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Advanced Biology

O ensaio tunel

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

The TUNEL Assay

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

91,181 Views

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Uma das marcas da apoptose é a fragmentação do DNA nuclear por núcleos. Essas enzimas são ativadas por caspases, a família de proteínas que executam o programa de morte celular. O ensaio TUNEL é um método que aproveita esse recurso para detectar células apoptóticas. Neste ensaio, uma enzima chamada terminal deoxynucleotidyl transferase catalisa a adição de nucleotídeos dUTP às extremidades livres de DNA fragmentado. Usando dUTPs que são rotulados com etiquetas químicas que podem produzir fluorescência ou cor, as células apoptóticas podem ser identificadas especificamente.

O vídeo de JoVE sobre o ensaio TUNEL começa discutindo como essa técnica pode ser usada para detectar células apoptóticas. Em seguida, passamos por um protocolo geral para a realização de ensaios TUNEL em seções de tecido e visualização dos resultados usando microscopia de fluorescência. Finalmente, várias aplicações do ensaio à pesquisa atual serão abordadas.

Procedure

O ensaio tunel é mais comumente usado para detectar células submetidas à apoptose, que é uma forma de morte celular programada. A apoptose é um importante processo biológico durante o desenvolvimento, e para a manutenção da homeostase tecidual. A coloração tunel permite a visualização e quantificação das células apoptóticas. Isso ajuda os cientistas a testar a eficácia de novos tratamentos para distúrbios nos quais a apoptose é inibida, como no câncer, ou melhorada, como na neurodegeneração.

Este vídeo explicará como o ensaio tunel pode ser usado para rotular células submetidas à apoptose, um protocolo passo-a-passo para a realização deste método em seções de tecido, e como os pesquisadores estão aplicando essa técnica para entender mecanismos de morte celular.

Antes de mergulhar no protocolo do ensaio TUNEL, vamos discutir os princípios por trás dessa técnica.

Uma das muitas características marcantes da apoptose é a fragmentação do DNA. Como ocorre a fragmentação do DNA? A apoptose é realizada por enzimas chamadas caspases presentes no citosol. Seu papel principal é cortar proteínas para desmontar a célula. Além disso, as caspases ativam uma enzima chamada DNase ativada por caspase, ou CAD, desprendendo-a de seu inibidor — ICAD. CAD ativado é uma endonuclease que viaja para o núcleo e corta DNA cromossômico.

O decote do DNA acaba por causar acúmulo de fragmentos de DNA com pontas cortadas, e o ensaio tunel rotula fluorescentemente essas extremidades cortadas de DNA fragmentado, permitindo que os cientistas detectem apoptose. Mas como isso acontece? Para isso você tem que entender a reação tunel. TUNEL significa terminal deoxynucleotidyl transferase-mediado dUTP rotulagem nick-end mediada. Os dois reagentes tunel principais são transferase deoxynucleotidyl terminal, ou TdT, e triphosfato desoxyuridina, ou dUTP, que pode ser rotulado fluorescentemente para facilitar a detecção.

Para entender a reação tunel, vamos voltar para as células apoptóticas com fragmentos de DNA. Estes fragmentos cortados têm grupos de hidroxíl de 3′ livres. Uma vez que você adicione os reagentes TUNEL a uma amostra contendo células apoptóticas, os dUTPs rotulados fluorescentemente se anexam a esses grupos de hidroxílico de 3′ com a ajuda da enzima catalisador TdT. As células manchadas usando este procedimento são chamadas células positivas TUNEL, que podem então ser visualizadas usando microscopia de fluorescência.

Agora que você entende os princípios e conceitos básicos por trás do ensaio TUNEL, vamos delinear um protocolo geral para a realização desta técnica em seções de tecido. Os principais passos do ensaio TUNEL incluem fixação do tecido de interesse, permeabilização do tecido, adição de reagentes TUNEL, interrupção da reação TUNEL e, finalmente, a análise.

Primeiro, o tecido de interesse deve ser fixado para preservar estruturas biológicas. A fixação funciona cruzando proteínas dentro das células. Para o ensaio TUNEL, os tecidos podem ser fixados adicionando-os a uma solução contendo 4% de paraformaldeído por 4-24 horas a 4°C. Após a fixação, criosection o tecido em fatias finas de 10 μm ou menos.

O próximo passo é a permeabilização, que permite que reagentes como a enzima TdT penetrem no núcleo celular. A permeabilização das seções teciduais pode ser realizada adicionando o tecido à solução proteinase K por 5-15 minutos a 37°C. Enxágüe seções de tecido com soro fisiológico tamponado em um agitador orbital por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a permeabilização, a enzima TdT e dUTPs fluorescentes são adicionados às seções teciduais, juntamente com um tampão de rotulagem contendo cobalto que atua como um cofator para a reação TUNEL. Juntas, a mistura de reação TUNEL e a seção de tecido são incubadas por 1-3 horas a 37°C, e protegidas da luz para evitar que a fluorescência desaje.

Após a incubação, o buffer stop é adicionado à seção de tecido para cessar a reação tunel, e após uma breve incubação as seções são lavadas com soro fisiológico tamponado de fosfato. Finalmente, as seções teciduais manchadas usando dUTP marcadas fluorescente são visualizadas por meio de microscopia de fluorescência e avaliadas para localização de células positivas tunel dentro de um determinado tecido. Pode-se quantificar a morte celular simplesmente contando a porcentagem de células positivas tunel em uma determinada seção tecidual.

Agora que você viu como executar o ensaio tunel para detectar células apoptóticas, vamos discutir como este ensaio pode ser usado para responder a perguntas feitas por biólogos celulares.

A morte celular ocorre como uma parte normal do desenvolvimento para a escultura de tecidos e estruturas, e para a eliminação de células desnecessárias. Portanto, cientistas interessados neste fenômeno estudam o efeito da exposição pré-natal a diferentes substâncias na apoptose durante o desenvolvimento. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar o efeito da exposição ao álcool pré-natal no desenvolvimento cerebral. Os resultados da coloração tunel realizada em cérebros fetais revelaram aumento da apoptose em tecidos que foram expostos pré-natal ao álcool, em comparação com os animais de controle.

Os cientistas também usam o ensaio TUNEL para investigar apoptose em resposta à infecção bacteriana. Neste experimento, os cientistas desenvolveram um modelo de pneumonia injetando camundongos com Pseudomonas aeruginosa, que induz inflamação pulmonar. Em seguida, o tecido pulmonar foi removido e a coloração tunel foi realizada para examinar apoptose em resposta à infecção bacteriana. Os resultados mostram que a morte de células apoptóticas aumentou em camundongos expostos às bactérias, em comparação com os animais de controle.

Por fim, a coloração TUNEL pode ser usada em amostras de tumores humanos, a fim de determinar a responsividade do tumor às drogas. Neste exemplo, amostras de tumores foram colhidas de pacientes humanos e ex vivo cultivadas. Em seguida, foram tratados com medicamentos pré-clínicos e avaliados para uma resposta utilizando o ensaio TUNEL. Dados obtidos mostram que o tratamento com uma droga que inibe a proteína de choque térmico 90 aumenta significativamente apoptose no tecido tumoral.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre o uso do ensaio TUNEL para detectar células submetidas à apoptose. Este vídeo revisou os princípios por trás da coloração tunel e um protocolo passo-a-passo para executar o ensaio TUNEL em seções de tecido. Também revisamos como esse método poderia ser aplicado para entender a morte celular programada durante o desenvolvimento e a doença. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

The TUNEL assay is most commonly used to detect cells undergoing apoptosis, which is a form of programmed cell death. Apoptosis is an important biological process during development, and for maintaining tissue homeostasis. TUNEL staining allows for visualization and quantification of apoptotic cells. This helps scientists test efficacy of new treatments for disorders in which apoptosis is either inhibited, like in cancer, or enhanced, as in neurodegeneration.

This video will explain how the TUNEL assay can be used to label cells undergoing apoptosis, a step-by-step protocol for performing this method in tissue sections, and how researchers are applying this technique to understand mechanisms of cell death.

Before delving into the protocol of the TUNEL assay, let’s discuss the principles behind this technique.

One of the many hallmark characteristics of apoptosis is DNA fragmentation. How does DNA fragmentation occur? Apoptosis is carried out by enzymes called caspases present in the cytosol. Their primary role is to cleave proteins in order to dismantle the cell. In addition, caspases activate an enzyme called caspase-activated DNase, or CAD, by detaching it from its inhibitor—ICAD. Activated CAD is an endonuclease that travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA.

Cleavage of DNA ultimately causes accumulation of DNA fragments with nicked ends, and the TUNEL assay fluorescently labels these nicked ends of fragmented DNA, allowing scientists to detect apoptosis. But how does this happen? For that you have to understand the TUNEL reaction. TUNEL stands for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. The two main TUNEL reagents are terminal deoxynucleotidyl transferase, or TdT, and deoxyuridine triphosphate, or dUTP, which may be fluorescently labeled for ease of detection.

In order to understand the TUNEL reaction, let’s go back to the apoptotic cells with DNA fragments. These nicked fragments have free 3′ hydroxyl groups. Once you add the TUNEL reagents to a sample containing apoptotic cells, the fluorescently labeled dUTPs attach to these 3′ hydroxyl groups with the help of the catalyst enzyme TdT. The cells stained using this procedure are called TUNEL positive cells, which can then be visualized using fluorescence microscopy.

Now that you understand the basic principles and concepts behind the TUNEL assay, let’s outline a general protocol for performing this technique in tissue sections. The major steps of the TUNEL assay include fixing the tissue of interest, permeabilization of the tissue, adding TUNEL reagents, stopping the TUNEL reaction, and finally the analysis.

First, the tissue of interest must be fixed in order to preserve biological structures. Fixation works by crosslinking proteins within cells. For the TUNEL assay, tissues can be fixed by adding them to a solution containing 4% paraformaldehyde for 4–24 hours at 4°C. After fixation, cryosection the tissue into thin slices of 10 µm or less.

The next step is permeabilization, which allows for reagents such as the TdT enzyme to penetrate the cell nucleus. Permeabilization of tissue sections can be performed by adding the tissue to proteinase K solution for 5–15 minutes at 37°C. Rinse tissue sections with phosphate buffered saline on an orbital shaker for 15–30 minutes at room temperature.

Following permeabilization, the TdT enzyme and fluorescently labeled dUTPs are added to the tissue sections, along with a labeling buffer containing cobalt that acts as a cofactor for the TUNEL reaction. Together, the TUNEL reaction mixture and the tissue section are incubated for 1–3 hours at 37°C, and protected from light to prevent the fluorescence from fading.

Following incubation, stop buffer is added to the tissue section to cease the TUNEL reaction, and after a short incubation the sections are washed with phosphate buffered saline. Finally, tissue sections stained using fluorescently tagged dUTP are visualized using fluorescence microscopy, and assessed for localization of TUNEL positive cells within a given tissue. One can quantify cell death simply by counting the percentage of TUNEL positive cells in a given tissue section.

Now that you’ve seen how to perform the TUNEL assay to detect apoptotic cells, let’s discuss how this assay can be used to address questions asked by cell biologists.

Cell death occurs as a normal part of development for the sculpting of tissues and structures, and for the elimination of unnecessary cells. Therefore, scientists interested in this phenomenon study the effect of prenatal exposure to different substances on apoptosis during development. Here, scientists were interested in examining the effect of prenatal alcohol exposure on brain development. The results of TUNEL staining performed on fetal brains revealed increased apoptosis in tissues that were prenatally exposed to alcohol, as compared to control animals.

Scientists also use the TUNEL assay to investigate apoptosis in response to bacterial infection. In this experiment, scientists developed a model of pneumonia by injecting mice with Pseudomonas aeruginosa, which induces lung inflammation. Then, lung tissue was removed and TUNEL staining was performed to examine apoptosis in response to the bacterial infection. Results show that apoptotic cell death increased in mice exposed to the bacteria, as compared to control animals.

Lastly, TUNEL staining can be used on human tumor samples, in order to determine tumor responsiveness to drugs. In this example, tumor samples were harvested from human patients and cultured ex vivo. Next, they were treated with pre-clinical drugs and assessed for a response using the TUNEL assay. Data obtained show that treatment with a drug that inhibits heat shock protein 90 significantly increases apoptosis in tumor tissue.

You’ve just watched JoVE’s video on using the TUNEL assay to detect cells undergoing apoptosis. This video reviewed the principles behind TUNEL staining, and a step-by-step protocol to perform the TUNEL assay on tissue sections. We also reviewed how this method could be applied to understand programmed cell death during development and disease. As always, thanks for watching!

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