Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

O objetivo geral deste experimento é identificar a cascata de sinalização a jusante envolvida em células estimuladas com peptídeos derivados de mitocôndrias. Este método pode responder a perguntas-chave no campo peptídico derivado da mitocôndria, como quais vias de sinalização estão envolvidas e onde isso ocorre. A principal vantagem dessa técnica é que ela é direta e relativamente fácil de executar.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando examinamos a sinalização ERK mediada por humanos, que nos deu informações limitadas sobre os fatos a jusante. O método Kersher da subescala nos deu uma ideia melhor do papel da sinalização mediada por humanos. No terceiro dia após o plaqueamento e lavagem duas vezes dez elevado ao sexto, células SH-SY5Y ou HEK293 de acordo com o protocolo de texto.

Dissolva os peptídeos de humanina S14G em água destilada filtrada de dois mícrons de ponto zero. E reconstituí-los como uma solução estoque de um milimolar. Alíquota do meio pré-aquecido contendo soro ou sem soro em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione a solução de estoque de peptídeo de humanina à temperatura ambiente para fazer uma concentração de trabalho.

Substitua imediatamente o meio nas células por seis mililitros da solução peptídica. E incube as células pelo tempo apropriado. Use 10 mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes.

Em seguida, raspe as células da placa em cinco mililitros de PBS gelado. E transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de fracionamento gelado e incube no gelo por 15 minutos. Centrifugue o tubo a 250 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, colete o sobrenadante como a fração citoplasmática e guarde o pellet para a fração nuclear.

Centrifugue o sobrenadante para remover detritos celulares e outros contaminantes a 18000 vezes G e quatro graus Celsius por dez minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Esta é a fração de citissolo.

Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lavagem gelada e centrifugue a solução a 250 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova o sobrenadante e use 100 microlitros de tampão de extração nuclear gelada para ressuspender o pellet. Em seguida, sonicar a amostra no gelo 10 vezes.

Centrifugue novamente a amostra. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Para isolar a fração mitocondrial bruta, use 10 mililitros de PBS gelado para lavar as células em cada prato de 10 centímetros.

Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS gelado e use um raspador de células para separar as células. Transferir as suspensões celulares para um único tubo cónico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 600 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Aspire o PBS e use um mililitro de tampão de isolamento mitocondrial gelado para ressuspender o pellet. Em seguida, com um pilão revestido de politetrafluoretileno no gelo, homogeneizar as células com 25 golpes de um homogeneizador de dois mililitros. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga e centrifugar a amostra a 600 vezes G e quatro graus Celsius durante 10 minutos para remover os núcleos e as células intactas.

Em seguida, recolher o sobrenadante, transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar a solução a 7000 vezes G e quatro graus Celsius durante 10 minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet com 200 microlitros de tampão de isolamento de mitocôndrias geladas e transfira a solução para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugue o tubo a 7000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Depois de repetir a lavagem, use 15 microlitros de tampão RIPA para ressuspender o pellet e incubar a suspensão no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 16000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o sobrenadante, que é a fração mitocondrial, para um novo tubo.

Quantificar e realizar western blotting de acordo com o protocolo de texto. Usando o procedimento demonstrado neste vídeo, as células HEK293 e SH-SY5Y recuaram com um e 100 micromolares S14 G humanina, um potente análogo da humana. E a forma total e fosforilada de ERK12 na teanina 202, tirosina 204 a partir de extratos proteicos totais foram analisadas.

Como visto aqui, o tratamento com humanina S14G mostrou um aumento na fosforilação de ERK12 e seu local regulador de teanina-202, tirosina-204. Para entender o alvo da ativação de ERK12 mediada por humanina S14G, foi analisada a localização subcelular de ERK12 total e fosforilada após o tratamento com humanina S14G. Como mostrado nesses western blots, nas células HEK293, o ERK fosforilado aumentou tanto no citoplasma quanto no núcleo, mas não nas mitocôndrias.

Nas células SH-SY5Y, no entanto, o ERK fosforilado diminuiu no núcleo do citoplasma e nas mitocôndrias. Sugerindo que a fosforilação de ERK mediada por S14G mediada por humanina pode desempenhar um papel diferente em diferentes tipos de células e diferentes condições. Uma vez dominado, o fracionamento nuclear celular pode ser feito em uma hora e o fracionamento mitocondrial pode ser feito em uma hora e 30 minutos, se for realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo. Após este procedimento, outros métodos, incluindo precipitação co-imune e espectrometria de massa, podem ser realizados para entender os alvos a jusante das moléculas de sinalização.