreve como estimulam as células com peptídeos derivados mitocondriais e avaliar a cascata de sinalização e localização de fosfo-proteínas.

Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

O objetivo geral deste experimento é identificar a cascata de sinalização a jusante envolvida em células estimuladas com peptídeos derivados de mitocôndrias. Este método pode responder a perguntas-chave no campo peptídico derivado da mitocôndria, como quais vias de sinalização estão envolvidas e onde isso ocorre. A principal vantagem dessa técnica é que ela é direta e relativamente fácil de executar.Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando examinamos a sinalização ERK mediada por humanos, que nos deu informações limitadas sobre os fatos a jusante. O método Kersher da subescala nos deu uma ideia melhor do papel da sinalização mediada por humanos. No terceiro dia após o plaqueamento e lavagem duas vezes dez elevado ao sexto, células SH-SY5Y ou HEK293 de acordo com o protocolo de texto.Dissolva os peptídeos de humanina S14G em água destilada filtrada de dois mícrons de ponto zero. E reconstituí-los como uma solução estoque de um milimolar. Alíquota do meio pré-aquecido contendo soro ou sem soro em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione a solução de estoque de peptídeo de humanina à temperatura ambiente para fazer uma concentração de trabalho.Substitua imediatamente o meio nas células por seis mililitros da solução peptídica. E incube as células pelo tempo apropriado. Use 10 mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes.Em seguida, raspe as células da placa em cinco mililitros de PBS gelado. E transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos.Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de fracionamento gelado e incube no gelo por 15 minutos. Centrifugue o tubo a 250 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, colete o sobrenadante como a fração citoplasmática e guarde o pellet para a fração nuclear.Centrifugue o sobrenadante para remover detritos celulares e outros contaminantes a 18000 vezes G e quatro graus Celsius por dez minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Esta é a fração de citissolo.Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lavagem gelada e centrifugue a solução a 250 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante e use 100 microlitros de tampão de extração nuclear gelada para ressuspender o pellet. Em seguida, sonicar a amostra no gelo 10 vezes.Centrifugue novamente a amostra. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Para isolar a fração mitocondrial bruta, use 10 mililitros de PBS gelado para lavar as células em cada prato de 10 centímetros.Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS gelado e use um raspador de células para separar as células. Transferir as suspensões celulares para um único tubo cónico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 600 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Aspire o PBS e use um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial gelado para ressuspender o pellet. Em seguida, com um pilão revestido de politetrafluoretileno no gelo, homogeneizar as células com 25 golpes de um homogeneizador de dois mililitros. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga e centrifugar a amostra a 600 vezes G e quatro graus Celsius durante 10 minutos para remover os núcleos e as células intactas.Em seguida, recolher o sobrenadante, transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar a solução a 7000 vezes G e quatro graus Celsius durante 10 minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet com 200 microlitros de tampão de isolamento de mitocôndrias geladas e transfira a solução para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugue o tubo a 7000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Depois de repetir a lavagem, use 15 microlitros de tampão RIPA para ressuspender o pellet e incubar a suspensão no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 16000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o sobrenadante, que é a fração mitocondrial, para um novo tubo.Quantificar e realizar western blotting de acordo com o protocolo de texto. Usando o procedimento demonstrado neste vídeo, as células HEK293 e SH-SY5Y recuaram com um e 100 micromolares S14 G humanina, um potente análogo da humana. E a forma total e fosforilada de ERK12 na teanina 202, tirosina 204 a partir de extratos proteicos totais foram analisadas.Como visto aqui, o tratamento com humanina S14G mostrou um aumento na fosforilação de ERK12 e seu local regulador de teanina-202, tirosina-204. Para entender o alvo da ativação de ERK12 mediada por humanina S14G, foi analisada a localização subcelular de ERK12 total e fosforilada após o tratamento com humanina S14G. Como mostrado nesses western blots, nas células HEK293, o ERK fosforilado aumentou tanto no citoplasma quanto no núcleo, mas não nas mitocôndrias.Nas células SH-SY5Y, no entanto, o ERK fosforilado diminuiu no núcleo do citoplasma e nas mitocôndrias. Sugerindo que a fosforilação de ERK mediada por S14G mediada por humanina pode desempenhar um papel diferente em diferentes tipos de células e diferentes condições. Uma vez dominado, o fracionamento nuclear celular pode ser feito em uma hora e o fracionamento mitocondrial pode ser feito em uma hora e 30 minutos, se for realizado corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo. Após este procedimento, outros métodos, incluindo precipitação co-imune e espectrometria de massa, podem ser realizados para entender os alvos a jusante das moléculas de sinalização.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aprenda o fraccionamento subcelular para estudar a activação de ERK por peptídeos derivados de mitocôndrias em células SH-SY5Y e HEK293. Este método permite analisar a localização de fosfoproteínas e cascatas de sinalização.

Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

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