Name: Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a preparar cromatina de qualidade para ChIP a partir de músculo esquelético de camundongo adulto. Este protocolo otimizado supera a resistência física do tecido muscular e facilita o estudo da regulação gênica em fibras musculares.

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Agradecemos a todos os funcionários da facilidade de sequenciamento de alta taxa de transferência IGBMC, um membro do consórcio "França Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e todos os serviços IGBMC gerais em particular os funcionários do centro de animais IGBMC. Este trabalho foi apoiado por concessões do CNRS, o INSERM, o AFM, a Ligue Nationale contre le Cancer, do Estado francês fundo através da ANR no âmbito do programa d'Avenir Investissements rotulados ANR-10-IDEX-0002-02, o Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e a ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sambakana foi suportada pelo Ligue Nationale contre le Cancer e o ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U o Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID é uma 'équipe labellisée' da Ligue Nationale contre le Cancer.

os ratos foram mantidos em conformidade com as diretrizes institucionais em matéria de cuidados e uso de animais de laboratório e em conformidade com as diretrizes nacionais de cuidado Animal (Comissão Europeia a Directiva 86/609/CEE; Francês o decreto 848-87). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética nacional francês.
 1. isolamento de tecido muscular rato <ol><li>sacrifício um adulto 6 a 8 semanas de idade por deslocamento cervical. Sterlise o membro lavando-o com 70% de etanol e dissecar os músculos do membro posterior (gastrocnêmio, tibial Anterior, quadríceps) usando uma tesoura de ponta fina e pinças. 
	Nota: Um rato deve render cerca de 500 mg de tecido.</li>
	<li>Picar os músculos num tubo de ensaio 2 mL contendo 1 mL de tampão de hipotônica gelada para uma preparação homogênea de pequeno (&#60; 2-3 mm 3) peças usando muito bem a tesoura e deixe o tubo tremendo em um agitador de bancada superior a 4 ° C, durante 5-10 min.</li>
</ol> 2. Lise do tecido Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
<ol><li>Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 14 mL e Resuspenda em 5 mL frio hipotônica buffer (EDTA-free inibidor da protease cocktail e PMSF).
	<ol><li>Homogenise tecido do músculo picada usando um solto homogenizacao (20-30 traços dentro 3min) ou um homogeneizador mecânico por 15 a 30 s em tubos de fundo redondo 14 mL. 
		Nota: A eficiência de Lise pode ser avaliada nesta fase, por microscopia de luz, e se necessário, perturbações adicionais podem ser realizadas.</li>
	</ol></li> <li>Transferir o homogeneizado para os tubos de 15 mL e encher o volume de 10 mL com tampão hipotônica frio. Corrigir o homogenate conforme descrito abaixo antes de prosseguir com o próximo mouse.</li>
</ol> 3. Fixação <ol><li>Adicionar formol a concentração final de 1% e agitar durante 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 M em cada tubo de parar a fixação e agitar durante 5-10 min à temperatura ambiente.</li>
</ol> 4. Preparação de núcleos Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
<ol><li>Homogenise a fixo usando lisado um solto homogenizacao (traços de 5-10).
	<ol><li>Transferência para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para obter núcleos e restos celulares.</li>
	</ol></li> <li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado no buffer hipotônica fresco 5ml. Filtre o lisado através de um filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL. Re-filtro filtrado através de um filtro de célula de 40 µm.</li>
	<li>Transferir o filtrado para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 minutos a 4 ° C para obter a pelota nuclear. 
	Nota: Nesta fase, os núcleos podem ser imediatamente sonicated, ou partir congelado como um sedimento seco em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Sonication <ol><li>avaliar o volume da pelota nuclear (cerca de 50 µ l para homogeneização mecânico e homogenizacao) e ressuspender-no buffer sonication até 3 a 4 vezes do volume nuclear embalado e proceda à sonicação durante 10-15 min a 4 ° C, usando um sonicador . 
	Nota: A cromatina pode ser analisada imediatamente, conforme descrito abaixo (6) ou congelada e armazenada a -80 ° C.</li>
</ol> 6. Avaliar o tamanho do fragmento de cromatina seguindo Sonication Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
<ol><li>De-crosslink, tomar 30 µ l de cromatina em um tubo de ensaio de 1,5 mL e adicionar 20 µ l 5 M NaCl. Completar o volume a 500 µ l e incubar a 65 ° C durante a noite.
	<ol><li>No dia seguinte, realizar um tratamento com 1 µ l da protease K (20 mg/mL de caldo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l de EDTA 0,5 M para 1 h, a extração de executar um fenol-clorofórmio clorofórmio/42 ° C. e precipitar o DNA com 1 volume de sódio acetat e (3 M) e 2 volumes de etanol 100% para um h-80 ° c, ou durante a noite em -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>O DNA de pelotas por centrifugação a 13.500 x g, durante 15 min. decantar o sobrenadante e lavar o sedimento completamente com álcool etílico 70% frio e centrifugar novamente por 5 min. decantar o sobrenadante e secar o sedimento.</li>
	<li>Resuspenda o pellet no volume original (30 µ l) de tampão TE. Medir a concentração de DNA em um Espectrofotômetro de absorvância a 260 nm/280 nm. Pipetar 500-1.000 ng de DNA juntamente com uma escada de tamanho de DNA em corredores separados de um gel de agarose 1,5% e executar eletroforese para avaliar o tamanho do fragmento da cromatina. 
	Nota: Tamanho do fragmento deve estar entre 200-500 pares de bases e não deve haver nenhum fragmento detectável de alto peso molecular correspondente à não - ou mal-fragmentado DNA. Se necessário, a solução de cromatina (etapa 5) pode ser re-lisada por mais tempo e então re-analisada conforme descrito acima, até o tamanho ideal é obtido.</li>
</ol> 7. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.
<ol><li>Contas de sepharose bloco a proteína G por alíquotas de 1 mL do chorume em etanol a 50%. Pelota as contas por centrifugacao a 400 x g por 1 min em uma bancada centrífuga e lavagem com 1 mL de 400g de x de centrifugar TE reserva e repita o Wash.
	<ol><li>Após a segunda centrifugação, re-suspender em 1 mL de tampão de diluição de ChIP com 25 µ l de BSA (estoque 20 mg/mL) e 20 µ l do fermento tRNA (estoque 10 mg/mL). Bloquear as contas pelo menos 2 h antes da sua utilização por rotação (40-60 rpm) em 4 ° C.</li>
		<li>Diluir 50 µ g de cromatina (etapa 5) 8 a 10 vezes com tampão de diluição do ChIP. Adicionar 50 µ l de chorume bloqueados do grânulo e incubar durante 2 h (40-60 rpm) de giro a 4 ° C. centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obter previamente limpo da cromatina e transferi-lo para um tubo novo.</li>
	</ol></li> <li>Para a imunoprecipitação, adicionar a quantidade apropriada de anticorpo primário (por exemplo, 1-2 µ g por 10 µ g de cromatina) e incubar durante uma noite com rotação em 4 ° C. 
	Nota: A quantidade ideal de anticorpo pode ser recomendada pelo fornecedor, ou pode ser determinada empiricamente através da realização de ChIP-qPCR com diferentes quantidades de anticorpos até enriquecimento ideal é observado. Também sepharose proteína G pode ser substituída pela proteína um sepharose dependendo do subtipo de anticorpo usado.</li>
	<li>Adicionar as contas bloqueadas no dia seguinte e incubar durante 1 h com rotação (40-60 rpm) em 4 ° C. centrifugar a 400 x g por 20-30 s para granular os grânulos, remover o sobrenadante e começar o ChIP lava.</li>
	<li>ChIP lavagens: executar as lavagens seguintes com os buffers: uma vez com baixa reserva de sal e depois duas vezes com tampão de sal alta, duas vezes com LiCl Buffer e finalmente duas vezes com tampão TE.
	<ol><li>Pelota os grânulos entre cada lavagem por centrifugação a 400 x g, durante 20-30 s em uma centrífuga de bancada e executar cada lavagem durante 10 min com rotação (40-60 rpm) a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Para a eluição, retire a última lavagem e ressuspender os grânulos em tampão de eluição 250 µ l (preparadas) durante 15 minutos à temperatura ambiente e agitando.</li>
	<li>Centrífuga em 400 x g e recolher o eluato num tubo de fresco. Realizar essa etapa duas vezes e, em seguida, de-crosslink o eluído durante a noite com 20 µ l M de NaCl 5 e 1 µ l do RNase A (10 mg/mL), tratar com proteinase K e fenol-clorofórmio/clorofórmio extragir como na etapa 6.</li>
	<li>Resuspenda em 50 µ l de tampão TE e usar alíquotas para ChIP-qPCR conforme protocolos padrão 15, para verificar a qualidade do ChIP.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Aqui nós descrevemos um novo protocolo para a preparação de cromatina de músculos esqueléticos de rato adulto e mostrar que este cromatina é adequada para experimentos de ChIP que detectar a ligação do fator de transcrição e modificações do histone covalente no núcleo da fibra muscular. Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é rompimento de tecido que pode ser executado por homogenizacao ou por cisalhamento mecânico. O corte mecânico é mais rápido e mais reprodutíveis e é, portanto, o método de escolha...

Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) acoplado a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento de alto throughput (ChIP-seq) tornaram-se os métodos de escolha para estudar a transcrição e epigenética regulação da expressão gênica em diversos tecidos e tipos de células1. Esta técnica permite a criação de perfil de todo o genoma de modificações covalentes cromatina, ocupação variante de histona e32,ligação do fator da transcrição.
Enquanto executando o ChIP de células cultivadas está bem estabelecida, ChIP de tecidos de mamíferos permanece mais desafiador. Preparação da cromatina para ChIP envolve várias etapas críticas que precisam ser otimizados para cada tipo de tecidos e células. Cromatina pode ser preparada do lisado celular de células cultivadas ou seguir a purificação de seus núcleos. No caso de tecidos de mamíferos, Lise eficiente, fixação de formaldeído e purificação dos núcleos são críticos para garantir ótima recuperação da cromatina. Além disso, a escolha de se corrigir os núcleos antes ou depois da sua purificação tem de ser determinado experimentalmente. Apesar destes obstáculos, ChIP tem sido realizado com sucesso de tecidos como o fígado, testículo ou cérebro4,5,6. No caso de músculo esquelético, o rompimento de um tecido tão fisicamente resistente, que apresenta um alto teor de proteínas estruturais e isolamento de seus núcleos é particularmente desafiadora. Tendo em conta esta especificidade, protocolos otimizados para outros tecidos não dão resultados satisfatórios para os músculos esqueléticos.
Aqui descrevemos um protocolo para isolar a cromatina ChIP-grau de tecido de músculo esquelético de rato que envolve fisicamente, rompendo o tecido, fixação de formaldeído e então o isolamento dos núcleos e sonication. A eficiência deste método para preparar a cromatina apropriada para ChIP deste tecido foi demonstrada por realização de ChIP-qPCR e ChIP-seq para vários fatores de transcrição, RNA polimerase II e de modificações do histone covalente7.
Esta nova técnica é muito mais rápida do que um protocolo relatado anteriormente8 composto por etapas de digestão tempo colagenase durante esse tempo, mudanças na localização de genômica de factores de transcrição e alterações na expressão do gene podem ter lugar. A rapidez com que os núcleos são isolados e fixa faz com que o método descrito aqui particularmente atraente para preparar a cromatina que capta mais fielmente o estado de ocupação genômica nativo. Além disso, apesar de tem outros métodos de extração de isolamento ou proteínas da cromatina de tecido muscular foram descritas8,9,10 e usado para experiências de ChIP-qPCR genes selecionados, sem ChIP-seq dados tem sido relatados como usá-los. O método relatado aqui é apropriado para transcrição fator e histona modificação ChIP-seq e, portanto, deve ser também apropriado para aplicações de captura do HiC cromatina conformação ou 3 / 4C.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Livre de Cocktail-EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Grânulos de Sepharose</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído EM grau</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Clorofórmio: Álcool isoamílico 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>levedura tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio Azul</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Anticorpo</td><td>Motivo Ativo</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Anticorpo</td><td>Aviva Systems Biology</td> <td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Ultrasonicator Focalizado</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Itens adicionais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesouras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml e 50 ml tubos</td><td></td><td></td><td></td>de falcão</tr><tr><td>14 ml tubos de fundo</td><td></td><td></td><td></td>redondo</tr><tr><td>1,5 ml e 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m e 40 &mu; filtros de células m (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Descreveremos um protocolo eficiente e reproduzível para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto, um tecido resistente fisicamente com um alto teor de proteínas estruturais. Músculos de membros dissecados de ratos adultos fisicamente são rompidos por homogeneização mecânica, ou uma combinação de picagem e douncing, em um buffer hipotônica antes da fixação de formaldeído do lisado celular. Os núcleos fixos são purificados por mais ciclos de homogeneização mecânica ou douncing e filtrações sequenciais para remover os resíduos de célula. Os núcleos purificados podem ser sonicated imediatamente ou posteriormente após congelamento. A cromatina pode ser sonicated com eficiência e é apropriado para experimentos de imunoprecipitação da cromatina, conforme ilustrado pelos perfis obtido por fatores de transcrição, RNA polimerase II e modificações do histone covalente. Os eventos de ligação detectados usando cromatina preparada pelo presente protocolo predominantemente são aqueles que ocorrem no núcleo da fibra muscular apesar da presença de cromatina de outro satélite de fibra-associado e células endoteliais. Este protocolo, portanto, é adaptado para estudar a regulação gênica no músculo esquelético rato adulto.

Para isolar núcleos, realizamos a homogeneização mecânica do tecido muscular dissecado e picada para 15 ou 45 s, 18.000 e 22.000 rpm (ver Tabela de materiais). Em todas as condições, núcleos poderiam separar os restos de tecido, mas o rendimento foi otimizado usando a velocidade mais baixa (figura 1A-B). Núcleos também podem ser preparados por douncing por 3-5 min (figura 1Ae dados não mostrados)...

É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar a cromatina a partir do músculo esquelético de camundongos adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regulação gênica e nas fibras musculares esqueléticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a preparação da cromatina de grau ChIP a partir do músculo esquelético de camundongos.Um tecido fisicamente resistente com alto teor de proteínas estruturais. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando procurávamos caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes à atrofia muscular do uso glicoarticulado, o que requer a identificação do receptor glicoarticulado, locais de ligação ao DNA em fibras musculares esqueléticas de camundongos. Demonstrando o procedimento estará Shilpy Joshi, um pós-doutorado do nosso laboratório.Para iniciar este procedimento, recupere os músculos dos membros posteriores congelados ou recém-dissecados. Em seguida, pique os músculos em um tubo de ensaio de dois mililitros, contendo um mililitro de tampão hipotônico gelado para uma preparação homogênea de pequenos pedaços, usando uma tesoura fina. Depois, deixe o tubo tremendo em um agitador de bancada a quatro graus Celsius por cinco a 10 minutos.Em seguida, transfira o tecido dissecado para um tubo de fundo redondo de 14 mililitros contendo quatro mililitros de tampão hipotônico frio. Homogeneizar o tecido picado, usando um homogeneizador mecânico de tecidos por 15 a 30 segundos. Em seguida, transfira o homogeneizado para um tubo de 15 mililitros.Adicione tampão hipotônico frio para resultar em 10 mililitros da amostra e fixe o homogeneizado antes de prosseguir com o próximo mouse. Neste procedimento, adicione formaldeído à amostra para resultar em 1% de concentração final. Em seguida, agite por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, adicione glicina para resultar em uma concentração final de 0,125 molar em cada tubo para interromper a fixação. E agite por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, homogeneizar o lisado fixo, usando um dounce solto.Em seguida, transfira-o para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 1000 g por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter núcleos e detritos celulares. Após cinco minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão hipotônico fresco. Filtre o lisado através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.Usando uma ponta de pipeta, lave o filtro com um mililitro de tampão hipotônico frio. Em seguida, filtre novamente o filtrado através de um filtro de células de 40 micrômetros. Em seguida, transferir o filtrado para um tubo de 15 mililitros.E centrifugue a 1000 g por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet nuclear. Depois de descartar o sobrenadante, use um mililitro de tampão hipotônico para agrupar os três pellets e transfira para um tubo de 1,5 a dois mililitros. Centrifugar a 1000 g durante cinco minutos.Em seguida, avalie o volume do pellet nuclear em comparação com tubos contendo um volume conhecido de líquido e ressuspenda-o em tampão de sonicação até três a quatro vezes o volume nuclear compactado. Em seguida, sonicar a suspensão por 10 a 15 minutos a quatro graus Celsius, usando um sonicador. Centrifugar a amostra sonicada e transferir o sobrenadante da cromatina para um novo tubo de 1,5 mililitros.Para reticular, pegue 30 microlitros de cromatina em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro e adicione 20 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e 450 microlitros de água. Complete o volume para 500 microlitros e incube a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, realize um tratamento com um microlitro de Proteinase K, 10 microlitros de dois tris molares em pH 6,8 e 10 microlitros de EDTA 0,5 molar por uma hora a 42 graus Celsius.Em seguida, execute uma extração regular de clorofórmio fenol-clorofórmio e precipite o DNA com um volume de acetato de sódio e dois volumes de etanol a 100% por uma hora a 80 graus Celsius negativos ou durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, pulverize o DNA por centrifugação a 13.500 g por 15 minutos. Transvasar o sobrenadante e lavar bem o pellet com etanol a 70% frio e centrifugar novamente durante cinco minutos.Em seguida, decantar o sobrenadante e secar o pellet ao ar. Depois disso, ressuspenda o pellet no volume original de tampão tris HCl EDTA. Meça a concentração de DNA em um espectrofotômetro por absorventes a 260 nanômetros, 280 nanômetros.Posteriormente, pipete 500 a 1000 nanogramas de DNA junto com uma escada do tamanho de DNA em pistas separadas de um gel de 1,5% de agarose. E realizar eletroforese para avaliar o tamanho do fragmento da cromatina. Para otimizar, a homogeneização foi realizada por 15 segundos ou 45 segundos em duas velocidades, 18.000 e 22.000 RPM.Em todas as condições, os núcleos puderam ser separados dos detritos teciduais, mas o rendimento foi ótimo usando velocidade mais baixa. Os núcleos também podem ser preparados por duplicação por três a cinco minutos. Mas a homogeneização mecânica é o método de escolha, pois os rendimentos ideais de núcleos podem ser alcançados em apenas 15 segundos, permitindo um ganho de tempo importante, especialmente se várias amostras tiverem que ser processadas.Usando este protocolo, até 2,7 vezes 10 elevado aos sete núcleos de 500 miligramas de tecido podem ser isolados para gerar 100 microgramas de cromatina. A cromatina preparada dessa maneira fornece resultados limpos e de alta qualidade em experimentos de sequenciamento ChIP. Conforme ilustrado pelos altos níveis de K27 acetilado da histona H3 e RNA polimerase 2 no locus de Desmond expresso no músculo.A especificidade para a fibra muscular é mostrada pelo sinal baixo ou ausente nos loci Pecam1 e Vcam1 que não são expressos no músculo. Ao tentar este procedimento, é importante mergulhar adequadamente a sonda homogeneizadora na amostra para evitar espuma, limpar a sonda entre as amostras e otimizar a fragmentação da cromatina. A cromatina preparada dessa maneira foi usada com sucesso para mapear a ocupação do fator de transcrição em todo o genoma e também deve ser adequada para técnicas de captura de confirmação de cromatina.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da genômica, para explorar a regulação gênica no músculo esquelético de camundongos. O procedimento também pode ser aplicado a músculos de ratos e biópsias de pacientes humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a homogeneização mecânica, seguida pela purificação de núcleos fixados em formaldeído para preparar a cromatina do músculo esquelético para imunoprecipitação.Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído, fenol, clorofórmio e proteinase K pode ser perigoso. Precauções como o uso de luvas e óculos devem ser tomadas. As etapas que envolvem esses reagentes devem ser executadas sob um capuz.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Apresentamos um protocolo baseado em filtração para isolar núcleos de alta qualidade do músculo esquelético do mouse reticulado em que removemos a necessidade de ultracentrifugação, tornando-o facilmente aplicável. Mostramos que a cromatina preparada a partir dos núcleos é adequada para a imunoprecipitação com cromatina e prováveis ​​estudos de sequenciação de imunoprecipitação com cromatina.

Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&amp;RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&amp;Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&amp;Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&amp;Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&#38;Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Aprenda a preparar cromatina de qualidade para ChIP a partir de músculo esquelético de camundongo adulto. Este protocolo otimizado supera a resistência física do tecido muscular e facilita o estudo da regulação gênica em fibras musculares.

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

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