Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato
6 de novembro de 2017
É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.
O objetivo geral deste procedimento é preparar a cromatina a partir do músculo esquelético de camundongos adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regulação gênica e nas fibras musculares esqueléticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a preparação da cromatina de grau ChIP a partir do músculo esquelético de camundongos.
Um tecido fisicamente resistente com alto teor de proteínas estruturais. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando procurávamos caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes à atrofia muscular do uso glicoarticulado, o que requer a identificação do receptor glicoarticulado, locais de ligação ao DNA em fibras musculares esqueléticas de camundongos. Demonstrando o procedimento estará Shilpy Joshi, um pós-doutorado do nosso laboratório.
Para iniciar este procedimento, recupere os músculos dos membros posteriores congelados ou recém-dissecados. Em seguida, pique os músculos em um tubo de ensaio de dois mililitros, contendo um mililitro de tampão hipotônico gelado para uma preparação homogênea de pequenos pedaços, usando uma tesoura fina. Depois, deixe o tubo tremendo em um agitador de bancada a quatro graus Celsius por cinco a 10 minutos.
Em seguida, transfira o tecido dissecado para um tubo de fundo redondo de 14 mililitros contendo quatro mililitros de tampão hipotônico frio. Homogeneizar o tecido picado, usando um homogeneizador mecânico de tecidos por 15 a 30 segundos. Em seguida, transfira o homogeneizado para um tubo de 15 mililitros.
Adicione tampão hipotônico frio para resultar em 10 mililitros da amostra e fixe o homogeneizado antes de prosseguir com o próximo mouse. Neste procedimento, adicione formaldeído à amostra para resultar em 1% de concentração final. Em seguida, agite por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione glicina para resultar em uma concentração final de 0,125 molar em cada tubo para interromper a fixação. E agite por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, homogeneizar o lisado fixo, usando um dounce solto.
Em seguida, transfira-o para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 1000 g por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter núcleos e detritos celulares. Após cinco minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão hipotônico fresco. Filtre o lisado através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.
Usando uma ponta de pipeta, lave o filtro com um mililitro de tampão hipotônico frio. Em seguida, filtre novamente o filtrado através de um filtro de células de 40 micrômetros. Em seguida, transferir o filtrado para um tubo de 15 mililitros.
E centrifugue a 1000 g por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet nuclear. Depois de descartar o sobrenadante, use um mililitro de tampão hipotônico para agrupar os três pellets e transfira para um tubo de 1,5 a dois mililitros. Centrifugar a 1000 g durante cinco minutos.
Em seguida, avalie o volume do pellet nuclear em comparação com tubos contendo um volume conhecido de líquido e ressuspenda-o em tampão de sonicação até três a quatro vezes o volume nuclear compactado. Em seguida, sonicar a suspensão por 10 a 15 minutos a quatro graus Celsius, usando um sonicador. Centrifugar a amostra sonicada e transferir o sobrenadante da cromatina para um novo tubo de 1,5 mililitros.
Para reticular, pegue 30 microlitros de cromatina em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro e adicione 20 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e 450 microlitros de água. Complete o volume para 500 microlitros e incube a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, realize um tratamento com um microlitro de Proteinase K, 10 microlitros de dois tris molares em pH 6,8 e 10 microlitros de EDTA 0,5 molar por uma hora a 42 graus Celsius.
Em seguida, execute uma extração regular de clorofórmio fenol-clorofórmio e precipite o DNA com um volume de acetato de sódio e dois volumes de etanol a 100% por uma hora a 80 graus Celsius negativos ou durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, pulverize o DNA por centrifugação a 13.500 g por 15 minutos. Transvasar o sobrenadante e lavar bem o pellet com etanol a 70% frio e centrifugar novamente durante cinco minutos.
Em seguida, decantar o sobrenadante e secar o pellet ao ar. Depois disso, ressuspenda o pellet no volume original de tampão tris HCl EDTA. Meça a concentração de DNA em um espectrofotômetro por absorventes a 260 nanômetros, 280 nanômetros.
Posteriormente, pipete 500 a 1000 nanogramas de DNA junto com uma escada do tamanho de DNA em pistas separadas de um gel de 1,5% de agarose. E realizar eletroforese para avaliar o tamanho do fragmento da cromatina. Para otimizar, a homogeneização foi realizada por 15 segundos ou 45 segundos em duas velocidades, 18.000 e 22.000 RPM.
Em todas as condições, os núcleos puderam ser separados dos detritos teciduais, mas o rendimento foi ótimo usando velocidade mais baixa. Os núcleos também podem ser preparados por duplicação por três a cinco minutos. Mas a homogeneização mecânica é o método de escolha, pois os rendimentos ideais de núcleos podem ser alcançados em apenas 15 segundos, permitindo um ganho de tempo importante, especialmente se várias amostras tiverem que ser processadas.
Usando este protocolo, até 2,7 vezes 10 elevado aos sete núcleos de 500 miligramas de tecido podem ser isolados para gerar 100 microgramas de cromatina. A cromatina preparada dessa maneira fornece resultados limpos e de alta qualidade em experimentos de sequenciamento ChIP. Conforme ilustrado pelos altos níveis de K27 acetilado da histona H3 e RNA polimerase 2 no locus de Desmond expresso no músculo.
A especificidade para a fibra muscular é mostrada pelo sinal baixo ou ausente nos loci Pecam1 e Vcam1 que não são expressos no músculo. Ao tentar este procedimento, é importante mergulhar adequadamente a sonda homogeneizadora na amostra para evitar espuma, limpar a sonda entre as amostras e otimizar a fragmentação da cromatina. A cromatina preparada dessa maneira foi usada com sucesso para mapear a ocupação do fator de transcrição em todo o genoma e também deve ser adequada para técnicas de captura de confirmação de cromatina.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da genômica, para explorar a regulação gênica no músculo esquelético de camundongos. O procedimento também pode ser aplicado a músculos de ratos e biópsias de pacientes humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a homogeneização mecânica, seguida pela purificação de núcleos fixados em formaldeído para preparar a cromatina do músculo esquelético para imunoprecipitação.
Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído, fenol, clorofórmio e proteinase K pode ser perigoso. Precauções como o uso de luvas e óculos devem ser tomadas. As etapas que envolvem esses reagentes devem ser executadas sob um capuz.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo inovador para o preparo de cromatina a partir do músculo esquelético de camundongos adultos, adaptado especificamente para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por meio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP). O método aborda os desafios impostos pela resistência física e pelo teor de proteínas estruturais do tecido muscular esquelético.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Regulação gênica
- Imunoprecipitação da cromatina
- Biologia do músculo esquelético
Antecedentes
- A preparação da cromatina é fundamental para estudar a regulação gênica.
- O músculo esquelético de camundongo é um tecido complexo com alto teor de proteínas estruturais.
- Compreender os mecanismos moleculares da atrofia muscular é essencial para estratégias terapêuticas.
- A identificação de sítios de ligação ao DNA é necessária para caracterizar a regulação gênica.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para preparar cromatina de qualidade para ChIP a partir de músculo esquelético de camundongo.
- Facilitar o estudo da regulação gênica em fibras musculares.
- Investigar os mecanismos moleculares subjacentes à atrofia muscular.
Métodos Utilizados
- Preparação de cromatina de músculo esquelético de camundongo adulto.
- Aplicação de técnicas de imunoprecipitação de cromatina.
- Caracterização de receptores glico-articulados e sítios de ligação ao DNA.
- Demonstração do procedimento por um pesquisador pós-doutorando.
Resultados Principais
- Preparação bem-sucedida de cromatina de qualidade para ChIP a partir de tecido muscular esquelético resistente.
- Identificação de sítios-chave de ligação ao DNA relevantes para a regulação gênica muscular.
- Compreensão dos mecanismos moleculares da atrofia muscular.
- Validação da eficácia do método para pesquisas futuras.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido aprimora o estudo da regulação gênica no músculo esquelético.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que investigam a biologia muscular.
- Aplicações futuras podem levar a uma melhor compreensão da atrofia muscular e condições relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Preparar cromatina de alta qualidade a partir de tecidos fisicamente resistentes, como o músculo esquelético, continua sendo um gargalo na validação de alvos epigenéticos. Este protocolo permite o isolamento reprodutível de núcleos e a sonicação de cromatina adequada para imunoprecipitação, apoiando a desmistificação mecanicista de fatores de transcrição e modificadores de histonas em modelos de doenças relacionadas ao músculo. Ao fornecer uma abordagem padronizada e escalonável para o preparo de cromatina de qualidade para ChIP, ele aumenta a confiança preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta voltados para a fisiopatologia do músculo esquelético.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da regulação transcricional em fibras musculares esqueléticas para validar alvos envolvidos em vias de atrofia e metabólicas.
- Valor Operacional: Fornece rendimentos consistentes de cromatina a partir de tecido resistente, reduzindo a variabilidade em ensaios de engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz cromatina pronta para ChIP para triagem em alta escala de compostos que afetam reguladores epigenéticos no músculo.
- Valor Operacional: Os passos padronizados de purificação de núcleos e sonicação garantem a reprodutibilidade do ensaio entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o alinhamento de biomarcadores ao mapear modificações de histonas e ocupação de fatores de transcrição em modelos musculares relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite análise longitudinal da cromatina a partir de tecido congelado, apoiando a continuidade pré-clínica e a validação de alvos em diferentes fases do estudo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere no continuum de descoberta ao permitir a preparação da cromatina para validação de alvos, seguida por imunoprecipitação e sequenciamento para orientar a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de moduladores epigenéticos no músculo esquelético.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos regulatórios gênicos em modelos de atrofia muscular e doenças metabólicas.
- Triagem: Fornece um substrato cromatínico padronizado para avaliar os efeitos de compostos sobre alvos epigenéticos.
- Análises: Gera leituras quantitativas de ChIP-seq para comparar a ligação ao alvo em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas epigenéticas da fase inicial à validação pré-clínica por meio de preparação consistente de cromatina.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento de núcleos e preparação de cromatina para programas de epigenética do músculo esquelético.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança na validação de alvos ao reduzir o ruído proveniente da cromatina de células não musculares em amostras de músculo esquelético.
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade por meio da homogeneização mecânica rápida, permitindo o processamento de múltiplas amostras em curtos períodos de tempo.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção em programas de alvos epigenéticos ao fornecer dados confiáveis de cromatina específicos do músculo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis epigenéticos reprodutíveis em tecidos relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em homogeneização de tecidos, isolamento de núcleos e manipulação de cromatina para evitar degradação.
- Depende do acesso a equipamentos de sonicação otimizados para fragmentação de cromatina sem superaquecimento.
- Necessita condições padronizadas de tampão e etapas de filtração para garantir reprodutibilidade entre usuários e locais.
- Deve levar em conta variáveis específicas do tecido, como tipo de fibra e estado de lesão, ao aplicar o protocolo em modelos de doenças.
- As limitações práticas incluem a necessidade de otimização cuidadosa do tempo e da temperatura de sonicação para obter tamanho ideal de fragmento.
